2019年遺傳實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)一、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1、減數(shù)分裂的觀察2、果蠅唾液腺染色體的觀察3、花粉母細(xì)胞涂抹制片4、分離規(guī)律5、等位基因分離的驗(yàn)證6、獨(dú)立分配規(guī)律7、基因的連鎖與交換8、有絲分裂9、石蠟切片技術(shù)10、染色體數(shù)目變異的誘發(fā)及鑒定11、顯微攝影技術(shù)12、植物染色體組型分析13、 細(xì)胞核內(nèi)DNA的鑒定14、 高等植物核DNA的簡(jiǎn)易快速提取15、 外源DNA的花粉管道導(dǎo)入技術(shù)16、 大腸桿菌E.COliDH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化二、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)一減數(shù)分裂的觀察一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察并熟悉減數(shù)分裂的全過(guò)程，以及各個(gè)時(shí)期染色體的行為和變化，為學(xué)習(xí)遺傳學(xué)基本規(guī)律奠定基礎(chǔ)。二、 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明減數(shù)分裂是在性母細(xì)胞成熟時(shí)，配子形成過(guò)程中所發(fā)生的一種特殊的有絲分裂。在性母細(xì)胞形成過(guò)程中，先由有性組織（如花藥、胚珠）中的某些細(xì)胞分化為孢母細(xì)胞（ 2n）,以后進(jìn)一步由這些孢母細(xì)胞進(jìn)行兩次連續(xù)的分裂，而染色體只分裂一次，結(jié)果產(chǎn)生四個(gè)染色體數(shù)目減半的大（小）?孢子（n）。這些孢子進(jìn)一步發(fā)育為雌（雄）配子，通過(guò)雌雄配子的受精結(jié)合，新個(gè)體的染色體又恢復(fù)到與親本相同的數(shù)目，從而保證了親代和子代間染色體數(shù)目的恒定性。減數(shù)分裂各時(shí)期的主要特點(diǎn)如下：第一次分裂前期I這一時(shí)期較長(zhǎng)，變化也較復(fù)雜，一般又分為五個(gè)時(shí)期。、?細(xì)線期：這是減數(shù)分裂開(kāi)始時(shí)期，染色體細(xì)長(zhǎng)如線，首尾不分，繞作一團(tuán)，核仁明顯，電子顯微鏡下觀察，數(shù)目成雙。、?偶線期：由于螺旋化，染色體開(kāi)始變短、變粗，同源染色體配對(duì)，出現(xiàn)聯(lián)會(huì)，呈二價(jià)體狀態(tài)是這一時(shí)期的主要特征。、?粗線期：配對(duì)后的染色體逐漸縮短變粗，由于各染色體是由已復(fù)制的兩條染色單體通過(guò)著絲粒連接起來(lái)，故每一配對(duì)的染色體中就含有四條染色單體，又稱四合體。、雙線期：四合體繼續(xù)縮短變粗，同源染色體雖因非姊妹染色單體相互排斥而分開(kāi)，但由于非姊妹染色單體之間發(fā)生交換，而在同源染色體的一定區(qū)段出現(xiàn)交叉結(jié)。、?終變期：染色體變得更短更粗，交叉結(jié)向端部移動(dòng)（端化） ，核仁、核膜開(kāi)始消失，染色體分散在整個(gè)核內(nèi)，此時(shí)觀察染色體最為清楚，便于計(jì)數(shù)。中期I核仁、？核膜消失，染色體排列在赤道板上，成對(duì)染色體的著絲粒轉(zhuǎn)向兩極，紡錘絲出現(xiàn)。后期I同源染色體由紡錘絲牽引著絲粒， ？向兩極移動(dòng)，由于各染色體的著絲粒尚未分裂，每一極只分到每對(duì)同源染色體中的一個(gè)，故兩個(gè)子細(xì)胞將只有半數(shù)的染色體，從而實(shí)現(xiàn)了染色體數(shù)目的減半（2n^n）。末期I染色體移到兩極后，？松開(kāi)變細(xì)，形成子核，細(xì)胞質(zhì)分裂，在中央由紡錘絲形成細(xì)胞板，形成二分體。第二次分裂前期n染色體又開(kāi)始明顯縮短，？二分染色體的兩個(gè)染色單體相互散開(kāi)，但仍和著絲粒連在一起，沒(méi)有分開(kāi)。中期n每個(gè)二分染色體又整齊地排列在各個(gè)分裂細(xì)胞的赤道板上。后期n每個(gè)二分染色體的著絲?？v裂為二，姊妹染色單體分別移向兩極。末期n拉向兩極的染色單體形成新的細(xì)胞核， ？同時(shí)細(xì)胞質(zhì)又分為兩部分。這樣經(jīng)過(guò)兩次分裂，形成四個(gè)子細(xì)胞，又叫四分體或四分孢子，每個(gè)孢子內(nèi)只含有最初細(xì)胞的半數(shù)染色體，以后就開(kāi)始了配子體的發(fā)育。三、 ？實(shí)驗(yàn)材料用具、材料玉米（2n=20）、普通小麥（2n=42）、水稻（2n=24）、黑麥（2n=14）、蠶豆（2n=12）花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂各時(shí)期的永久制片。、用具顯微鏡、二甲苯、擦鏡紙等。四、 實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)前述減數(shù)分裂各時(shí)期的特點(diǎn)，在顯微鏡下，先低倍后高倍尋找花粉母細(xì)胞分裂相，仔細(xì)觀察，并分析確定時(shí)期，最后按顯微鏡下觀察的實(shí)際情況繪圖。五、 作業(yè)繪出減數(shù)分裂各時(shí)期的圖象。實(shí)驗(yàn)二果蠅唾液腺染色體的觀察一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)解剖果蠅三齡幼蟲(chóng)的唾液腺及唾液腺染色體的制片方法，觀察果蠅唾液腺染色體。二、 實(shí)驗(yàn)原理果蠅的唾液腺位于幼蟲(chóng)前端的食道兩側(cè)和神經(jīng)球附近 （圖2-1）。剖取果蠅唾液腺細(xì)胞進(jìn)行制片觀察，？可見(jiàn)到一個(gè)由4對(duì)染色體的著絲粒結(jié)合形成的染色中心， 以及向四周伸展的5條染色體臂（X?2L、2R3L、3R）,其中第4對(duì)染色體為粒狀，與染色中心密切相聯(lián)，總稱為唾液腺染色體（圖2-2）。圖養(yǎng)1果蠅三齡幼蟲(chóng)及唾液腺所it位置I三齡雄蟲(chóng)側(cè)面圖1唾液腺2神經(jīng)節(jié)3生殖腺n三齡此蟲(chóng)解剖圖4唾液腺5神經(jīng)節(jié)6氣瞥7 8聘肪悴9弗巢10腸圖果蠅唾液腺染色體果蠅唾液腺染色體是一種典型的多線染色體。它是果蠅唾液腺細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂所致，即核內(nèi)染色體中的染色線連續(xù)復(fù)制而染色體并不分裂，結(jié)果使每條染色體中的染色線可多達(dá)500?1000條，？長(zhǎng)度和體積分別比其它細(xì)胞的染色體長(zhǎng) 100?200倍、大1000?2000倍，因此也稱巨型染色體。由于每條染色體的染色線在不同的區(qū)段螺旋化程度不一，因而出現(xiàn)一系列寬窄不同、染色深淺不一或明暗相間的橫紋。不同染色體的橫紋數(shù)量、形狀和排列順序是恒定的。利用這些特征不僅可以鑒別不同的染色體， 還可以結(jié)合遺傳實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行基因定位。此外，由于其體細(xì)胞同源染色體的配對(duì)，故易于進(jìn)行染色體的缺失、重復(fù)、倒位和易位的細(xì)胞學(xué)觀察和研究。三、實(shí)驗(yàn)材料用具藥品、材料果蠅的三齡幼蟲(chóng)活體。、用具顯微鏡、雙筒解剖鏡、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、鑷子、解剖針、吸水紙、灑精燈、火柴等。、藥品無(wú)水灑精、冰醋酸、1%醋酸洋紅、生理鹽水（0.7%NaCI）、1M鹽酸、蒸餾水。、培養(yǎng)基采用玉米粉培養(yǎng)基。玉米粉培養(yǎng)基配方水150ml瓊脂1.5g蔗糖13g玉米粉17g酵母粉1.4g丙酸1ml配制時(shí)根據(jù)各成分的配比（配制量根據(jù)所用培養(yǎng)瓶和實(shí)驗(yàn)人數(shù)而定） ，先取應(yīng)加水量的一半，加入瓊脂和蔗糖，煮沸使之充分溶解。取另一半水混和玉米粉，加熱調(diào)成糊狀。將上述兩者混和煮沸。待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分調(diào)勻，最后分裝到經(jīng)滅菌的培養(yǎng)瓶中。四、實(shí)驗(yàn)步驟、幼蟲(chóng)飼養(yǎng)選野生型雌雄果蠅各5只，放入培養(yǎng)瓶中繁殖，置于16?18C下飼養(yǎng)，當(dāng)幼蟲(chóng)爬上瓶壁準(zhǔn)備化蛹前，即為三齡幼蟲(chóng)，此時(shí)蟲(chóng)體肥大，便于解剖，是制備唾液腺染色體的最理想時(shí)期。、唾液腺剖取選取發(fā)育良好、蟲(chóng)體肥大的三齡蟲(chóng)，置于載玻片上，加幾滴 0.7%生理鹽水，在雙筒解剖鏡下左手持鑷子壓住蟲(chóng)體中后部，右手持解剖針按住頭剖（即口器稍后處） ，輕輕向前拉動(dòng)，使頭部扯離蟲(chóng)體，從而拉出唾液腺。這時(shí)可看到一對(duì)透明微白的長(zhǎng)形小囊，即是由單細(xì)胞層構(gòu)成的唾液腺，在解剖鏡下隱約可見(jiàn)其細(xì)胞界限，唾液腺的一側(cè)有一條泡沫

