藥物遺傳毒性和致癌性現(xiàn)狀和動向

藥物遺傳毒性和致癌性研究現(xiàn)狀和動向2022/12/251常艷國家上海新藥安全評價研究中心藥物遺傳毒性評價的指導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗方法的研究2藥物致癌性評價的概要3傳統(tǒng)和替代致癌試驗的研究434主要內(nèi)容

遺傳毒性評價的指導(dǎo)原則

SFDA-中國國家食品藥品監(jiān)督管理局

ICH-人用藥物注冊技術(shù)規(guī)定國際協(xié)調(diào)組織

OECD-經(jīng)濟合作發(fā)展組織

EMEA-歐洲藥品評價局

USFDA-美國藥監(jiān)局

USEPA-美國環(huán)境保護署

MHLW-日本厚生勞動省其他世界性的政府法規(guī)部門

藥物研發(fā)監(jiān)管的主要藥政實體OECD、EPA可供參考的遺傳毒性指導(dǎo)原則

遺傳毒性試驗的指導(dǎo)原則

SFDA

體外：2項試驗

?細(xì)菌回復(fù)突變試驗（Ames）——Required

?染色體畸變試驗（CA）

OR

?小鼠淋巴瘤細(xì)胞tk基因突變試驗（MLA）

體內(nèi)：1項試驗

?微核試驗（MN）——Required

《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》ZHGPT2-1,2007等同于ICHS2BICH

S2A+S2BFDA-RedbookRedbook2000:IV.C.1Short-TermTestsforGeneticToxicityJuly2007Redbook2000:IV.C.1.aBacterialReverseMutationTest

Redbook2000:IV.C.1.bInvitroMammalianChromosomalAberrationTestRedbook2000:IV.C.1.cMouseLymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssayRedbook2000:IV.C.1.dMammalianErythrocyteMicronucleusTestFDA-CDERFDA-CDEREMEAEMEAEMEAStep2Step1Step3Step42006200720082009~20112006.06ICHSC同意意啟啟動動修修訂訂工工作作2006.10ICHEWG討論論籌籌劃劃修修訂訂方方法法2007.05對修修訂訂內(nèi)內(nèi)容容達達成成一一致致意意見見，，開開始始起起草草S2(R1)2007.10完成成起起草草的的S2(R1)2008.02簽署署S2(R1)，完完成成step22008.06審議議意意見見，，回回答答公公共共注注釋釋2008.11未按按期期開開會會（（未未獲獲得得彗彗星星試試驗驗數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)））2009.06體內(nèi)內(nèi)試試驗驗單單次次和和重重復(fù)復(fù)給給藥藥方方案案都都接接受受FDA對取消消體體外外細(xì)細(xì)胞胞試試驗驗或或降降低低最最高高濃濃度度和和細(xì)細(xì)胞胞毒毒性性提出出異異議議2011.11S2(R1)正式式頒頒布布遺傳傳毒毒性性標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)組組合合試試驗驗的的修修訂訂2009~2011ICHS2A+S2B=S2(R1)S2R1的修修訂訂宗宗旨旨：：減少少體體外外哺哺乳乳動動物物細(xì)細(xì)胞胞試試驗驗的的假假陽陽性性動物物試試驗驗3R原則則（（替替代代、、減減少少和和優(yōu)優(yōu)化化））Invivo：建議議整整合合入入重重復(fù)復(fù)給給藥藥毒毒性性實實驗驗中中每次次實實驗驗不不必必使使用用平平行行的的陽陽性性對對照照應(yīng)用用流流式式細(xì)細(xì)胞胞儀儀檢檢測測ICHS2A+S2B=S2(R1)遺傳傳毒毒性性標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)組組合合試試驗驗的的修修訂訂S2BS2R1選擇一選擇二細(xì)菌回復(fù)突變試驗（withrepeat）細(xì)菌回復(fù)突變試驗（Norepeat）細(xì)菌回復(fù)突變試驗（Norepeat）體外哺乳動物細(xì)胞試驗：CA/MLA10mMCellgrowth:50%/RTG:80%體外哺乳動物細(xì)胞試驗：CA/MLA/MN

1mM

≤50%/

≥80%無體外哺乳動物細(xì)胞試驗體內(nèi)微核試驗（單獨一項且是急性毒性試驗）體內(nèi)微核試驗（整合至一般毒理試驗中）一項體內(nèi)微核試驗+一項體內(nèi)不同檢測終點/組織試驗（肝Comet試驗）（整合至一般毒理試驗中或聯(lián)合在同一個試驗）整合合試試驗驗的的最最高高劑劑量量和和暴暴露露ICHS2(R1)修訂訂小小結(jié)結(jié)S2A和S2B整合合入入一一個個指指導(dǎo)導(dǎo)原原則則中中；；提供供可可選選擇擇的的遺遺傳傳毒毒性性試試驗驗組組合合；；減少少體外外哺哺乳乳動動物物細(xì)細(xì)胞胞試試驗驗不不相相關(guān)關(guān)的的陽陽性性；；體內(nèi)遺傳毒性性試驗可以整合入重復(fù)給藥毒毒性試驗中；；無需每一項體體內(nèi)試驗都設(shè)設(shè)同步的陽性性對照；體外細(xì)菌突變變試驗無需重重復(fù)試驗。ICHS2(R1)PfuhlerS.etal.2009藥物遺傳毒性性評價的指導(dǎo)導(dǎo)原則1遺傳毒性試驗驗方法的研究究2藥物致癌性評評價的概要3傳統(tǒng)和替代致致癌試驗的研研究434主要內(nèi)容遺傳毒性傳統(tǒng)統(tǒng)試驗方法31細(xì)菌回復(fù)突變變試驗（Ames試驗）人工誘變的突突變株在組/色氨酸操縱子子中有一個突突變，突變的的菌株必須依依賴外源性組組/色氨酸才能生生長，而在無無組/色氨酸的選擇擇性培養(yǎng)基上上不能存活，，致突變物可可使其基因發(fā)發(fā)生回復(fù)突變變，使它在缺缺乏組/色氨酸的培養(yǎng)養(yǎng)基上也能生生長。野生型（原養(yǎng)型）突變型（缺陷型）Ames試驗測試系統(tǒng)：細(xì)細(xì)菌鼠傷寒沙門氏氏菌：組氨酸酸營養(yǎng)缺陷型型埃希氏大腸桿桿菌：色氨酸酸營養(yǎng)缺陷型型菌株特性鑒定定菌株組/色氨酸突變?nèi)笔Э蓹z測的突變類型修復(fù)LPSVIT質(zhì)粒TA1535G46urvB-rfa-

