基因工程的基本操作程序最終課件

1-2：基因工程的基本操作程序?qū)ｎ}1：基因工程1-2：基因工程的基本操作程序?qū)ｎ}1：基因工程原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列：啟動子、一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷，基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄——啟動子終止子一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷，基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄終止——終止子原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下2真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子

外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)非編碼區(qū)能編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：

外顯子：①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列：啟動子、終止子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶內(nèi)含子3原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是間隔的、_____的都4基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因基因工程基本操作的步驟

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。二、獲取目的基因的常用方法有哪些?（一）從基因文庫中獲?。ǘ├肞CR技術(shù)擴(kuò)增（三）人工合成一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因基因工程基本操作6（一）從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。

1、分類

基因文庫（genelibrary）基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）基因組文庫:

包含了一種生物所有的基因的基因文庫部分基因文庫:

包含了一種生物的一部分基因的基因文庫（一）從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因

部分基因組文庫cDNA(互補(bǔ)DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)DNA片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫如cDNA文庫(cDNAlibrary)基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA部分基因組文庫cDNA(互補(bǔ)DNA)：如cDNA文庫cDNA文庫和基因組文庫的對比cDNA文庫和基因組文庫的對比2.基因文庫的構(gòu)建方法1.從生物中直接獲取2.人工合成（真核生物）(1)反轉(zhuǎn)錄法(2)化學(xué)合成法：根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：鳥槍法，多用于原核生物2.基因文庫的構(gòu)建方法1.從生物中直接獲取2.人工合成(1.直接分離基因——鳥槍法（散彈射擊法）運載體供體細(xì)胞中DNA許多DNA片段載入導(dǎo)入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀目的基因分離外源DNA

擴(kuò)增

該法最大的缺點是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。用限制酶切斷成許多片段。1.直接分離基因——鳥槍法（散彈射擊法）運載體供體細(xì)胞中DN11目的基因的mRNA單鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA（即目的基因／雙鏈cDNA）DNA聚合酶(1)反轉(zhuǎn)錄法蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測化學(xué)合成推測2.人工合成基因法(2)化學(xué)合成法：根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法合成的基因中均無內(nèi)含子和啟動子雜交雙鏈（RNA-DNA)核酸酶H目的基因的mRNA單鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNADNA聚合酶上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性強(qiáng)僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能

基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。3、基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息如已知目的基因序列時2、人工合成：基因比較小，核苷酸序列已知DNA合成儀3、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。已知目的基因序列時2、人工合成：基因比較小，核苷酸序列已知D循環(huán)變性退火延伸循環(huán)變性退火延伸①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________前提條件

_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d、循環(huán)⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板b、1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

——基因工程的核心1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一2、

基因表達(dá)載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點目的基因：外源DNA分子的有效片段啟動子：RNA聚合酶識別和結(jié)合部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子：提供轉(zhuǎn)錄終止信號標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因復(fù)制原點：DNA復(fù)制的固定起始點2、基因表達(dá)載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端復(fù)制原點+啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切21①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DN22三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（二）方法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：將目的基因?qū)雽⒛康?31、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物24③過程：④優(yōu)點:比較經(jīng)濟(jì)和有效③過程：④優(yōu)點:比較經(jīng)濟(jì)和有效25（2）基因槍法（3）花粉管通道法（2）基因槍法2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞①方法：顯微注射法

②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物胚胎早期培養(yǎng)2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷?73、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①原核生物特點：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：感受態(tài)細(xì)胞法（Ca2+處理法）

用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞28四、目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功四、目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的歸納步驟歸納步驟31DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究DNA分子雜交示意圖采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物4、個體生物學(xué)水平鑒定2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA4、個體生物學(xué)水平鑒定2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3歸納步驟歸納步驟34歸納:基因工程的基本操作程序1、獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成2、構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、感受態(tài)細(xì)胞法4、目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：個體水平的鑒定歸納:基因工程的基本操作程序1、獲取目的基因35練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）aa練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

作探針進(jìn)行分子雜交檢測，又要用

方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量答案：（1）aa（2）基因槍法（花粉管通道法）（3）植物組織培養(yǎng)（1分）脫分化（去分化）再分化（4）耐鹽基因（目的基因）一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）答案：（1）aa（2）基因槍法（花粉管三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞----農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞----39三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植新性狀動物三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿40三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞（細(xì)胞通透性增大）一定溫度感受態(tài)細(xì)胞吸收重組DNA分子目的基因隨受體細(xì)胞繁殖而復(fù)制三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿41四、目的基因的檢測與鑒定檢測—鑒定——①檢測目的基因是否整合到受體生物的染色體DNA上②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交（DNA與DNA）分子雜交(DNA與RNA)（注意與上不同之處）抗原—抗體雜交(蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì))四、目的基因的檢測與鑒定檢測—鑒定——①檢測目的基因是否整合421．基因工程的正確操作步驟是(

)①使目的基因與載體相結(jié)合②將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞③驗證目的基因的表達(dá)是否符合特定性狀要求④提取目的基因A．③②④①B．②④①③C．④①②③ D．③④①②C1．基因工程的正確操作步驟是()C432．下列獲取目的基因的方法中需要模板的是(

)

①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因③反轉(zhuǎn)錄法④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成DNAA．①②③④ B．①②③C．②③④ D．②③D2．下列獲取目的基因的方法中需要模板的是()D443．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)歷下述30多次循環(huán)：95℃下使模板DNA變性、解鏈→55℃下復(fù)性(引物與DNA模板鏈結(jié)合)→72℃下引物鏈延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關(guān)PCR過程的敘述中不正確的是(