狀脂肪體，可用解剖針剔除，以保證制片質(zhì)量。整個(gè)剖取過(guò)程須在生理鹽水中進(jìn)行。、解離把載玻片上的幼蟲(chóng)其它部分除去，用吸水紙小心吸去生理鹽水（注意吸水紙應(yīng)離唾液腺遠(yuǎn)些，以免吸附唾液腺），加1滴1M鹽酸，解離2?3min,使組織疏松，以便壓片時(shí)細(xì)胞分散，染色體展開(kāi)。、染色用吸水紙吸去鹽酸,加1滴蒸餾水輕輕沖洗后吸干,加2滴1%醋酸洋紅染色15?20min。、壓片蓋上蓋玻片（如染液不夠,可在蓋玻片四周再加1滴滲入）,在酒精燈上略作加熱,然后用吸水紙包被載玻片,吸干多余染色液,并用手指輕壓蓋玻片,再用鉛筆的橡皮頭或解剖針柄垂直輕敲,或進(jìn)一步用拇指在蓋玻片上適當(dāng)用力壓片,注意勿使蓋玻片移動(dòng)。、觀察先在低倍鏡下找到分散相好的唾液腺染色體,然后調(diào)高倍鏡觀察,對(duì)染色體分散、個(gè)體清楚的片子,應(yīng)仔細(xì)觀察染色體的橫紋數(shù)量、形狀和排列順序,以便對(duì)照模式照片辨認(rèn)出不同的染色體臂。五、實(shí)驗(yàn)作業(yè)每人制2張染色體分散、橫紋清晰的臨時(shí)片。實(shí)驗(yàn)三花粉母細(xì)胞涂抹制片一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握花粉母細(xì)胞涂抹制片的基本方法,加深對(duì)植物減數(shù)分裂的認(rèn)識(shí)和理解。二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明花粉母細(xì)胞涂抹制片技術(shù)是一種良好的速成制片法。它具有操作簡(jiǎn)便省時(shí),能盡快得到植物細(xì)胞染色體的分散而清晰的圖象等優(yōu)點(diǎn),是近代細(xì)胞學(xué)上常用的研究細(xì)胞分裂的手段。學(xué)習(xí)并掌握花粉母細(xì)胞涂抹制片技術(shù),也是我們從事遺傳育種研究的基本功之一。三、實(shí)驗(yàn)材料用具藥品、材料經(jīng)過(guò)固定,處于減數(shù)分裂中的玉米雄穗。載玻片、蓋玻片、紗布、表面皿、吸水紙、酒精燈、、用具顯微鏡、解剖針、鑷子、培養(yǎng)皿等。載玻片、蓋玻片、紗布、表面皿、吸水紙、酒精燈、、藥品配制（1）卡諾氏固定液配方I純酒精（或95%酒精）3份冰醋酸1份配方n純酒精6份氯仿3份冰醋酸1份量取45ml冰醋酸加入55ml蒸餾水中，即成100ml45%量取45ml冰醋酸加入55ml蒸餾水中，即成100ml45%的醋酸。加2g洋紅粉末,?加熱至沸1?2min并同時(shí)懸入一生銹的小鐵釘,或熱至沸,移去火焰徐徐加入者等冷卻后加入幾滴2%鐵明礬（硫酸鐵銨）,過(guò)濾后貯藏于棕色瓶中備用。（注：?放入鐵釘或鐵明礬或氫氧化鐵的 45%醋酸飽和液,是使染色劑略具鐵質(zhì),可以增強(qiáng)染色性能。）3）脫水、透明劑配方I叔丁醇法①45%冰醋酸1/2冰醋酸+1/2叔丁醇純叔丁醇配方n正丁醇法1/295%乙醇＋1/2冰醋酸+正丁醇（數(shù)滴）1/295%乙醇＋1/2正丁醇?③正丁醇（4）封片劑 加拿大樹(shù)膠，可用對(duì)應(yīng)的叔丁醇或正丁醇稀釋。四、實(shí)驗(yàn)方法、取材固定取材的時(shí)間和材料的大小必須適當(dāng)，才能獲得較多的花粉母細(xì)胞分裂相，此外及時(shí)固定，也是觀察染色體減數(shù)分裂的重要條件。（1）?取材在玉米抽雄前7至10天，即大喇叭口期，用手?jǐn)D捏喇叭口下部葉鞘，在感

覺(jué)松軟處，以刀片劃一縱向切口，剖開(kāi)取出數(shù)條花序分枝觀察，如先端小花苞長(zhǎng) 3?4mm即可取用。？時(shí)間在上午7:00?10:00,氣溫25C?30C左右，此時(shí)正是玉米花粉母細(xì)胞分裂的高峰期。（2）?固定：利用化學(xué)藥劑把細(xì)胞迅速殺死，使蛋白質(zhì)變性和沉淀，并盡量保持各種結(jié)構(gòu)的原有狀態(tài)，便于染色及染色體觀察分析等細(xì)胞遺傳學(xué)研究。固定方法：取樣后應(yīng)立即投入固定液中，即隨取隨浸。有芒的穗應(yīng)剪去，較大的應(yīng)分段固定，固定時(shí)應(yīng)在低溫下，一般在冰箱內(nèi)固定1?24h。將固定后的材料用95%酒精洗兩次，每次10min,再經(jīng)80%酒精泡洗10min至無(wú)酸味時(shí)，最后放入70%酒精中保存。、染色制片選擇理想的分裂時(shí)期是染色制片成功與否的重要前提條件。 玉米雄穗分枝，主莖最老，從上至下逐漸幼嫩；每一側(cè)枝的中上部最老，由此向上向下越發(fā)幼嫩。每一側(cè)枝小穗成對(duì)著生，無(wú)柄小穗發(fā)育略早于相鄰的有柄小穗。每個(gè)小穗有兩朵小花，第一小花（上部）老于第二小花（基部），每朵小花內(nèi)有3個(gè)花藥，第一小花的分裂最有規(guī)律，可沿側(cè)枝連續(xù)找到各個(gè)分裂時(shí)期。先取玉米雄穗分枝置于表面皿中，加少許保存液，以防干去。用鑷子取適當(dāng)部位花藥1?3個(gè)（最好同一朵花），移置載玻片上，滴一滴染液，用解剖針切斷花藥，并輕輕擠壓，使花粉母細(xì)胞從切口處散出。而后將花藥壁殘?jiān)鼡斐蓛簦贁噭?dòng)染液，使花粉母細(xì)胞散開(kāi)。置低倍鏡下初檢，如花粉母細(xì)胞正處于分裂期，即可加上蓋玻片，將載玻片在酒精火焰上來(lái)回烘烤幾次，注意勿使染液沸騰或干燥，而后用拇指墊上吸水紙輕壓蓋玻片，注意不能平移。這樣才能使染色體染色較深，細(xì)胞質(zhì)染色較淡，兩者對(duì)比明顯且染色體比較分散并處于同一平面內(nèi)便于觀察。如果染色太淺（或太深）可在蓋玻片四周稍加染液（或 45%醋酸），待其滲透，再烘，再壓，直至染色體明顯清晰為止。、鏡檢觀察確定分裂時(shí)期時(shí)應(yīng)識(shí)別以下幾種細(xì)胞：體細(xì)胞、花粉母細(xì)胞、四分體脫開(kāi)后剛發(fā)育的幼小花粉粒以及成熟的花粉粒等。一些形態(tài)較小而且整齊均一的細(xì)胞，就是花藥壁體細(xì)胞。一些形態(tài)顯著較大，比前述細(xì)胞大十來(lái)倍，圓形或扁圓形，其細(xì)胞核較大，幾乎充滿整個(gè)細(xì)胞，就是花粉母細(xì)胞。比體細(xì)胞大但比花粉母細(xì)胞小，略呈扇形的細(xì)胞，就是從四分體脫開(kāi)的小孢子或幼小花粉粒。形態(tài)較大的橢圓形、似有明亮外殼、內(nèi)部較透明的細(xì)胞，就是長(zhǎng)大的花粉粒。凡形狀大小同花粉母細(xì)胞相近且范圍內(nèi)有似空腔的核仁，出現(xiàn)絲狀、條狀、棒狀物者，即正在減數(shù)分裂的花粉母細(xì)胞，注意對(duì)這類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)致的觀察分析，判斷所處時(shí)期，典型的制成永久制片。、永久制片將配制好的脫水透明液①、②、③號(hào)培養(yǎng)皿順序排好。將制好的臨時(shí)片翻轉(zhuǎn)，使蓋玻片朝下，浸入①號(hào)液中，使載玻片一端置于玻棒上且呈傾斜，讓蓋玻片自行脫落。此時(shí)載玻片材料面朝下，蓋玻片相反。將載玻片翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，并將蓋玻片材料面向上放于載玻片一端，用鑷子從①號(hào)液取出，稍控干，依次放入②、③號(hào)內(nèi)進(jìn)行脫水、脫酸、脫色1?2min。?取出蓋玻片和載玻片，吸去多余的液體，滴一滴樹(shù)膠于載玻片上有材料的地方，再將蓋玻片翻轉(zhuǎn)（有材料的一面向下）蓋于載玻片的原位上，最后用鑷子輕點(diǎn)蓋玻片，使樹(shù)膠布滿為宜。再經(jīng)鏡檢材料仍在且符合要求，則貼標(biāo)簽，注明時(shí)期、姓名、日期，置陰涼處晾干保存。五、作業(yè)每人至少交兩張減數(shù)分裂永久制片。實(shí)驗(yàn)四分離規(guī)律一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)一對(duì)相對(duì)性狀的遺傳雜交實(shí)驗(yàn)，分析雜種后代的性狀表現(xiàn)，驗(yàn)證分離規(guī)律。二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在減數(shù)分裂形成配子時(shí)，同源染色體上的等位基因，必然隨著所在染色體的分離而分離。已知這些相對(duì)性狀分別受一對(duì)基因控制，且這一對(duì)基因之間具有顯性和隱性的關(guān)系。將具有一對(duì)相對(duì)性狀差異的兩個(gè)親本雜交， 其F產(chǎn)生的雌雄配子各有兩種，其比例為1:1,F2表現(xiàn)型也有兩種，其比例為3:1。三、實(shí)驗(yàn)材料用具、材料 玉米：甜X非甜F1自交的果穗和測(cè)交的果穗。棉花：正常闊葉X雞腳葉F1植株及F2植株群體。、用具 顯微鏡、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、鑷子、解剖針、玻棒、育苗箱等。四、實(shí)驗(yàn)方法、玉米觀察玉米子粒甜與非甜的分離 玉米子粒的淀粉層非甜（SuSu）對(duì)甜（susu）為顯性，非甜的粒形較飽滿、光滑，甜的粒形呈皺縮狀。