bio----堿基置換TA1537C3076urvB-rfa-bio----移碼TA97D6610urvB-rfa-bio-pKM101移碼TA98D3052urvB-rfa-bio-pKM101移碼TA100G46urvB-rfa-bio-pKM101堿基置換TA102G428urvB+rfa-bio-pKM101堿基置換WP2uvrAtrypEuvrA---pKM101堿基置換Ames試驗驗Ames試驗驗濃度設(shè)置陰性對照組/溶劑對照組；；受試物至少五五個劑量組；；陽性對照組；；Ames試驗驗方法平板摻入法：：-0.1mL受試菌液；-0.1mL受試物、溶劑劑對照或陽性性物溶液；-0.5mL磷酸鈉緩沖液液/S9混合液；-2.0mL融溶的頂層瓊瓊脂（0.6％瓊脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素和0.05mML－組胺酸））混合后，鋪于于底層瓊脂上上，室溫凝固固。Ames試驗驗預(yù)培養(yǎng)法-將下列物質(zhì)在在冰浴上混合合：0.5mLS9混合液或0.5mL磷酸緩沖液0.1mL過夜培養(yǎng)菌液液（大約10^8菌量））0.01mL受試物溶液（（或?qū)φ?，溶溶劑和陽性對對照物溶液）?將該混合液在在37℃下培養(yǎng)20分鐘（水浴中中）-然后加入2mL含有0.6％瓊脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素和0.05mML－組胺酸的融溶溶頂層培養(yǎng)基基，鋪至基礎(chǔ)礎(chǔ)培養(yǎng)瓊脂表表面（V-B培養(yǎng)基E），在室溫下凝固。。Ames試驗驗代謝活化系統(tǒng)統(tǒng)大鼠肝S9混合液S9制備方法：取取5只雄性大鼠，，處死大鼠的的前5天單次腹腔注注射給予500mg/kg的Aroclor1254。處死，放血血，無菌取肝肝組織，勻漿漿，經(jīng)9000g離心10分鐘后的上清清液部分為S9。將S9分裝成2-4mL/管，冷凍保存存在-70℃～-85℃。Ames試驗驗結(jié)果觀察和判判定計數(shù)突變菌落落數(shù)－致突變變性觀察背景菌斑斑－毒性判斷是否具有有致突變性Ames試驗假設(shè)的證明無組氨酸的VB平皿7個克隆來自0對照平皿劃線7個克隆來自1000ug/皿處理組劃線全部生長:克隆為組氨酸酸回復(fù)突變克隆隆無生長：克隆不是組氨酸回復(fù)突變克隆隆Ames試驗—案例1測試系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞胞：CHL,CHO人外周血淋巴巴細(xì)胞細(xì)胞核型遺傳毒性試驗驗的技術(shù)要點點32染色體畸變試試驗(CA)劑量設(shè)置陰性對照組/溶劑對照組；；受試物至少三三個劑量組；；陽性對照組；；染色體畸變試試驗方法細(xì)胞復(fù)蘇、培培養(yǎng)；受試物處理；；加入秋水仙素素，使細(xì)胞停停止于分裂中中期；收獲細(xì)胞，滴滴片空氣干燥，染染色染色體畸變試試驗包括代謝活化化和非代謝活活化條件在處理后6和24小時收獲細(xì)胞胞代謝活化條件件下，受試物物處理時間為為3小時染色體畸變試試驗處理條件讀片分析有絲分裂指數(shù)數(shù)－毒性染色體結(jié)構(gòu)畸畸變?nèi)旧w數(shù)目畸畸變?nèi)旧w畸變試試驗試驗系統(tǒng)小鼠淋巴瘤L5178YTK+/-細(xì)胞既能夠檢測點點突變，也能能夠檢測出大大的染色體損損傷自發(fā)突變率高高，需要定期期清除自發(fā)突突變。33小鼠淋巴瘤細(xì)細(xì)胞試驗（MLA）遺傳毒性傳統(tǒng)統(tǒng)試驗方法ThymidineKinase(TK):233aminoacidsCodedbytheautosomaltkgenetkgene:Situatedatthedistalendoftheq-armofchromosome11(mouse)orchromosome17(human)Sizeoftkgene:11kbwith5intronstklocusmutation:tk+tk-allelecausedbyTGtransversionatposition489小鼠淋巴瘤細(xì)細(xì)胞試驗（MLA）基本原理Targetcell：MouselymphomaL5178Ytk+/-3.7.2Ccellline(D.Clive&P.Voytek.MutatRes,1977)L5178Y-3cellline（tk+/+）EMStreatmentL5178Y-3.7.2cellline（tk+/-）L5178Y-3.7cellline（tk-/-）Spontaneousreversemutation(selectedbyTHMGmedium)MLA基本原理TK+/-cells(TFTsensitive&THMGresistant)TK-/-cells(TFTresistant&THMGsensitive)MutagentreatmentTK+/-cells(L5178Y,TK6,WTK1)treatedbychemicals,andthenselectedbyTFT(trifluorothymidine)Thegrowingcolony——TFTresistant(TK-/-)mutantMLA基本原原理培養(yǎng)基基不含馬馬血清清的RPMI1640培養(yǎng)基基含10%馬血清清的RPMI1640培養(yǎng)基基含20%馬血清清的RPMI1640培養(yǎng)基基小鼠淋淋巴瘤瘤細(xì)胞胞試驗驗（MLA）受試物物處理理時間間TK基因突突變試試驗中中，要要使用用短時時處理理(3～4小時)方式。。但張張立實實和Honma等的研研究表表明，，使用用長時時間(24或48小時)處理可可顯著著提高高MLA對某些些染色色體斷斷裂劑劑和紡紡錘體體毒物物的檢檢出率率。小鼠淋淋巴瘤瘤細(xì)胞胞試驗驗（MLA）突變選選擇劑劑在MLA中最初初使用用5-溴脫氧氧尿苷苷（BUdR）作為為突變變選擇擇劑，，后來來改用用三氟胸胸苷（TFT）。二二者均均為胸胸苷類類似物物，都都能被被胸苷苷激酶酶磷酸酸化，，其磷磷酸化化產(chǎn)物物摻入入DNA可導(dǎo)致致tk+/-細(xì)胞死死亡。。但TFT的作用用比BUdR更迅速速，TFT在一個個細(xì)胞胞世代代即可可阻滯滯tk+/-細(xì)胞，，因此此TFT選擇平平板背背景清清晰；；而BUdR則需要要經(jīng)歷歷數(shù)個個細(xì)胞胞世代代才能能完全全阻滯滯tk+/-細(xì)胞，，故可可產(chǎn)生生分散散的微微小集集落（（microcolony），形成成特征性性的背景景陰影（（backgroundhaze）。因此此，現(xiàn)TFT已基本取取代了BUdR，成為TK基因突變變試驗的的常規(guī)選選擇劑。。小鼠淋巴巴瘤細(xì)胞胞試驗（（MLA）基本方法法軟瓊脂平平皿法（（softagarmethod）在美國國使用較較多。在在平皿中中生長的的抗性突突變細(xì)胞胞集落呈呈近似正正態(tài)分布布，根據(jù)據(jù)實驗結(jié)結(jié)果可計計算克隆隆效率（（cloningefficiency，CE）和突變變率（mutationfrequency，MF）等指標(biāo)標(biāo)。微孔平板板（microwellmethod）（即即96孔培養(yǎng)板板）法在在歐洲使使用較多多。在微微孔中生生長的抗抗性突變變細(xì)胞集集落呈Poisson分布，根根據(jù)實驗驗結(jié)果可可計算接接種效率率（platingefficiency，PE）和突變變率等指指標(biāo)。小鼠淋巴巴瘤細(xì)胞胞試驗（（MLA）CellsExpression(2d)Chemicaltreatment(3hor24h)PlatingforPE0PlatingforPE2PlatingforTFTrIncubation(12d)ColonycountingandcalculationIncubation(12d)小鼠淋巴巴瘤細(xì)胞胞試驗（（MLA）突變集落落在TK基因突變變試驗中中，經(jīng)過過TFT選擇后長長出的抗抗性細(xì)胞胞集落（（即tk-/-突變體））可分為為兩種類類型，即即大集落落（λ集落）和和小集落落（σ集落）。。微孔平板板法：大大集落≥≥微孔直直徑的1/4小集落＜＜微孔直直徑的1/4軟瓊脂平平皿法：：大集落落直徑≥≥0.6mm小集落直直徑＜0.6mm大集落呈呈彌散性性生長，，其密度度低；小小集落呈呈集中性性生長，，其密度度高。小鼠淋巴巴瘤細(xì)胞胞試驗（（MLA）一般認(rèn)為為大、小小集落突突變體是是由于基基因損傷傷的范圍圍和程度度不同所所致。大集落突變體的的基因損損傷多僅僅局限于于tk位點（即即小范圍圍的點突變）；而小集落突變體是是由較大范范圍的染色體改改變（染色體體斷裂、、缺失、、重組或或分離異異常等））所致。。這是TK基因突變變試驗?zāi)苣軌驒z出出基因突突變和染染色體畸畸變兩類類終點，，并能在在一定程程度上對對二者加以以區(qū)分的的重要機機理。但但關(guān)于兩兩類集落落產(chǎn)生的的確切機機制及其其意義，，還有待待進一步的研研究。小鼠淋巴巴瘤細(xì)胞胞試驗（（MLA）小鼠淋巴巴瘤細(xì)胞胞試驗（（MLA）試驗結(jié)果果的判定定各處理組組的MF值呈濃度依賴賴性升高高，判定為為陽性；；MF值≥陰性對對照值+126，判定為陽陽性。