)A．變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現(xiàn)B．復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對原則完成C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D．PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需酶的最適溫度較高C3．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技454．(2011年重慶高二檢測)下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的相關(guān)敘述，不正確的是(

)A．需要限制酶和DNA連接酶B．必須在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行C．抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因D．啟動子位于目的基因的首端B4．(2011年重慶高二檢測)下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的相關(guān)46我國中科院上海生化所合成了一種具有鎮(zhèn)痛作用而又不會像嗎啡那樣使病人上癮的藥物——腦啡肽多糖(類似于人體中的糖蛋白)。在人體細(xì)胞中糖蛋白必須經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的進(jìn)一步加工才能形成。如果要采用基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)讓微生物來生產(chǎn)腦啡肽多糖，應(yīng)該用下列哪種微生物作受體細(xì)胞(

)A．大腸桿菌 B．酵母菌C．T4噬菌體 D．大腸桿菌質(zhì)粒B我國中科院上海生化所合成了一種具有鎮(zhèn)痛作用而又不會像嗎啡那樣471-2：基因工程的基本操作程序?qū)ｎ}1：基因工程1-2：基因工程的基本操作程序?qū)ｎ}1：基因工程原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列：啟動子、一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷，基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄——啟動子終止子一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷，基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄終止——終止子原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下49真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子

外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)非編碼區(qū)能編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：

外顯子：①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列：啟動子、終止子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶內(nèi)含子50原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是間隔的、_____的都51基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因基因工程基本操作的步驟

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。二、獲取目的基因的常用方法有哪些?（一）從基因文庫中獲取（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（三）人工合成一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因基因工程基本操作53（一）從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。

1、分類

基因文庫（genelibrary）基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）基因組文庫:

包含了一種生物所有的基因的基因文庫部分基因文庫:

包含了一種生物的一部分基因的基因文庫（一）從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因

部分基因組文庫cDNA(互補(bǔ)DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)DNA片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫如cDNA文庫(cDNAlibrary)基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA部分基因組文庫cDNA(互補(bǔ)DNA)：如cDNA文庫cDNA文庫和基因組文庫的對比cDNA文庫和基因組文庫的對比2.基因文庫的構(gòu)建方法1.從生物中直接獲取2.人工合成（真核生物）(1)反轉(zhuǎn)錄法(2)化學(xué)合成法：根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：鳥槍法，多用于原核生物2.基因文庫的構(gòu)建方法1.從生物中直接獲取2.人工合成(1.直接分離基因——鳥槍法（散彈射擊法）運載體供體細(xì)胞中DNA許多DNA片段載入導(dǎo)入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀目的基因分離外源DNA

擴(kuò)增

該法最大的缺點是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。用限制酶切斷成許多片段。1.直接分離基因——鳥槍法（散彈射擊法）運載體供體細(xì)胞中DN58目的基因的mRNA單鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA（即目的基因／雙鏈cDNA）DNA聚合酶(1)反轉(zhuǎn)錄法蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測化學(xué)合成推測2.人工合成基因法(2)化學(xué)合成法：根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法合成的基因中均無內(nèi)含子和啟動子雜交雙鏈（RNA-DNA)核酸酶H目的基因的mRNA單鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNADNA聚合酶上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性強(qiáng)僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能

基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。3、基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息如已知目的基因序列時2、人工合成：基因比較小，核苷酸序列已知DNA合成儀3、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。已知目的基因序列時2、人工合成：基因比較小，核苷酸序列已知D循環(huán)變性退火延伸循環(huán)變性退火延伸①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________前提條件

_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d、循環(huán)⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板b、1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

——基因工程的核心1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一2、

基因表達(dá)載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點目的基因：外源DNA分子的有效片段啟動子：RNA聚合酶識別和結(jié)合部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子：提供轉(zhuǎn)錄終止信號標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因復(fù)制原點：DNA復(fù)制的固定起始點2、基因表達(dá)載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端復(fù)制原點+啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切68①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DN69三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（二）方法三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：將目的基因?qū)雽⒛康?01、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物71③過程：④優(yōu)點:比較經(jīng)濟(jì)和有效③過程：④優(yōu)點:比較經(jīng)濟(jì)和有效72（2）基因槍法（3）花粉管通道法（2）基因槍法2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞①方法：顯微注射法

②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物胚胎早期培養(yǎng)2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷?43、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①原核生物特點：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：感受態(tài)細(xì)胞法（Ca2+處理法）

用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞75四、目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功四、目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的歸納步驟歸納步驟78DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究DNA分子雜交示意圖采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物4、個體生物學(xué)水平鑒定2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA4、個體生物學(xué)水平鑒定2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3歸納步驟歸納步驟81歸納:基因工程的基本操作程序1、獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成2、構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、感受態(tài)細(xì)胞法4、目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：個體水平的鑒定歸納:基因工程的基本操作程序1、獲取目的基因82練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）aa練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

作探針進(jìn)行分子雜交檢測，又要用

方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量答案：（1）aa（2）基因槍法（花粉管通道法）（3）植物組織培養(yǎng)（1分）脫分化（去分化）再分化（4）耐鹽基因（目的基因）一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）答案：（1）aa（2）基因槍法（花粉管三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞----農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基