每人取玉米雜合體（ Susu）F1株上自交和測(cè)交的兩種果穗，按子粒形狀計(jì)數(shù)各果穗上非甜粒數(shù)與甜粒數(shù)。最后按各小組觀察的數(shù)據(jù)匯總進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。、棉花觀察棉花葉形的分離 以正常闊葉X雞腳葉R株的葉形與雙親植株的葉形進(jìn)行對(duì)比觀察，并調(diào)查田間F2株群體中正常闊葉、中間葉和雞腳葉的株數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2為了驗(yàn)證分離規(guī)律，對(duì)所觀察的數(shù)據(jù)須按下式進(jìn)行 x（卡方）測(cè)驗(yàn)。（o-e）2d22x=2 =2—ee其中：？o為實(shí)際觀察值；e為預(yù)期理論數(shù)；d=o-e,d為實(shí)際觀察數(shù)與預(yù)期理論數(shù)的差數(shù)。2為各項(xiàng)總和。求得x2值后,根據(jù)自由度df（即分離類(lèi)型組數(shù)n減去1）,查x2值表，求出概率P。再根據(jù)P值確定實(shí)得結(jié)果與理論數(shù)是否有顯著差異。 ？Pv0.05，表明差異顯著如P>0.05，則表示差異不顯著，即說(shuō)明實(shí)際觀察數(shù)符合預(yù)期理論數(shù)。五、作業(yè)、上述各實(shí)驗(yàn)材料所獲得的觀察數(shù)據(jù)，全班匯總填入下表，然后分別進(jìn)行 x2測(cè)驗(yàn)，根據(jù)自由度和估算的x2值，查閱x2值表，求出概率值P。、通過(guò)分析，對(duì)各相對(duì)性狀的遺傳表現(xiàn)作出解釋。一對(duì)性狀的遺傳分析玉米 棉花項(xiàng)目————————觀察數(shù)（o）預(yù)期數(shù)（e）偏差d=o-e差方d2=（o-e）22d22—eP=df=n-1=實(shí)驗(yàn)五等位基因分離的驗(yàn)證P=一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)對(duì)玉米(或水稻)非糯與糯雜種 F1花粉粒性狀的觀察，驗(yàn)證等位基因分離。二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明等位基因位于同源染色體上，減數(shù)分裂中同源染色體必然分離，染色體上的基因跟隨一道行動(dòng)而表現(xiàn)分離，形成不同基因的孢子，進(jìn)而產(chǎn)生不同的配子。具有一對(duì)基因之差的兩親本雜交，那么Fi產(chǎn)生的雌雄配子，應(yīng)各有兩種，并理論上數(shù)目相等， Fi自交時(shí)，各種雌雄配子隨機(jī)結(jié)合，因此F2中有三種基因型，比例為1:2:1，完全顯性時(shí)有兩種表現(xiàn)型，比例為3:1;Fi與隱性親本測(cè)定時(shí)，后代分離比例為 1:1。通過(guò)自交或測(cè)交后代的表現(xiàn)型比例，只可以間接推測(cè)等位基因的分離形式，而植物某些花粉粒性狀或粗糙鏈孢霉子囊孢子的分離為等位基因的分離提供了直接證據(jù)。在一些植物中，如水稻、玉米、高粱、谷子等禾谷類(lèi)作物，它們的粒常有糯性與非糯性兩種類(lèi)型，這種性狀受一對(duì)基因控制，它們分別控制著子粒及花粉粒中的淀粉性質(zhì)，非糯為直鏈淀粉，由顯性基因Wx控制，糯性為支鏈淀粉，由隱性基因 wx控制，如果用稀碘液處理花粉，前者呈藍(lán)黑色反應(yīng)，后者呈紅棕色反應(yīng)，通過(guò)這種顏色反應(yīng)，可以直接觀察到 F1花粉的不同顏色來(lái)判斷等位基因是否分離。 例如非糯玉米與糯玉米雜交的 F1花粉經(jīng)稀碘液處理后，在顯微鏡下觀察，可以清楚地看到花粉粒具有兩種不同的顏色反應(yīng)，而且紅棕色和藍(lán)黑色的花粉粒的數(shù)目大致相等，因此證實(shí)了等位基因分離的原則。三、 實(shí)驗(yàn)材料用具藥品、材料以非糯與糯雜種玉米(或水稻) F1的花粉為材料，取材時(shí)于前一天將雄花套袋，?次日上午9:00?11:00盛花期抖落花粉，分藏于冷涼干燥處備用，或于頭天取欲將開(kāi)花散粉的雄花序，放在卡諾氏固定液中保存?zhèn)溆?。、用具顯微鏡、小鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、燒杯、培養(yǎng)皿、鉛筆等、藥品配制1%I—KI碘一碘化鉀液：取2g碘化鉀溶于5ml蒸餾水中，加入1克碘，待其溶后再加入295ml水，保存于棕色試劑瓶中。四、 實(shí)驗(yàn)方法、鏡檢檢查雜種花粉粒時(shí)應(yīng)以親本花粉作為對(duì)照，其鏡檢方法如下，挑取少量花粉或整個(gè)花藥置載玻片上，夾破花藥后置低倍鏡觀察，注意調(diào)節(jié)鏡下反光，稍暗一點(diǎn)，花粉便呈現(xiàn)亮晶晶乳白色光澤。?滴少許I—KI溶液，蓋上蓋玻片，靜觀花粉粒顏色變化，呈藍(lán)色的是非糯花粉粒，呈紅棕色的為糯性花粉粒。對(duì)雜種材料每張片子按 5點(diǎn)取樣，記錄5個(gè)視野各類(lèi)花粉粒數(shù)目，如此重復(fù)檢查，檢查花粉?？倲?shù)應(yīng)在5000以上。注意：(1)?解剖用具如針、鑷子用后隨時(shí)用水沖洗，洗去粘附的花粉粒，以免混雜干擾結(jié)果；(2)?調(diào)節(jié)照明，不用強(qiáng)光以及直射光，調(diào)節(jié)光欄，直至兩種顏色明顯區(qū)別，先在 100倍左右觀察，然后在200倍左右計(jì)數(shù)；(3)仔細(xì)鑒別花粉顏色，準(zhǔn)確歸類(lèi)，凡畸形癟皺、特小發(fā)育不良的花粉均不計(jì)入。、?適合性測(cè)定用x2(卡平方)法測(cè)驗(yàn)實(shí)際分離比例是否與理論預(yù)期相符，將各數(shù)填入下表：玉米糯與非糯F1花粉粒分離的卡方測(cè)驗(yàn)11111花粉粒丨觀察數(shù)丨理論數(shù)(1:1)丨偏差顏色 丨o 丨 e Id(o-e)|1111111差方I差方/理論數(shù)d2 Id2/e1 1 n d 1深藍(lán)色I(xiàn)I Id 1I紅棕色I(xiàn)I I11111I1 I1 1合計(jì)I1 1d IIx2=i i(o—e)22X=刀[ ]自由度df=2—1=1e查X2表，?若X2值〉3.84(即PV0.05),說(shuō)明實(shí)際結(jié)果不符合1:1的分離比例；若X值W3.84(即P>0.05),表示符合分離比例。五、作業(yè)每人檢查玉米(或水稻) ？糯X非糯F1花粉粒200個(gè)，記錄不同類(lèi)型的花粉數(shù)，綜合全班鏡檢結(jié)果，做卡平方測(cè)驗(yàn)，并解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)六獨(dú)立分配規(guī)律一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)兩對(duì)相對(duì)性狀的遺傳雜交實(shí)驗(yàn)，分析雜種后代的性狀表現(xiàn)，驗(yàn)證獨(dú)立分配規(guī)律。觀察分析玉米雜種后代的胚乳性狀、糊粉層及果皮顏色的表現(xiàn)，了解基因互作現(xiàn)象。二、 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在減數(shù)分裂過(guò)程中，位于非同源染色體上的兩對(duì)等位基因在形成配子時(shí)，每對(duì)等位基因既隨同源染色體的分離而分離，又隨非同源染色體的重組而自由組合，形成四種類(lèi)型的配子，其比例相等。因此，兩對(duì)基因的雜合體在完全顯性的條件下，其自交子代的表現(xiàn)型分離比例為9:3:3:1，測(cè)交子代的表現(xiàn)型分離比例為1:1:1:1。如果基因間發(fā)生互作，則隨著互作方式的不同而產(chǎn)生的表現(xiàn)型分離比例有所不同。玉米子粒是由果皮、胚乳和胚三部分組成，其中胚乳包括糊粉層和淀粉層。已知控制玉米子粒各種性狀的基因，具有下列的遺傳表現(xiàn)。果皮顏色性狀有紅色、棕色和無(wú)色。在基本色素基因A1存在時(shí)，果皮顏色的表現(xiàn)一般是由P和Bp兩對(duì)基因互作的結(jié)果。胚乳性狀有非甜粒和甜粒。非甜子粒外形飽滿，甜子粒外形皺縮。已知甜粒性狀是受位于第六染色體上的隱性基因su所控制。糊粉層顏色性狀有紫色、紅色和無(wú)色。它主要由7對(duì)基因(花青素基因A1—a1,A2—a2，A3—a3;糊粉粒色基因C—c,?R—r和Pr—pr;色素抑制基因I—i)所控制。只有當(dāng)顯性基因A1、A2、A3C、R同時(shí)存在，而抑制基因又呈現(xiàn)隱性純合 ii時(shí)，色素才能形成。而色素形成的類(lèi)別是由Prpr確定的，?當(dāng)顯性基因Pr存在時(shí)，表現(xiàn)紫色，當(dāng)隱性基因純合prpr存在時(shí)則表現(xiàn)紅色。當(dāng)顯性基因 A1、A2、A3、CR中缺少任何一個(gè)或所有這些色素基因均為顯性，但有顯性抑制基因I存在時(shí)，均表現(xiàn)為無(wú)色。由于控制玉米子粒、果皮和糊粉層顏色，以及胚乳性狀的基因分別位于非同源染色體上，故這些性狀的遺傳表現(xiàn)為獨(dú)立分配和基因互作現(xiàn)象。三、 實(shí)驗(yàn)材料用具、材料玉米果穗(有色、非甜X無(wú)色、甜)F1植株的自交果穗；［(有色、非甜X無(wú)色、甜)F1X無(wú)色、甜］的測(cè)交果穗；用于觀察基因互作的不同雜交組合的果穗材料。、用具計(jì)算器、計(jì)數(shù)器等。四、 實(shí)驗(yàn)步驟、驗(yàn)證獨(dú)立分配規(guī)律?配制玉米子粒有色、非甜X無(wú)色、甜的雜交組合，并產(chǎn)生 F1植株的自交果穗，然后觀察果穗上子粒性狀的分離現(xiàn)象。每一果穗的子粒按有色、非甜，無(wú)色、非甜，有色、甜，無(wú)色、甜四種表現(xiàn)型計(jì)數(shù)。?將上述有色、非甜X無(wú)色、甜的 F1植株與無(wú)色、甜的親本進(jìn)行測(cè)交。取 F1植株上測(cè)交的果穗，觀察子粒性狀的分離現(xiàn)象，每一果穗的子粒同樣按上述四種分離類(lèi)型分組計(jì)數(shù)。、觀察基因互作現(xiàn)象（1）互補(bǔ)作用由于A、C、R中缺少任何一個(gè)色素顯性基因，子粒均為無(wú)色，因而將子粒無(wú)色，基因型分別為 aaCCRR,?AAccRF或AACCrr親本間雜交，例如aaCCRFKAAccRR產(chǎn)生Fi為AaCcRR由于顯性基因A和C的互補(bǔ)作用，其Fi子粒表現(xiàn)有色。讓Fi植株自交產(chǎn)生F2果穗，觀察F2果穗上子粒的分離現(xiàn)象,?按有色和無(wú)色兩種表現(xiàn)型計(jì)數(shù)， 其F2子粒顏色的分離比例為9有色（9A_C_RR）：7無(wú)色（3aaC_RR+3A_ccRR+iaaccR）R。（2）抑制作用將有色子粒CCii與無(wú)色子粒ccII的親本雜交，讓Fi植株自交產(chǎn)生F2果穗。然后觀察F2果穗上子粒性狀的分離現(xiàn)象，按無(wú)色和有色兩種表現(xiàn)型計(jì)數(shù)。 上述組合中，由于抑制基因I能抑制所有色素基因的表達(dá)， ？故其雙親雖均具有純合的 A和R基因，但其F2穗子粒性狀表現(xiàn)為13無(wú)色（9C_l_+3ccl_+1ccii）：3有色（3C_ii）。（3）隱性上位作用果皮顏色將表現(xiàn)棕色果皮子粒性狀的親本（ PPbpbp）?與白色果皮子粒形狀的親本（ppBpBp）雜交，讓Fi植株自交產(chǎn)生F2果穗。觀察F2果穗上子粒性狀的分離現(xiàn)象。按紅色、紫色和白色三種表現(xiàn)型計(jì)數(shù)，由于上述組合中，玉米子粒 P和Bp這兩對(duì)基因具有互補(bǔ)效應(yīng)，因此，？當(dāng)具有P_Bp_時(shí)，玉米子粒的果皮顏色表現(xiàn)為紅色； P_bpbp為棕色；當(dāng)有pp基因存在時(shí)，則表現(xiàn)為無(wú)色，這里一對(duì) pp隱性純合基因具有隱性上位作用，從而使 F2子粒果皮顏色的分離為三種表現(xiàn)型，其比例為9紅色（9P_Bp_）:3棕色（3P_bpbp）:4無(wú)色（3ppBp_+ippbpbp）。糊粉層顏色將玉米子粒糊粉層顏色表現(xiàn)為紫色的親本?（CCPrPr）??與無(wú)色的親本（ccprpr）雜交，讓Fi植株自交產(chǎn)生F2果穗。觀察統(tǒng)計(jì)F2果穗上子粒糊粉層顏色的分離現(xiàn)象。由于cc隱性純合基因?qū)Ξa(chǎn)生紫色糊粉層的基因 Pr具有隱性上位作用，故F2子粒糊粉層顏色的分離比例為9紫色（9C_Pr_）：3紅色（3C_prpr）:4無(wú)色（3ccPr_+iccprpr）。五、作業(yè)i、?觀察上述各雜交實(shí)驗(yàn)的性狀分離和重組的表現(xiàn)型，并寫(xiě)出它們的基因型。各實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果分別按下表填寫(xiě)和分析。兩對(duì)性狀的遺傳分析表現(xiàn)型觀察數(shù)（o）預(yù)期數(shù)（e）偏差d=o-e差方d2df=n-i= x= 2df=n-i= x= P=、對(duì)以上各實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行x2測(cè)驗(yàn),從而對(duì)各性狀的遺傳表現(xiàn)作出解釋。（i）驗(yàn)證獨(dú)立分配規(guī)律玉米有色、非甜X無(wú)色、甜 Fi植株的自交果穗上的F2子粒色性狀的分離現(xiàn)象。玉米有色、非甜X無(wú)色、甜 Fi植株與無(wú)色、甜的親本測(cè)交，在 F2植株上所結(jié)測(cè)交果穗上的Ft子粒色性狀的分離現(xiàn)象。（2）觀察基因互作現(xiàn)象互補(bǔ)作用玉米子粒無(wú)色自交系間雜交，？產(chǎn)生Fi植株的自交果穗上的F2粒色性狀的分離現(xiàn)象。抑制作用玉米子粒有色和子粒無(wú)色自交系間雜交， ?產(chǎn)生F1植株的自交果穗上的F2粒色性狀的分離現(xiàn)象。隱性上位作用玉米棕色果皮和白色果皮自交系間雜交， ？產(chǎn)生F植株的自交果穗上的F2粒色性狀的分離現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)七基因的連鎖與交換一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)玉米三對(duì)連鎖遺傳的相對(duì)性狀的雜交實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證基因的連鎖與交換的原則，并掌握基因定位的基本方法。二、 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明生物體在形成配子減數(shù)分裂中，位于同源染色體上的等位基因必然分開(kāi)，表現(xiàn)分離規(guī)律；位于非同源染色體上的非等位基因表現(xiàn)獨(dú)立遺傳；位于同一染色體上的非等位基因，往往有保持原來(lái)組合狀態(tài)隨同所在染色體一道遺傳的趨勢(shì)，也可能隨著非姊妹染色單體的片段交換而交換，從而產(chǎn)生各種可能組合的配子。但總是親本型配子多，重組型配子少，即表現(xiàn)連鎖遺傳現(xiàn)象?；蜷g的連鎖強(qiáng)度以交換率即重組配子數(shù)占總配子數(shù)的百分率來(lái)表示，在測(cè)交條件下，測(cè)交后代重組型個(gè)體數(shù)交換率（%= X100測(cè)交后代總個(gè)體數(shù)基因在染色體上相距越近，交換機(jī)會(huì)就越少，交換率就越低，反之越高?；蛟谌旧w上的位置是固定的，基因間的交換率便也是相當(dāng)恒定的，因此交換率的大小可以作為衡量基因距離的尺度，?將1％交換率作為一個(gè)遺傳單位。根據(jù)交換率的大小，可以確定基因在染色體上的相對(duì)位置，經(jīng)典遺傳學(xué)基因定位的方法有兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)和三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)。連鎖基因的交換是生物變異來(lái)源之一。連鎖與交換的試驗(yàn)結(jié)果，提供了基因存在于染色體上的證據(jù)，論證了基因在染色體上的線性排列，為遺傳工程研究和動(dòng)植物育種工作提供了基本資料。三、實(shí)驗(yàn)材料用具、材料玉米紫色糊粉層、飽滿、非糯自交系與褐色糊粉層、凹陷、糯性自交系的雜種Fi與褐色、凹陷、糯性親本測(cè)交的果穗。已知玉米糊粉層色澤（紫色與褐色）子粒形狀（飽滿與凹陷）及胚乳質(zhì)地（非糯性與糯性）基因都位于第9染色體上，此染色體短臂上幾個(gè)主要基因的位置如下圖：wxshc、用具計(jì)數(shù)器，計(jì)算器等。四、實(shí)驗(yàn)方法1、觀察計(jì)數(shù)針對(duì)子粒的紫色與褐色、飽滿與凹陷、非糯性與糯性三對(duì)性狀，同時(shí)進(jìn)行觀測(cè)，雜種Fi果穗上的子粒全為紫色、飽滿、非糯，測(cè)交果穗中應(yīng)有八種不同的子粒表現(xiàn)類(lèi)型，仔細(xì)觀察鑒定，準(zhǔn)確無(wú)誤地進(jìn)行記數(shù)，將結(jié)果記入下表：測(cè)交后代表現(xiàn)型 丨F1配子基因型丨 交換類(lèi)別丨粒數(shù)丨交換率TOC\o"1-5"\h\z 1 1 1 1 飽滿、紫色、非糯丨丨無(wú)交換丨 丨凹陷、褐色、糯丨 丨 丨 丨 1 1 1 1 飽滿、褐色、糯丨 丨單交換I丨 丨凹陷、紫色、非糯丨丨 丨 丨飽滿、紫色、糯丨 丨單交換n|凹陷、褐色、非糯丨丨 I飽滿、褐色、非糯| |雙交換|凹陷、紫色、糯| | |合計(jì)2、分析計(jì)算（1） ?確定三種性狀（基因）的關(guān)系：全部獨(dú)立遺傳，或一個(gè)獨(dú)立兩個(gè)連鎖，或三個(gè)基因都連鎖。（2） ?確定各種交換類(lèi)型：測(cè)交后代中數(shù)量最少的類(lèi)型為雙交換型，最多的為無(wú)交換型，中間的為單交換型。（3） ?確定三種基因的排列順序：在雙交換后代中，有兩個(gè)性狀出現(xiàn)了原親本的組合類(lèi)型，則第三個(gè)改變了原有組合性狀的基因必在中間。（4） 計(jì)算交換率單交換I粒數(shù)＋雙交換粒數(shù)交換率I（%= x100總粒數(shù)單交換n粒數(shù)+雙交換粒數(shù)交換率n（%= x100總粒數(shù)、繪制連鎖圖按基因順序，以1％交換率作為一個(gè)遺傳距離單位，依比例繪圖。