（（微孔法法中的GEF=99+27=126）陽性對照照參考值值其一，陽陽性對照照組總誘誘導(dǎo)率IMF至少≥300××10-6，其中小小克隆IMF至少≥120××10-6其二，小小克隆IMF至少≥150××10-6滿足上述述標(biāo)準(zhǔn)之之一，并并且陽性性對照相相對總生生長率（RTG）≥10%結(jié)果評判判原標(biāo)準(zhǔn)組組合中唯唯一一項項體內(nèi)試試驗采用大鼠鼠或小鼠鼠（6～10周）分析骨髓髓中嗜多多染紅細(xì)細(xì)胞中的的微核，，嗜多染染紅細(xì)胞胞是紅細(xì)細(xì)胞成熟熟的一個個階段，，主核已已排出，，容易觀觀察微核核遺傳毒性性試驗的的技術(shù)要要點34體內(nèi)微核核試驗微核形成成體內(nèi)微核核試驗劑量設(shè)置置陰性對照照組/溶劑對照照組；受試物至至少三個個劑量組組；陽性對照照組；（S2R1建建議無需需每次試試驗均設(shè)設(shè)陽性對對照）體內(nèi)微核核試驗試驗方法法給藥－臨臨床擬用用途徑；；預(yù)試驗中中測定時時相點，，確定正正式試驗驗的采樣樣時間；；收集骨髓髓細(xì)胞，，離心，，涂片，，干燥，，固定，，染色體內(nèi)微核核試驗讀片計數(shù)PCE/NCE的比例－－反映毒毒性計數(shù)含微微核PCE的細(xì)胞百百分率；；體內(nèi)微核核試驗S2R1推薦的的試驗方方法測試系統(tǒng)統(tǒng)哺乳動物物細(xì)胞：：CHL,CHO,V79胞質(zhì)分裂裂組織劑劑——松胞素B（Cyt-B）通過阻止止微絲聚聚合而破破壞胞質(zhì)質(zhì)分裂所所需的微微絲環(huán)，，從而達達到阻滯滯胞漿分分裂又不不影響胞胞核分裂裂的目的的。體外雙核核微核濃度設(shè)置置陰性對照照組/溶劑對照照組；受試物至至少三個個濃度組組陽性對照照組；體外雙核核微核試試驗方法細(xì)胞復(fù)蘇蘇、培養(yǎng)養(yǎng)；受試物處處理；收獲細(xì)胞胞，滴片片空氣干燥燥，染色色(+CytB)(+CytB)體外雙核核微核試試驗讀片分析析胞漿分裂裂阻斷增增值指數(shù)數(shù)（CBPI）－細(xì)胞毒毒性雙核微核核率（1000～2000個雙核））體外雙核核微核試試驗給藥染毒毒采集血樣樣（～100l）－80℃至少固定定3d離心(300g,10min,4℃)buffer洗脫孵育標(biāo)記記FCM檢測4℃,30minRT/37℃,30minS2R1推薦的的試驗方方法FCM體內(nèi)微核核自動化化檢測FCM體體內(nèi)微核核自動化化檢測甲醇（99.8%）－80℃至少固定定3dAnti-CD71-FITCAnti-CD61-PEPIRNase生物標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品—伯氏瘧原原蟲感染染的紅細(xì)細(xì)胞模仿仿MN調(diào)節(jié)PMT電壓調(diào)節(jié)補償償血樣固定定標(biāo)記染色色質(zhì)控FCM體體內(nèi)微核核自動化化檢測圖1利用CD71-(-)樣品和瘧瘧原蟲生生物標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品建立立FCM檢測小鼠鼠外周血血MN的模板。。ABCDFCM與常規(guī)顯顯微鏡檢檢MN結(jié)果相關(guān)關(guān)性良好好，同時時獲得3個指標(biāo)：：%RET、%MN-RET和%MN-NCE；染色體斷斷裂劑和和非整倍倍體誘導(dǎo)導(dǎo)劑都能能檢測出出來；重復(fù)性好好，同樣樣的受試試物劑量量在本實實驗室和和其他已已知報道道的實驗驗室結(jié)果果相當(dāng)；；排除除一一些些假假陽陽性性因因素素的的干干擾擾:使用用RNase，排排除除聚集集RNA的干干擾擾；；使用用CD61抗體體，，排排除除血小小板板的干干擾擾；；使用用CD71抗體體特特異異標(biāo)標(biāo)記記RET，排排除除常常規(guī)規(guī)Giemsa同染染的的嗜堿堿性性小小體體等干干擾擾。。三色色FCM自動動化化MN檢測測系系統(tǒng)統(tǒng)符符合合IWGT的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)FCM體體內(nèi)內(nèi)微微核核自自動動化化檢檢測測基本本滿滿足足分分子子生生物物學(xué)學(xué)和和組組合合化化學(xué)學(xué)的的大大量量候候選選化化合合物物的的毒毒性性篩篩選選快速速、、高高通通量量靈敏敏、、客客觀觀機制制研研究究無種種屬屬選選擇擇性性三色色FCMvs顯微微鏡鏡檢檢既可可以以檢檢出出染染色色體體斷斷裂裂劑劑，，也也可可以以檢檢出出非非整整倍倍體體誘誘導(dǎo)導(dǎo)劑劑；；研究究量量效效關(guān)關(guān)系系和和毒毒性性閾閾值值。。