五、作業(yè)每人觀察兩個(gè)果穗，綜合全班結(jié)果，求交換率，進(jìn)行基因定位，交表，并附連鎖圖。實(shí)驗(yàn)八有絲分裂一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察有絲分裂中染色體的行為變化，并掌握染色制片技術(shù)和操作方法。二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明有絲分裂是生物體細(xì)胞增殖的主要方式。在有絲分裂過(guò)程中，細(xì)胞核內(nèi)染色體能準(zhǔn)確地復(fù)制，并能有規(guī)律地、均勻地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去，使子細(xì)胞遺傳組成與母細(xì)胞完全一樣，從而可以推斷生物性狀的遺傳與染色體的準(zhǔn)確復(fù)制和均等分配有關(guān)，支配生物性狀的遺傳物質(zhì)主要存在于細(xì)胞核內(nèi)的染色體上。細(xì)胞有絲分裂是一個(gè)連續(xù)過(guò)程，可分為前期、中期、后期和末期。有絲分裂在整個(gè)細(xì)胞周期中約占10%的時(shí)間，?而其余大部分時(shí)間是處于細(xì)胞連續(xù)兩次分裂之間的間期。 有絲分裂各時(shí)期染色體變化的特征如下：前期核內(nèi)染色質(zhì)逐漸濃縮為細(xì)長(zhǎng)而卷曲的染色體， ?每一染色體含有兩個(gè)染色單體，它們具有一個(gè)共同的著絲點(diǎn)；核仁和核膜逐漸模糊不明顯。中期核仁和核膜逐漸消失，?各染色體排列在赤道板上，從兩極出現(xiàn)紡錘絲，分別與各染色體的著絲點(diǎn)相連，形成紡錘體。在中期染色體呈分散狀態(tài)，便于鑒別染色體的形態(tài)和數(shù)目。后期各染色體著絲點(diǎn)分裂為二，?其每條染色單體也相應(yīng)地分開(kāi)，并各自隨著紡錘絲的收縮而移向兩極，每極有一組染色體，其數(shù)目和原來(lái)的染色體數(shù)目相同。末期分開(kāi)在兩極的染色體各自組成新的細(xì)胞核， ?在細(xì)胞質(zhì)中央赤道板處形成新的細(xì)胞壁，使細(xì)胞分裂為二，形成兩個(gè)子細(xì)胞。這時(shí)細(xì)胞進(jìn)入分裂間期。間期細(xì)胞分裂末期到下一次細(xì)胞分裂前期之間的一段時(shí)期。 ?在光學(xué)顯微鏡下，看不到染色體，只看到均勻一致的細(xì)胞核及其中許多的染色質(zhì)。實(shí)質(zhì)上間期的核是處于高度活躍的生理生化的代謝階段，為細(xì)胞連續(xù)分裂準(zhǔn)備條件。高等植物有絲分裂主要發(fā)生在根尖、莖生長(zhǎng)點(diǎn)及幼葉等部位的分生組織。由于根尖取材容易，操作和鑒定方便，故一般采用根尖作為觀察有絲分裂的材料。三、實(shí)驗(yàn)材料用具藥品、材料蠶豆、玉米、黑麥、洋蔥等的種子或根尖。、用具顯微鏡，蓋玻片，載玻片，培養(yǎng)皿，量筒，燒杯，玻棒，酒精燈，鑷子，解剖針，刀片，紗布，吸水紙等。、藥品配制?0.1%秋水仙堿溶液取0.1g秋水仙堿溶于100ml蒸餾水中。或者，將原裝1g秋水仙堿以少量95%酒精作溶媒，將其溶解后，加蒸餾水定溶 100ml即成1%秋水仙堿母液，存于棕色瓶中，放入冰箱保存。用時(shí)取一定量的母液稀釋至所需的濃度。(2)果膠酶與纖維素酶混合液混合濃度1%2.5%果膠酶1g2.5g纖維素酶1g2.5g蒸餾水100ml 100ml(3)1M鹽酸濃鹽酸(比重1.19) 82.5ml蒸餾水 917.5ml對(duì)二氯苯飽和水溶液取10g對(duì)二氯苯加蒸餾水100ml。0.002M的8—羥基喹啉水溶液：用分析天平稱 0.2901g8—羥基喹啉用蒸餾水定溶于1000ml容量瓶中,在60C下溶解后備用。(6)?卡諾氏固定液、醋酸洋紅、脫水透明封片劑配制方法同實(shí)驗(yàn)三《花粉母細(xì)胞涂抹制片》。四、實(shí)驗(yàn)步驟、？材料準(zhǔn)備選取蠶豆等種子，在40C?50C的熱水中催芽12?24h，然后將萌動(dòng)的種子放于鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿或放有3?5cm厚鋸末或沙子的盆中,?置于25?28C的溫箱內(nèi)發(fā)芽,待根長(zhǎng)到1?2cm時(shí)取出洗凈，將水吸干備用。、預(yù)處理為了獲得較多的中期分裂相，使染色體縮短、分散，便于壓片觀察，對(duì)剪下的根尖可采用下列任一方法進(jìn)行預(yù)處理。?冷凍處理將根尖浸入蒸餾水中，置于0C?3C的冰箱內(nèi)，處理20?24h,對(duì)某些禾本科植物效果良好。藥劑處理預(yù)處理常用的藥劑及其處理時(shí)間為：△0.01%?0.2%秋水仙堿水溶液處理2?4h;△對(duì)二氯苯飽和水溶液處理 3?4h;△0.002M的8—羥基喹啉水溶液處理3?4h。用以上各種藥劑處理時(shí)，應(yīng)注意溫度不能過(guò)高，以 10C?15C為宜。、固定經(jīng)過(guò)預(yù)處理的材料沖洗干凈后，用卡諾氏固定液固定24h,經(jīng)固定的材料如不立即使用，可置于95%酒精和80%酒精中各半小時(shí)，再換到70%酒精中，置于4C下保存。如保存時(shí)間太長(zhǎng)，需要重新固定后再用。、解離其作用是除去未固定下來(lái)的蛋白質(zhì)，同時(shí)使胞間層的果膠類(lèi)物質(zhì)解體，細(xì)胞分散便于制片觀察。解離所需時(shí)間長(zhǎng)短，依材料和解離液的成分而不同?！魉峤庥?M鹽酸在60C恒溫下處理6?20min,?或用鹽酸(1M)—酒精液(1:1),在室溫下處理8?20min；△酶解用0.5%果膠酶和0.5%纖維素酶的等量混合液，在25C下處理2?3h,在37C恒溫箱內(nèi)只需0.5?1h。？較難壓的材料可先以1M鹽酸處理幾分鐘，經(jīng)水洗后再移入1%勺兩酶混合液中處理。、染色壓片取處理好的材料，即根尖白色糊狀組織置于表面皿中，加幾滴醋酸洋紅染色0.5?1h,然后縱向分成2?4塊，分置幾張載玻片上，滴一滴 45%醋酸后加蓋片，復(fù)以吸水紙壓片，先用鉛筆的橡皮頭輕敲幾下，再用拇指適當(dāng)用力下壓，注意勿使蓋玻片平移，壓好片子即可鏡檢?；蛘呷√幚砗玫母夥謩e置于2?4個(gè)載玻片上,各加1?2滴醋酸洋紅,靜置10?15min烤片,?在酒精燈上反復(fù)3?5次,以載玻片上出現(xiàn)水汽又剛好消失為度，隨即撥碎根尖，加蓋玻片，復(fù)以吸水紙，壓片鏡檢。、鏡檢根據(jù)前述有絲分裂各時(shí)期的特點(diǎn)，在顯微鏡下，先低倍后高倍尋找有絲分裂相，仔細(xì)觀察，并分析確定時(shí)期。如效果理想，即可制成永久制片。、永久制片方法同實(shí)驗(yàn)三《花粉母細(xì)胞涂抹制片》五、作業(yè)每人做兩張良好的有絲分裂中期圖象的永久制片。實(shí)驗(yàn)九石蠟切片技術(shù)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馐炃衅娜^(guò)程；掌握取材的原則、切片的方法和染色技術(shù)。二、 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明石蠟切片法是動(dòng)物、植物和病理組織切片制作上最重要、最常用的一種方法。除某些材料確實(shí)經(jīng)不住石蠟法中各種藥劑的處理或加溫而不能應(yīng)用外，一般的材料都可以采用石蠟切片法。石蠟切片法的優(yōu)點(diǎn)是可以切出極薄的切片，并可制作大批或連續(xù)的切片。而且用石蠟包埋的組織塊還能長(zhǎng)期保存。三、實(shí)驗(yàn)材料用具藥品、材料蠶豆、小麥等作物的根、莖、葉、花、果實(shí)及子房、花藥、胚胎等。、用具單面刀片、溫臺(tái)、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、燒杯、毛筆、切片機(jī)等。3、藥品配制(1)福爾馬林—醋酸—酒精混合固定液(F.A.A.)50%或70%酒精 90ml冰醋酸 5ml福爾馬林（37%^40%甲醛） 5ml2） 1%番紅酒精（50%）溶液取1g番紅溶于100ml50%酉精中即得1%番紅酒精（50%溶液。3） 0.1%固綠酒精（95%）溶液取0.1g固綠溶于100ml95%酒精中即得0.1%固綠酒精（95%溶液。）甘油蛋清粘貼劑新鮮雞蛋蛋清25ml甘油25ml石炭酸0.5g四、實(shí)驗(yàn)方法、取材取材時(shí)用鋒利的刀片、剪子，根據(jù)觀察的目的和要求把材料切（剪）成小塊。在不影響觀察的情況下應(yīng)盡可能切小一點(diǎn)，這樣有利于固定液的浸入。要顯示哪些部位？是橫切還是縱切？這些問(wèn)題在切材料前必須計(jì)劃周密。（注：材料要用水清洗干凈）。、固定將材料放于FAA固定液中固定24h,?有的也可用其它固定液如卡諾氏固定液。有些材料在固定后仍須進(jìn)一步修切，將材料修切整齊后，再繼續(xù)固定。、?浸洗固定后的材料，根據(jù)固定液的不同，分別用水（自來(lái)水）、蒸餾水或70%酒精浸洗，?目的在于洗去固定液。經(jīng)過(guò)浸洗后的材料，可進(jìn)一步脫水。也可浸入 70%酒精中長(zhǎng)期保存。、脫水包埋前的第一個(gè)重要步驟為脫水。材料經(jīng)過(guò)浸洗后含有部分水份，而水與透明劑是不能相混合的，所以在透明之前，必須將材料內(nèi)所含的水份脫去。多以酒精為脫水劑，?采用逐漸提高酒精濃度（50%、70%、80%、90%、95%、無(wú)水酒精）來(lái)減少材料中水份的含量，這樣可避免組織過(guò)度的收縮。脫水時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織種類(lèi)和材料的大小不同靈活掌握。材料較大、較緊密的組織脫水的時(shí)間應(yīng)稍長(zhǎng)。反之，材料較小、較疏松的組織脫水時(shí)間可相應(yīng)地縮短。？在每級(jí)酒精中可浸2?24h。但材料在無(wú)水酒精中放置的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以防組織過(guò)度變硬、?變脆而造成切片困難。浸在95%酒精及無(wú)水酒精中時(shí)，最好多換一次新液，更有利于脫水。脫水的步驟很重要，若脫水的時(shí)間過(guò)短或酒精濃度不足，則材料中的水份不能完全脫去，當(dāng)浸入透明劑（二甲苯）時(shí)，便不能透明，浸蠟時(shí)石蠟也難以透入，致使切片困難。、透明酒精不能兼為石蠟的溶劑，因此，必須先經(jīng)透明劑透明。因?yàn)橥该鲃ǘ妆交蚵确拢┛梢匀芙馐?，有利于石蠟透入，同時(shí)，還有透明溶蠟的作用，以及脫酒精的功效。二甲苯極易使組織收縮變脆，故浸留時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般以達(dá)到材料透明為止。若材料過(guò)大，為了防止組織變脆，可采用冬青油透明。透明后再換兩次二甲苯洗去冬青油，便可進(jìn)行浸蠟。脫水不盡的材料，一投入二甲苯中便會(huì)產(chǎn)生乳白色霧狀，這樣的材料不會(huì)透明，可再退回?zé)o水酒精、95%酒精重新脫水。透明時(shí)按下列程序進(jìn)行： ？2/3酒精+1/3二甲苯t1/2酒精+1/2二甲苯t1/3酒精+2/3二甲苯t二甲苯（兩次），每級(jí)時(shí)間從30min?1.5h不等，視具體情況而定。、浸蠟石蠟?zāi)苋苡谕该鲃┲?。把已透明的材料投入熔化的石蠟中，即可取代透明劑，而使組織中的一切空隙為石蠟透入而填滿，這個(gè)步驟稱為浸蠟。將已經(jīng)透明的材料和二甲苯一起倒入包埋用的小燒杯中，此時(shí)可把寫(xiě)好的標(biāo)簽投入二甲苯中，然后輕輕倒入溶解的石蠟（視具體情況選用不同熔點(diǎn)的石蠟），這樣，石蠟不斷在二甲苯中溶解，不斷增加碎石蠟，直至飽和為止，換純蠟 1?2次，在60C恒溫箱中過(guò)夜。、包埋包埋是將浸過(guò)蠟的組織塊包于石蠟中，使組織與石蠟在硬度上有適當(dāng)?shù)呐浜?，以利于切片。包埋前先折一紙盒，其大小、深淺視組織塊的大小而定。將折好的紙盒放在加熱的溫臺(tái)上，然后右手持解剖針，左手從溫箱中取出盛材料的小燒杯，迅速將石蠟連同材料和標(biāo)簽一起倒入紙盒中，再用加熱的解剖針輕輕撥動(dòng)材料使其排列整齊，同時(shí)使標(biāo)簽有字的一面朝外，以便識(shí)別。稍停，待盒中石蠟?zāi)讲恢聞?dòng)搖，上表面剛凝固時(shí)，將紙盒輕輕壓入冷水中使之迅速凝固，半小時(shí)后即可取出備用。、固著與修整取保存的材料，卸下紙盒，將蠟塊沿材料之間切適當(dāng)?shù)纳顪?，用手分裂蠟塊，然后切去材料四周的蠟，僅留一部分不使材料暴露并成為適當(dāng)大小的方塊，材料四周的蠟面一定要平整，然后將蠟塊粘在臺(tái)木上。、切片切片時(shí)將臺(tái)木固定在切片機(jī)上，切片刀裝在刀架上，使蠟塊被切面與刀口成平行方向。調(diào)整刀口與蠟塊的角度，一般以 10°以內(nèi)為宜。角度太大或太小均切不出切片。根據(jù)需要的厚度，轉(zhuǎn)動(dòng)厚度調(diào)節(jié)器調(diào)好切片的厚度。切片的厚度可依據(jù)組織構(gòu)造及觀察目的而定。一般常切成6?8卩m厚。以上工作準(zhǔn)備妥當(dāng)后，便可以右手搖動(dòng)手搖柄進(jìn)行切片，左手持毛筆輕輕挑起切片。若連續(xù)切片，則每片切片會(huì)互相連接成為切片帶。、?粘片粘貼時(shí)，在擦凈的載玻片上滴一滴粘貼劑，用潔凈的小指涂勻，加幾滴蒸餾水，將蠟帶放在水面上，微加熱，蠟帶即慢慢展平，待完全展平后，可吸去多余水份，在36C恒溫箱中再行烘干。、?染色染色前須經(jīng)脫蠟，即用二甲苯徹底地溶去切片上的石蠟。一般經(jīng)過(guò)2?3次二甲苯進(jìn)行脫蠟，約需10?15min。蠟一定要脫干凈，否則染色困難。脫蠟之后，再經(jīng)過(guò)各級(jí)不同濃度的酒精，即由濃度高的酒精漸至濃度低的酒精。這個(gè)步驟稱為復(fù)水。在每級(jí)酒精中，各浸 1?5min。染色常采用番紅—固綠法。（1） 脫蠟；（2） 復(fù)水至50%酒精；（3） 1%番紅（50%酒精）染色2h左右；（4） 用50%酒精洗去多余的染液；（5） 脫水至95%酒精中；（6） 0.1%固綠（95%酒精）染色10?40s；（7）95%酒精很快沖洗；（8） 純酒精脫水；（9） 再透明，以便封固。、?封固把切片從二甲苯中取出，用布或紙把組織四周多余的二甲苯擦去。滴一滴樹(shù)膠在組織上，加蓋玻片。樹(shù)膠濃度要合適，滴多少也要恰當(dāng)。加蓋玻片時(shí)要傾斜地由左邊開(kāi)始蓋在樹(shù)膠和組織上，慢慢向下放平，這樣才不會(huì)出現(xiàn)氣泡。最后，貼上標(biāo)簽，保存。五、作業(yè)以小麥葉片或蠶豆的根或其它組織為材料練習(xí)石蠟切片全過(guò)程并寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)十染色體數(shù)目變異的誘發(fā)及鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馊斯ふT發(fā)植物多倍體的原理，掌握植物多倍體的誘導(dǎo)和鑒定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理植物多倍體是指每個(gè)細(xì)胞中具有3組或更多組染色體的植物。?人工誘導(dǎo)多倍體的方法很多，但最常用而且最有效的方法是利用秋水仙素來(lái)誘導(dǎo)。其誘發(fā)作用是由于秋水仙素抑制了分裂細(xì)胞紡錘絲的形成，使每個(gè)染色體縱裂為二后，不能分向兩極，同時(shí)細(xì)胞也不能分裂成兩個(gè)細(xì)胞，這樣每個(gè)細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目增加了一倍，成為多倍體細(xì)胞。若藥物濃度合適，多倍體細(xì)胞一定時(shí)期后可恢復(fù)常態(tài)，繼續(xù)分裂，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)育成多倍體的器官或完整的多倍體植物。三、實(shí)驗(yàn)材料用具藥品、材料洋蔥或番茄根尖。、用具顯微鏡、鑷子、刀片、搪瓷盤(pán)、燒杯、廣口瓶、量筒、載玻片、蓋玻片、小滴瓶、指形管、鉛筆、吸水紙等。、藥品0.1%秋水仙素、1MHCI、70%酒精，95%酒精、45%醋酸、改良苯酸品紅、卡諾氏固定液等。四、實(shí)驗(yàn)步驟、多倍體誘導(dǎo)剪去洋蔥老根，置于燒杯或廣口瓶上，加水至剛與根部接觸為止，室溫下培養(yǎng)，?讓其長(zhǎng)出新的不定根后（蠶豆置培養(yǎng)皿催芽至種子萌發(fā)后） ，再換成0.1%秋水仙素溶液繼續(xù)培養(yǎng)，直至根尖膨大為止，然后取根尖固定，檢查。固定、解離、染色、壓片方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)八。、鏡檢低倍鏡下尋找染色體分散的分裂相，換高倍鏡分別觀察二倍體和多倍體細(xì)胞的染色體數(shù)目。五、作業(yè)繪出所觀察到的二倍體和多倍體細(xì)胞的染色體圖，并注明染色體數(shù)目。實(shí)驗(yàn)十一顯微攝影技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)顯微攝影的操作過(guò)程，拍攝和印放顯微照片。二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明顯微攝影是利用顯微照相裝置，把顯微鏡下觀察到的圖象拍攝下來(lái)，印放成照片，以供進(jìn)一步研究和分析。一張好的顯微照片可省去許多文字描述，并可作為資料長(zhǎng)期保存。顯微攝影的裝置種類(lèi)很多，有小型的顯微攝影裝置，也有全自動(dòng)的專用顯微攝影裝置。顯微攝影就是在顯微鏡上附加顯微照相機(jī)。在觀察目鏡以上的延伸部分，光線分為兩路，一路進(jìn)入照相機(jī)成象，另一路進(jìn)入照相調(diào)整目鏡，供使用者拍照時(shí)對(duì)焦、取景及協(xié)調(diào)畫(huà)面之用。這兩路光線焦點(diǎn)同步，只要在照相時(shí)調(diào)整目鏡中觀察的圖象使之清晰，照相機(jī)底片成象也將清晰。三、 實(shí)驗(yàn)材料用具藥品1、材料各種臨時(shí)或永久的染色體制片。、用具附攝影裝置的顯微鏡、放大機(jī)、135膠卷、暗室、暗袋、顯影罐、顯影盤(pán)、定影盤(pán)、上光機(jī)、3號(hào)和4號(hào)放大紙等。、藥品顯影液（D-11、D-72、D-76等型號(hào)）、定影液冰醋酸等。四、 實(shí)驗(yàn)步驟1、染色體玻片中圖象的選擇供顯微攝影用的染色體臨時(shí)制片或永久制片應(yīng)表面無(wú)傷，內(nèi)無(wú)氣泡，外無(wú)霉斑，以免由此引起光線亂反射、降低亮度及清晰度。