嚙齒齒類類骨骨髓髓和和外外周周血血；；其其他他骨骨髓髓樣樣品品不不易易獲獲取取且且脾脾臟臟亦亦有有消消除除MN-RBC作用用的的物物種種的的MN檢測測（（狗狗、、靈靈長長類類等等））FCM亦能能得得出出MN大小小和和分分布布的的資資料料，，即即PI相關(guān)關(guān)的的熒熒光光數(shù)數(shù)值值的的大大小小（（如如DNA含量量））FCM體體內(nèi)內(nèi)微微核核自自動動化化檢檢測測S2R1推推薦薦的的試試驗驗方方法法體內(nèi)內(nèi)Comet試驗驗體內(nèi)內(nèi)Comet試試驗驗遺傳傳毒毒性性新新方方法法的的研研究究體內(nèi)內(nèi)Pig-a基基因因突突變變試試驗驗Pig-a是N——乙酰酰葡葡萄萄糖糖胺胺轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶復(fù)復(fù)合合體體催催化化亞亞基基的的編編碼碼基基因因，，N——乙酰酰葡葡萄萄糖糖胺胺轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶催催化化細(xì)細(xì)胞胞表表面面磷磷脂脂酰酰肌肌醇醇聚聚糖糖（（glycosylphosphatidylinositol,GPI）錨錨的的早早期期合合成成，，GPI錨可可將將一一些些特特殊殊的的蛋蛋白白（（如如CD55、CD48等））連連接接到到細(xì)細(xì)胞胞表表面面。。pig-a突變變導(dǎo)導(dǎo)致致細(xì)細(xì)胞胞表表面面GPI錨蛋蛋白白缺缺陷陷。。在在與與GPI錨合合成成有有關(guān)關(guān)的的基基因因中中，，只只有有pig-a位于于X染色色體體上上，，其其他他基基因因都都位位于于常常染染色色體體上上，，故故GPI錨缺缺陷陷表表型型幾幾乎乎等等同同于于pig-a突變變。?；颈驹砝眢w內(nèi)內(nèi)Pig-a基基因因突突變變試試驗驗體內(nèi)內(nèi)Pig-a基基因因突突變變試試驗驗體內(nèi)內(nèi)Pig-a基基因因突突變變試試驗驗藥物物遺遺傳傳毒毒性性評評價價的的指指導(dǎo)導(dǎo)原原則則1遺傳傳毒毒性性試試驗驗方方法法的的研研究究2藥物物致致癌癌性性評評價價的的概概要要3傳統(tǒng)統(tǒng)和和替替代代致致癌癌試試驗驗的的研研究究434主要要內(nèi)內(nèi)容容藥物物致致癌癌性性評評價價的的概概要要藥物物致致癌癌性性試試驗驗的的指指導(dǎo)導(dǎo)原原則則2.ICH指導(dǎo)導(dǎo)原原則則-S1A：藥藥物物致致癌癌試試驗驗的的必必要要性性-S1B：藥藥物物致致癌癌試試驗驗-S1C：藥藥物物只只要要試試驗驗的的劑劑量量選選擇擇-S1C(R)：藥藥物物致致癌癌試試驗驗劑劑量量選選擇擇的的附附件件1.SFDA指導(dǎo)導(dǎo)原原則則（（國國食食藥藥監(jiān)監(jiān)注注[2010]129號））-《《藥物物致致癌癌試試驗驗必必要要性性的的技技術(shù)術(shù)指指導(dǎo)導(dǎo)原原則則》<Technicalguidanceontheneedforcarcinogenicitystudiesforpharmaceuticals>（等同同于ICHS1A）藥物致致癌性性評價價的概概要致癌性性試驗驗指南南藥物致致癌性性評價價的概概要ICHS1A和SFDA指導(dǎo)原原則致癌試試驗要要求-持續(xù)使使用6個月以以上的的藥物物或頻頻繁、、周期期性、、間歇歇性使使用的的藥物物；-如果有有致癌癌傾向向，一一些短短期使使用藥藥物也也要做做致癌癌試驗驗，-某些劑劑型或或輸藥藥系統(tǒng)統(tǒng)會導(dǎo)導(dǎo)致體體內(nèi)藥藥物長長期暴暴露的的時間窗窗要求求-批準(zhǔn)上上市之之前前要做做致癌癌試驗驗；-一些特特殊關(guān)關(guān)注的的群體體（如如嬰幼幼兒））則需需要在在批準(zhǔn)準(zhǔn)（IV期臨床床）前前做-用于嚴(yán)嚴(yán)重甚甚至威威脅生生命的的疾病病的藥藥物可可以在在臨床床批準(zhǔn)準(zhǔn)（IV期臨床床）后做（（沒滿滿意的的可替替代療療法；；特定定人群群如腫腫瘤病病人較較短的的生存存期；；視適應(yīng)應(yīng)癥不不同等等情況況而定定）藥物致致癌性性評價價的概概要以下情情況不不需要要致癌癌試驗驗-明確的的基因因型致致癌物物-假定此此類藥藥物具具有跨跨種屬屬致癌癌性-經(jīng)眼睛睛用藥藥和皮皮膚用用藥-藥物無無明顯顯的結(jié)結(jié)構(gòu)警警示和和全身身暴露露-藥物經(jīng)經(jīng)過鹽鹽、酸酸或某某些治治療性性基因因改變變-改變之之前的的試驗驗數(shù)據(jù)據(jù)已存存在-改變后后的PK、PD和毒性性沒有有明顯顯改變變-用于治治療危危及生生命的的疾病病或患患者存存活期期較短短（＜2-3年）生物制制劑（（蛋白白療法法）通通常不不要求求致癌癌試驗驗—casebycase（ICHS6）ICHS1A和SFDA指導(dǎo)原原則遺傳毒毒性和和致癌癌性的的相關(guān)關(guān)性基因型型與非非基因因型致致癌物物的致致癌性性-Ames陽性的的致突突變劑劑中，，80%具有致致癌性性-由2年動物物致癌癌試驗驗證實實呈陽陽性的的致癌癌物中中，50%具有遺遺傳毒毒性Correlationisnotperfect!2.藥物體體外遺遺傳毒毒性試試驗的的陽性性率偏偏高(Snyderetal.––MutatRes.2001,488:151-69)-25%上市藥物物具有遺遺傳毒性性結(jié)果-在體外染染色體損損傷試驗驗中證實實陽性的的藥物，，在致癌癌試驗中中大部分分呈陰性性-在體外染染色體損損傷試驗驗中，高高于治療療濃度的的藥物呈呈陽性，，通常與與細(xì)胞毒毒性有關(guān)關(guān)3.藥物的遺遺傳毒性性和致癌癌性不完完全相符符的其他他原因-體內(nèi)組織織修復(fù)功功能-適應(yīng)性反反應(yīng)-遺傳多態(tài)態(tài)性-器官及系系統(tǒng)之間間相互作作用等因因素遺傳毒性性和致癌癌性的相相關(guān)性藥物遺傳傳毒性評評價的指指導(dǎo)原則則1遺傳毒性性試驗方方法的研研究2藥物致癌癌性評價價的概要要3傳統(tǒng)和替替代致癌癌性試驗驗的研究究434主要內(nèi)容容致癌性試試驗研究究先導(dǎo)物研研發(fā)靶點篩選選候選物篩篩選I期臨床III期臨床II期臨床IV期臨床傳統(tǒng)兩年年嚙齒類類動物致致癌試驗驗-起始于上上世紀(jì)60年代，首首先用于于檢測工工業(yè)化學(xué)學(xué)物質(zhì)的的致癌性性-現(xiàn)用于檢檢測大多多數(shù)慢性性藥物的的致癌性性非傳統(tǒng)嚙嚙齒類動動物致癌癌試驗–轉(zhuǎn)基因動動物-1997年開始用用于檢測測新藥的的致癌性性（ICHS1B）-目前尚未未用于首首要和工工業(yè)化合合物的致致癌性檢檢測GLP致癌性研研究大鼠小鼠傳統(tǒng)兩年年致癌性性試驗嚙齒類每每個品系系都有其其病變背背景并容容易自發(fā)發(fā)腫瘤，，因此背背景數(shù)據(jù)據(jù)和經(jīng)驗驗非常重重要。大鼠-因為SD大鼠的死死亡率高高，所以以每組動動物數(shù)量量要多（（70只/性別/組）-Wistar和F344大鼠存活活率高些些，但F344漸漸不受受歡迎-Wistar大鼠用的的越來越越多，50只/性別/組小鼠-CD-1和B3C6F1在兩年致致癌性試試驗中較較常用種屬和品品系的選選擇傳統(tǒng)兩年年致癌性性試驗1個溶劑對對照組，，3個給藥組組至少50只/性別/組，可考考慮增加加（如：：70只/性別/組）-中期處死死-毒代樣品品采集-其他血樣樣采集-兩年存活活率低（終身試試驗）計計劃給藥藥104周理想情況況下，在在計劃處處死時能能有25只/性別/組以計劃用用于臨床床的給藥藥方式給給藥；環(huán)環(huán)境化學(xué)學(xué)品、人人用食品品添加劑劑或動物飼料補補充劑等等加入飲飲食中。。組數(shù)和每每組動物物數(shù)傳統(tǒng)兩年年致癌性性試驗104周大鼠口口服給藥藥致癌實實驗*若賦賦形劑不不常用，，可增加加一個對對照組；；因為有中中期剖檢檢和毒代代用動物物數(shù)量增增加Note：根據(jù)ICH指導(dǎo)原則則，對于于長期用用藥，6個月毒理理試驗加加一個兩兩年致癌癌性試驗足夠了了，無需需12個月的毒毒理試驗驗。同時時，需要要用主實實驗的動動物或獨獨立的TK組動物進進行TK實驗進行行評估。?；镜膶崒嶒炘O(shè)計計組別劑量（mg/kg）動物中期剖檢毒代1對照組*064M/64F10M/10F4M/4F2低劑量組X64M/64F10M/10F4M/4F3中劑量組Y64M/64F10M/10F4M/4F4高劑量組Z64M/64F10M/10F4M/4F傳統(tǒng)兩年年致癌性性試驗“最高劑量量或最大大耐受劑劑量用來來預(yù)測在在致癌性性試驗過過程中會會產(chǎn)生的的最低毒毒性作用用”-ICHS1C(R2)在最高推推薦人用用劑量時時，嚙齒齒類與人人類血清清AUC（無毒藥藥物）的的暴露比比大于25:1吸收飽和和—最大暴露露限制劑量量藥理學(xué)學(xué)—鎮(zhèn)靜，食欲不不振，血壓過過低，影響實實驗數(shù)據(jù)的癲癲癇如果以下情況況發(fā)生，采用用限制劑量（（藥物）：1500mg/kg-人用劑量<500mg/d；無遺傳毒性性；暴露水平平高于最高推推薦人用劑量量的10倍最大可行劑量量-飼料量的5%；最大灌胃量量；局部耐受受性高劑量的選擇擇傳統(tǒng)兩年致癌癌性試驗展示不同劑量量組藥物代謝謝動力學(xué)、藥藥理學(xué)、毒理理和致癌性范范圍—各組間暴露不不同很重要展示不產(chǎn)生毒毒性或未出現(xiàn)現(xiàn)藥物相關(guān)腫腫瘤的劑量水水平（定義閾閾值）通常使用給藥藥劑量或人類類暴露的幾何何或線性倍數(shù)數(shù)通常低劑量接接近臨床暴露露