載玻片厚度不易超過(guò)聚光鏡的焦距，？一般在2mm以內(nèi)，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為 0.17mm從染色體制片中挑選出染色體分散清晰、數(shù)目完整、反差明顯的典型圖象，供顯微攝影用。2、物鏡和目鏡的選擇一般觀察用的顯微鏡物鏡和目鏡不適于顯微攝影，應(yīng)采用復(fù)消色差物鏡（鏡頭外殼刻有Apo字樣）？，平象消色差物鏡（刻有PL字樣）或平象復(fù)消色差物鏡（刻有PLApo字樣）?，以消除色差和球面差。物鏡按其前短透鏡及標(biāo)本介質(zhì)不同， 可分為干燥系和浸沒(méi)系物鏡。干燥系物鏡指普通物鏡，而浸沒(méi)系物鏡外殼前端?？桃缓诃h(huán)，便于識(shí)別。?油浸物鏡外殼刻有“oil”、“oel”或“HI”字樣；水浸物鏡外殼刻有“W”“water”?字樣；甘油浸物鏡外殼刻有“Glyc”、“Glyz”字樣。在焦距和數(shù)值孔徑相同時(shí)，浸沒(méi)系物鏡的象差校正比干燥系物鏡完善，成象質(zhì)量好。由于浸沒(méi)液折射率大于空氣的折射率，從而提高了物鏡的分辨率。采用浸沒(méi)系物鏡，可消除物鏡前端透鏡表面的雜亂反射光，?增加圖象反差。附有攝影裝置的顯微鏡，備有攝影目鏡，其外殼刻有“ photo”或“FK”字樣，專供攝影使用。為了提高影象質(zhì)量，消除象差等色差，應(yīng)注意調(diào)配物鏡和目鏡組合，如用平象復(fù)消色差物鏡和攝影目鏡或平象目鏡組合使用時(shí)，應(yīng)考慮有效放大率、分辨率、焦點(diǎn)深入和視野寬度等問(wèn)題。一般物鏡數(shù)值孔徑大的，分辨率高，物象清晰；但焦點(diǎn)深度和視野寬度降低。選用物鏡和目鏡主要著眼于提高圖象的分辨率和清晰度，即選用數(shù)值孔徑大的平象復(fù)消色差的中、高倍油浸物鏡，兼顧焦點(diǎn)深度和視野寬度，并選用相宜的低倍攝影目鏡。焦深和視野不足時(shí)，適當(dāng)調(diào)換物鏡，降低數(shù)值孔徑或放大倍數(shù)。、顯微鏡照明光源的調(diào)整顯微鏡攝影采用中心亮視野透射照明法，照明光束中軸與顯微鏡的光軸需在同一直線上。?當(dāng)前，普遍采用的是科勒（K?ehler）照明法，這是一種最佳的中心亮視野照明?？评照彰鞣ㄊ枪庠吹臒艚z在聚光器的孔徑光闌上成束，即在物鏡后焦面上成象。這樣視野內(nèi)照光均勻，不會(huì)烤焦被攝材料，并能極為有效地控制被照明的視場(chǎng)及其照明孔徑。一般在不過(guò)多地降低分辨率的前提下， 把孔徑光闌調(diào)到所用物鏡孔徑的 60%-70%、濾色片的選擇為提高影象反差，應(yīng)選用適當(dāng)?shù)臑V色片。一般是選用與被攝物體吸收的色光相同的濾色鏡。即選用被攝物體的補(bǔ)色濾色鏡，可達(dá)到理想的影象對(duì)比，具體選用參見(jiàn)表11-1。表11-1常用的生物染料所采用的濾色片111 染料片丨111111吸收光帶nm|推存的濾色片_ 丄 JL1染料1I吸收光帶nm|推存的濾色丄1 r1酸性品紅1I530-1560I11綠＋深黃rrII海登漢蘇木精I(xiàn)1560-600I 綠＋橙11堿性品紅|520-550I綠＋深黃II甲基紫I560-600I 綠＋橙11洋紅1I500-570I綠＋深黃II亮綠I600-660I 純紅1結(jié)晶紫|550-610I綠＋深黃II甲基綠I620-650I 純紅1埃利希蘇木精丨1部分綠色I(xiàn)綠＋深黃II番紅0I480-540I 綠＋監(jiān)1苯胺監(jiān)|550-620I綠＋橙 II伊紅YI490-540I 綠＋監(jiān)、拍攝（1） 膠片的選擇感光速度快的膠片銀粒粗、反差小、灰霧大、保存性差；而感光速度慢的膠片銀粒細(xì)、?反差大、?灰霧小、保存性好。所以顯微攝影力求使用感光速度中等（17DIN）或慢速的膠片，以便獲得銀粒細(xì)膩、反差高、清晰度高的攝影效果。（2） 取景和聚焦取景聚焦前，首先進(jìn)行屈光度調(diào)節(jié)，使目鏡取景器適用各種不同視力者，達(dá)到準(zhǔn)確的聚焦。方法是調(diào)節(jié)測(cè)視目鏡取景器的屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，改變焦距，直到清晰地辨識(shí)出雙十字線為止。取景時(shí)，要是被攝的物體影象中心位于長(zhǎng)方形景框的對(duì)角線中心。取景完成后，轉(zhuǎn)動(dòng)顯微鏡的粗細(xì)調(diào)螺旋，使視野中物體影象的焦點(diǎn)聚于暗箱的焦平面上。注意在取景聚焦完畢時(shí)，應(yīng)立即撳下快門(mén)按鈕。因?yàn)榫劢购蟮奈⑿☆潉?dòng)，也會(huì)引起聚焦的改變，使拍出的底片影象模糊不清。（3） 曝光時(shí)間的確定曝光時(shí)間由物鏡的數(shù)值孔徑和倍數(shù)、目鏡倍數(shù)、光源強(qiáng)度、光闌大小、膠片的感光度、標(biāo)本的厚薄、顏色的深淺和濾色片等多方面因素所決定。合適的曝光時(shí)間需經(jīng)試驗(yàn)取得，具體方法是固定以上條件，變換曝光時(shí)間，從中找出最佳曝光時(shí)間。先進(jìn)的全自動(dòng)顯微攝影裝置，一般無(wú)需進(jìn)行曝光時(shí)間試驗(yàn)。、膠卷沖洗沖洗膠卷有罐中顯影、盤(pán)中顯影等方法。采用何種顯影液，應(yīng)視拍攝的對(duì)像和對(duì)照片的要求而定。罐顯的具體步驟如下：?在暗室或暗袋中取出照好的膠卷，膠卷的藥膜面應(yīng)向里，與膠帶一起卷于顯影罐軸上，注意膠卷一定要入槽，不能相互粘貼，以免藥液進(jìn)不去，顯影不均勻。上好膠卷，蓋上顯影罐蓋，從暗袋中取出。?往顯影罐中注入自來(lái)水，轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)次，浸透膠片，以免藥膜面上發(fā)生氣泡或顯影不均勻，然后再將水倒出。加入顯影液(事先調(diào)到20C)后，每隔1?2min轉(zhuǎn)動(dòng)顯影罐軸心，使顯影均勻。D—11顯影液為5min,D—72顯影液為7?8min,D—76顯影液為13?14min。(4)倒出顯影液，再注入自來(lái)水迅速?zèng)_洗后倒出，加入定影液，常轉(zhuǎn)動(dòng)顯影罐軸心，定影15?20min。(5)倒出定影液,取出膠卷,用流水沖洗30min或更長(zhǎng)些,以除去底片中殘留的大蘇打雜質(zhì)和可溶性復(fù)性銀鹽。水洗后將膠卷掛在通風(fēng)無(wú)灰塵的地方晾干。沖洗后的底片,如發(fā)現(xiàn)底片太厚(曝光或顯影過(guò)度引起)或太薄(曝光或顯影不足引起),采用不同反差的相紙仍得不到良好的照片時(shí),最好重新拍攝、沖洗。加入標(biāo)本無(wú)法得到時(shí),可采用底片的減薄法或加厚法做適當(dāng)?shù)难a(bǔ)救。、印相和放大印相是將相紙直接在底片上印出照片；放大則是利用投影使放大紙感光,放出更大照片。放大的具體操作過(guò)程如下：(1)放大紙的選擇放大紙按放大性質(zhì)分為1、2、3、4號(hào)。號(hào)數(shù)的大小是指紙性軟硬程度。選擇放大紙的一般原則是底片反差弱的,要選用硬性紙；反差強(qiáng)的要選用軟性紙。染色體照片常采用3號(hào)或4號(hào)光面放大紙。(2)放大的操作程序①安放底片藥膜向下；②調(diào)整放大機(jī)機(jī)身的位置，直至影象大小符合所需放大尺寸；③調(diào)節(jié)鏡頭與底片間的距離，直到投影在放大板上的影象清晰為止。調(diào)焦完畢后,應(yīng)將光闌收縮至適當(dāng)程度,以控制曝光量和保證影紋清晰；④為決定曝光時(shí)間,?放大前可用小塊放大紙做分段曝光試驗(yàn), ?找出合適曝光時(shí)間。⑤關(guān)閉放大機(jī)內(nèi)光源(或加紅綠色鏡于鏡頭上,使投射出來(lái)的光為紅色),取出裁好的放大紙,膜面朝上,平放在放大壓板的框子內(nèi),即可進(jìn)行曝光。、洗相顯影曝光后的相紙放入D-72顯影液(1份原液加2份水，20C)中顯影1?2min。停顯顯影合適后即移到停顯液中,漂洗 10?20s。定影在定影液中最少15min。 (4)沖洗流水沖洗60min以上。(5)上光在上光機(jī)上給放大的照片上光。、放大倍數(shù)的計(jì)算方法一：在顯微照相的同時(shí),對(duì)鏡臺(tái)上測(cè)微尺進(jìn)行拍攝,放大成所需照片一樣大小,?然后根據(jù)照片上的實(shí)際長(zhǎng)度,計(jì)算放大倍數(shù)(表 11—2)。方法二：在底片上刻出已知長(zhǎng)度,或者用一薄的透明紙,刻度朝下放在底片的位置上,在以放大后的長(zhǎng)度除以已知長(zhǎng)度,即得放大倍數(shù)。表11—2放大倍數(shù)的計(jì)算\鏡臺(tái)測(cè)微尺11111放大后的長(zhǎng)度丨總放大倍數(shù)1丄 丄」11/100mm11I1mm |1100倍1/100mmI10mm I1000倍1/100mm1I20mm I112000倍1五、作業(yè)、利用制作的臨時(shí)片或永久片材料,拍攝和印放合格的染色體照片。、簡(jiǎn)要描述顯微攝影過(guò)程中應(yīng)注意的主要技術(shù)環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)十二植物染色體組型分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察分析植物細(xì)胞有絲分裂中期染色體的長(zhǎng)短、臂比和形態(tài)特征，學(xué)習(xí)染色體組型分析的方法。