水平低劑量和中劑劑量的選擇傳統(tǒng)兩年致癌癌性試驗對于藥品，F(xiàn)DA的CAC特別提出了一一套評估方案案，包括給藥原理和實驗設(shè)計客戶必須提交交與實驗計劃劃給藥途徑一一致的預(yù)試驗結(jié)果，此外還需提提交遺傳毒理理學(xué)數(shù)據(jù)，人人類給藥和暴暴露劑量，蛋蛋白結(jié)合信息息，人體和動動物中代謝物物的數(shù)據(jù)在試驗開始前前，無任何其其他機構(gòu)定期期審查方案如果FDA與客戶意見一一致或客戶同同意接受美國國FDA的建議，無論論研究結(jié)果如如何，F(xiàn)DA都認(rèn)為劑量的的選擇適當(dāng)美國FDA致癌評估委員員會（CAC）傳統(tǒng)兩年致癌癌性試驗毒理學(xué)監(jiān)測-攝食量-體重-臨床癥狀-六個月后進行行觸診腫塊，，一般每周一一次，但可以以低于此頻率率。每周觸診診可以對腫瘤的的發(fā)病提供更更好的評估對瀕死的動物物實行安樂死死，早期處死死要比晚期死死亡更有價值值預(yù)先設(shè)定好安安樂死標(biāo)準(zhǔn)將將加速決策進進程活體數(shù)據(jù)采集集傳統(tǒng)兩年致癌癌性試驗每個實驗中藥藥物的暴露情情況都必須進進行評估在實驗中第6-12個月對暴露情況評評估一次就足足夠了通常取3-4個時間點，每個劑量組組每個時間點點取3-4只動物進行如果用主實驗驗的動物，每每只大鼠取一一個樣品；對對于小鼠用衛(wèi)衛(wèi)星動物組收集和分析對對照組的樣品品期望有獨立的的毒代動力學(xué)學(xué)報告毒代代動動力力學(xué)學(xué)傳統(tǒng)統(tǒng)兩兩年年致致癌癌性性試試驗驗醫(yī)藥藥品品通通常常不不進進行行臨臨床床病病理理的的檢檢驗驗，，除除非非有有項項目目特特殊殊要要求求（（STP,inpress2010）實驗驗終終期期進進行行臨臨床床病病理理檢檢測測沒沒有有價價值值，，而而中中期期處處死死時時進進行行卻卻很很有有價價值值如果果在在實實驗驗早早期期沒沒有有將將臨臨床床病病理理檢檢查查定定義義好好，，在在15個月內(nèi)也也可以考考慮進行行特定的的檢查血涂片和和骨髓涂涂片是否否要進行行常規(guī)采采集？-可以作為為保險措措施-通常不進進行-根據(jù)情況況而定臨床病理理學(xué)傳統(tǒng)兩年年致癌性性試驗在全面評評價潛在在致癌性性研究時時統(tǒng)計學(xué)學(xué)是一個個重要的的工具控制假陽陽性錯誤誤-對罕見腫腫瘤P<0.05-對常見腫腫瘤P<0.01專題負(fù)責(zé)責(zé)人必須須監(jiān)測活活體階段段所有初初步假設(shè)設(shè)的統(tǒng)計計因素，，并減少少偏離對死亡率率、腫塊塊、大體體和組織織病理學(xué)學(xué)數(shù)據(jù)的的評估是是十分復(fù)復(fù)雜的*來自活體階階段人員以以及病理專專家的數(shù)據(jù)據(jù)要準(zhǔn)確完完整-足夠的死亡亡率（到80~90周時尚有50%）-早期處死瀕瀕死動物以以保存組織織-跟蹤活體階階段表明腫腫瘤-確定可能的的死亡原因因*見指導(dǎo)原原則《藥物慢性嚙嚙齒類致癌癌試驗的設(shè)設(shè)計，分析析和闡釋中中的統(tǒng)計學(xué)學(xué)》,FDACDER,2001統(tǒng)計分析應(yīng)應(yīng)考慮的因因素傳統(tǒng)兩年致致癌性試驗驗每層架子上上的各組動動物數(shù)目相相等定期在房間間內(nèi)交替架架子，以減減少視網(wǎng)膜膜退變在非工作時時間，采用用低光照以以減少視網(wǎng)網(wǎng)膜退變給藥順序：：對照組，，低劑量組組，中劑量量組，高劑劑量組；避免交叉污污染以同樣順序序來采集毒毒代樣品高標(biāo)準(zhǔn)的動動物管理是是至關(guān)重要要的保持同樣的的飼料/墊料來源，，密切監(jiān)測測成分/污染物的變變化活體期間動動物的飼養(yǎng)養(yǎng)與管理傳統(tǒng)兩年致致癌性試驗驗如果死亡率率很高，可可能一個劑劑量組全部部早期處死死更合適FDA在通訊中提提到：-在第100周以前，幸幸存動物數(shù)數(shù)降至15時，可考慮慮處死該給給藥組或該該性別所有動物-在某些方案案中，當(dāng)幸幸存動物數(shù)數(shù)降至20時，停止對對高劑量組組該性別動動物的給藥；當(dāng)幸幸存動物降降至15時，處死高高劑量組受受影響的性性別的所有有動物-如果對照組組的幸存動動物數(shù)下降降至20或更少時，，處死所有有劑量組中中受影響的性別的所所有動物-在100周以后，如如果高劑量量組的幸存存動物降至至15時，處死所所有劑量組組中受影響的性別別的所有動動物-早期處死一一個劑量組組不會實驗驗無效劑量組的提提前終止傳統(tǒng)兩年致致癌性試驗驗早期處死與與早期死亡亡-所有組織采采集-早期處死動動物比發(fā)現(xiàn)現(xiàn)死亡動物物更有價值值大鼠品系的的選擇會影影響動物的的壽命和到到計劃處死死時存活的的比例-Wistar大鼠存活率率比SD大鼠高腫塊跟蹤-跟蹤活體階階段的每一一個腫塊-與解剖結(jié)果果的關(guān)聯(lián)-通過顯微評評價來跟蹤蹤解剖時發(fā)發(fā)現(xiàn)的腫塊塊（Peto試驗要求））解剖傳統(tǒng)兩年致致癌性試驗驗檢查查方方案案中中各各組組所所有有動動物物的的所所有有組組織織和和腫腫塊塊跟蹤蹤解解剖剖中中發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的的所所有有腫腫塊塊的的顯顯微微診診斷斷盡可可能能將將大大體體觀觀察察與與顯顯微微觀觀察察結(jié)結(jié)果果關(guān)關(guān)聯(lián)聯(lián)起起來來；；但但是是“大大體體觀觀察察與與顯顯微微觀觀察察沒沒有有關(guān)關(guān)聯(lián)聯(lián)””也是是可可接接受受的的，，不不是是每每個個大大體體觀觀察察都都有有相相關(guān)關(guān)聯(lián)聯(lián)的的顯顯微微觀觀察察，，重重要要的的是是你你所所觀觀察察到到的的。。如果果可可行行的的話話，，確確認(rèn)認(rèn)腫腫瘤瘤的的原原發(fā)發(fā)部部位位將腫腫瘤瘤歸歸類類為為““致致命命””與與““非非致致命命””：：-有沒沒有有可可能能是是腫腫瘤瘤促促成成的的動動物物提提前前死死亡亡或或死死亡亡-要求求專專業(yè)業(yè)判判斷斷-要求求做做Peto試驗驗-計劃劃處處死死的的動動物物不不需需要要記錄錄計計劃劃處處死死前前解解剖剖的的動動物物死死亡亡或或瀕瀕死死的的原原因因顯微微評評價價傳統(tǒng)統(tǒng)兩兩年年致致癌癌性性試試驗驗致癌癌性性實實驗驗是是評評價價化化合合物物在在動動物物體體內(nèi)內(nèi)潛潛在在致致癌癌性性的的特特定定的的非非臨臨床床安安全全性性評評價價，，旨旨在在增增進進人人類類的的潛潛在在致致癌癌風(fēng)風(fēng)險險評評價價致癌癌性性試試驗驗開開展展時時間間取取決決于于藥藥物物的的類類型型和和關(guān)關(guān)注注程程度度-通常常在在臨臨床床試試驗驗第第二二，，三三階階段段進進行行，，很很少少在在第第IV階段段（（上上市市后后））進進行行-通常常104周的的生生物物評評價價采采用用大大鼠鼠或或小小鼠鼠進進行行-使用用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因動動物物或或敏敏感感的的體體外外試試驗驗來來推推進進致致癌癌性性試試驗驗一些些藥藥物物可可能能不不需需要要進進行行致致癌癌性性試試驗驗-細(xì)胞胞毒毒性性抗抗癌癌藥藥物物一一般般不不需需要要進進行行致致癌癌性性試試驗驗-生物物技技術(shù)術(shù)藥藥物物也也可可除除外外（（ICHS6）專題題負(fù)負(fù)責(zé)責(zé)人人、、毒毒理理人人員員和和統(tǒng)統(tǒng)計計人人員員作作為為一一個個團團隊隊，，共共同同設(shè)設(shè)計計、、執(zhí)執(zhí)行行和和評評估估-選擇擇種種屬屬應(yīng)應(yīng)考考慮慮藥藥代代、、毒毒代代情情況況-實驗驗中中每每組組必必須須有有足足夠夠的的動動物物，，試試驗驗設(shè)設(shè)計計或或執(zhí)執(zhí)行行使使偏偏離離最最小小化化-劑量量選選擇擇是是關(guān)關(guān)鍵鍵，，必必須須顯顯示示暴暴露露范范圍圍，，從從推推薦薦人人用用劑劑量量到到MTD或最最大大可可行行劑劑量量-活體體階階段段，，死死亡亡、、解解剖剖和和顯顯微微數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)必必須須銜銜接接-對數(shù)據(jù)全全面評價價的統(tǒng)計計方法必必須適當(dāng)當(dāng)總結(jié)替代致癌癌性試驗驗ICHS1B潛在致癌癌性研究究的指南南1997年：1個兩年性性致癌試試驗+1個替代模模型的體體內(nèi)試驗驗Trp53+/-（應(yīng)用于于遺傳毒毒性的藥藥物）rasH2（應(yīng)用于于遺傳毒毒性和非非遺傳毒毒性的藥藥物）Tg.AC（局部采采用，許許多陽性性結(jié)果，，遺傳不不穩(wěn)定））XPA-/-和XPA-/-xp53+/-新生鼠開始啟動動（Ito模型）p53+/-轉(zhuǎn)基因小小鼠替代致癌癌性試驗驗應(yīng)用替代代模型的的原因減少動物物使用并并降低費費用兩年致癌癌試驗的的問題被被廣泛認(rèn)認(rèn)知—肝細(xì)胞腫腫瘤；許許多發(fā)現(xiàn)現(xiàn)與人不不相關(guān)提供有助助于風(fēng)險險評估的的其他信信息如有時間間要求，，可以縮縮短至9個月可以延長長試驗直直至III期