二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明各種生物染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)目都是相對(duì)穩(wěn)定的。每一生物細(xì)胞內(nèi)特定的染色體組成，叫做染色體組型。染色體組型分析，也稱核型分析，就是研究一個(gè)物種細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)目及各染色體的形態(tài)特征，如對(duì)染色體的長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)位置、臂比和隨體有無(wú)等觀測(cè)，從而描述和闡明該生物的染色體組成。為細(xì)胞遺傳學(xué)、分類(lèi)學(xué)和進(jìn)化遺傳學(xué)等研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在植物根尖等分生組織中的細(xì)胞有絲分裂中期，染色體具有較典型的特征，且易于記數(shù)，因而染色體組型分析大都以這一分裂時(shí)期進(jìn)行觀測(cè)。在染色體組型分析時(shí)，染色體制片要求分裂相多，染色體分散，互不重疊，能清楚顯示著絲點(diǎn)位置。然后通過(guò)顯微測(cè)量或顯微攝影，測(cè)量放大照片上的每個(gè)染色體，根據(jù)染色體的長(zhǎng)度和其它形態(tài)特征，依次配對(duì)排列、編號(hào)，并對(duì)各染色體的形態(tài)特征作出描述。三、實(shí)驗(yàn)材料用具藥品、材料洋蔥?(Alliumcepa,2n=16)?、蠶豆?(Viciafaba,2n=12)?、黑麥?(Secalecereale,2n=14)、大麥(Hordeumvulgare,2n=14)的根尖。、?用具顯微鏡(附攝影裝置)、冰箱、恒溫水浴鍋、135膠卷、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺、載玻片、蓋玻片、燒杯、酒精燈、剪刀、鑷子、解剖針、刀片及毫米尺等。、藥品無(wú)水酒精、70%酒精、冰醋酸、堿性品紅、苯酚、甲醛、山梨醇、對(duì)二氯苯、 a-溴萘、1M鹽酸、0.05%秋水仙堿。改良苯酚品紅染色液的配制A液：稱3g堿性品紅溶于100ml70%的酒精中(此液可長(zhǎng)期保存)。B液：量10mlA液，加入90ml5%苯酚水溶液中(此液限2周使用)。量45mlB液，加入6ml冰醋酸和6ml福爾馬林，即制成苯酚品紅染色液。量10ml苯酚品紅染色液，加入90ml45%醋酸和1g山梨醇，即制成改良苯酚品紅染色液，(山梨醇稍多，會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶，影響制片效果)。對(duì)二氯苯飽和液和a-溴萘混合液稱取10g對(duì)二氯苯溶于100ml40C蒸餾水中，振蕩搖均冷卻至室溫，加入1滴a-溴萘靜置過(guò)夜。四、實(shí)驗(yàn)步驟、染色體標(biāo)本玻片的制作?種子萌發(fā)和取材洋蔥鱗莖幼根長(zhǎng)至2cm左右時(shí)切取。蠶豆種子浸種發(fā)芽，待幼根長(zhǎng)至3cm左右時(shí)切取主根尖，待其次生根長(zhǎng)至 1cm左右時(shí)可再切取。黑麥和大麥種子置于培養(yǎng)皿內(nèi)的濕濾紙上，在25C恒溫箱中培養(yǎng)，待幼根長(zhǎng)至 1cm左右時(shí)切取。(2)預(yù)處理預(yù)處理的目的是改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，破壞或抑制紡錘體的形成，使染色體縮短并易于分散。預(yù)處理方法視不同材料而異，常用的方法有以下兩種藥物處理洋蔥和蠶豆根尖在固定前，用 0.05%秋水仙堿溶液處理2h或用對(duì)二氯苯飽和液和a-溴奈混合液在20?25C下處理2h。低溫處理將黑麥和大麥剛切取的幼根放在蒸餾水中， ？置0C?4C冰箱內(nèi)處理24h。此法對(duì)禾本科植物的處理效果較好。?固定經(jīng)預(yù)處理的材料用新配制的卡諾氏固定液固定 0.5?24h,然后換入70%酒精中，置冰箱內(nèi)備用。解離取已固定的根尖數(shù)條，經(jīng)蒸餾水沖洗后，加 1M鹽酸在60C恒溫水浴鍋中解（5） 染色和壓片解離后的幼根經(jīng)蒸餾水沖洗后，置于潔凈的載玻片上，用刀片切取根尖分生組織,用鑷子或解剖針將根尖搗碎后,滴一滴改良苯酚品紅染色液,染色后片刻即蓋上蓋玻片,用手指按住蓋玻片一角,再用鉛筆或解剖針,垂直輕敲蓋玻片,也可在酒精燈上略加熱后再垂直輕敲,以利材料分散。用改良苯酚品紅染色后,染色體呈紫紅色,而細(xì)胞質(zhì)不染色。（6） 鏡檢和攝影經(jīng)鏡檢,對(duì)各條染色體處于同一平面、分散均勻、數(shù)目完整、隨體和著絲點(diǎn)處不斷裂的細(xì)胞,進(jìn)行顯微攝影。、染色體照片的測(cè)量分析經(jīng)顯微攝影、沖洗放大（參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十一）的染色體照片按下列程序進(jìn)行分析。（1）測(cè)量依次測(cè)量染色體長(zhǎng)度,長(zhǎng)臂和短臂的長(zhǎng)度（分別量到著絲點(diǎn)中部）,計(jì)算臂比時(shí),長(zhǎng)臂長(zhǎng)度為分子,短臂長(zhǎng)度為分母（隨體計(jì)入臂長(zhǎng)須注明）。染色體長(zhǎng)度的表示方法有兩種：絕對(duì)長(zhǎng)度即用測(cè)微尺直接在顯微鏡下測(cè)量得到的實(shí)際長(zhǎng)度 （卩m）,或經(jīng)顯微攝影后在放大照片上的換算長(zhǎng)度。相對(duì)長(zhǎng)度指單個(gè)染色體的長(zhǎng)度占單套染色體組（性染色體除外）總長(zhǎng)度的百分?jǐn)?shù)。單個(gè)染色體長(zhǎng)度染色體相對(duì)長(zhǎng)度= x100%單套染色體組全長(zhǎng)（2）配對(duì)將放大照片上剪下的同源染色體進(jìn)行配對(duì)。 配對(duì)的根據(jù)是隨體的有無(wú)及大小，臂比是否相等，染色體長(zhǎng)度是否相等。（3） 排列將配對(duì)好的同源染色體按下列原則進(jìn)行排列，并正式編上序號(hào)，即染色體長(zhǎng)的在前；具隨體染色體、性染色體排在最后；若有二對(duì)以上具隨體染色體，則大隨體染色體在前，小隨體染色體在后。異源的染色體組（如小麥的 A、BD組）要分別排列。（4） 剪貼把上述已經(jīng)排列的同源染色體按先后順序粘貼在繪圖紙上。粘貼時(shí)，應(yīng)使著絲點(diǎn)處于同一水平線上，并一律短臂在上，長(zhǎng)臂在下。（5）分類(lèi)臂比是反映著絲點(diǎn)在染色體上的位置。 據(jù)此可確定染色體所屬的形態(tài)類(lèi)型（表12-1）。表12-1染色體的形態(tài)類(lèi)型1染色體類(lèi)型11丨臂比（長(zhǎng)臂/短臂）11符號(hào)中間著絲點(diǎn)染色體11 v1.7 |M近中間著絲點(diǎn)染色體| 1.7 ?3 |SM近頂端著絲點(diǎn)染色體| 3 ?7 |ST頂端著絲點(diǎn)染色體1I >7 |1T（6）填表將上述結(jié)果整理成“染色體形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)”表。表中包含下列各項(xiàng)：染色體序號(hào)、絕對(duì)長(zhǎng)度（卩m）、相對(duì)長(zhǎng)度（%、長(zhǎng)臂長(zhǎng)度（卩m）、短臂長(zhǎng)度（卩m）、臂比和染色體形態(tài)類(lèi)型。表頭注明單倍體染色體組的染色體實(shí)際總長(zhǎng)（ 卩m）o（7）綜合描述說(shuō)明供試材料的染色體總數(shù)；染色體組型的公式,如蠶豆的染色體組型公式為2n=2M（SAT）+10T;染色體的大??；染色體組型的分類(lèi)。染色體大小的確定：規(guī)定1卩m以下的為極小染色體；1?4卩m的為小染色體；4?12卩m的為中染色體；長(zhǎng)于12卩m以上的為大染色體。染色體組型的分類(lèi)：即核型的分類(lèi)。同一核型中染色體相對(duì)大小不一,一般可根據(jù)核型中染色體臂比及其比值大小，以及它們所具有的數(shù)目比例而劃分，由 M型染色體組成的，稱為對(duì)稱性組型；？大多數(shù)由M型染色體組成的，稱為基本對(duì)稱組型；大多數(shù)由SM型和ST型組成的稱為基本不對(duì)稱組型；由 ST型組成的，稱為不對(duì)稱組型。（8）翻拍繪圖將剪貼排列好的染色體組型圖進(jìn)行翻拍，用座標(biāo)紙或繪圖紙繪制成染色體模式圖。五、作業(yè)、對(duì)已拍攝放大的染色體圖片制作染色體組型圖，并繪制染色體模式圖。、染色體組型圖上所測(cè)量的數(shù)據(jù)分別填入表12-2，寫(xiě)出染色體形態(tài)類(lèi)型。表12-2 染色體形態(tài)測(cè)量的數(shù)據(jù) 總長(zhǎng)度（卩m）TOC\o"1-5"\h\zI I I I I II I丨染色體序號(hào)丨絕對(duì)長(zhǎng)度（卩m）|相對(duì)長(zhǎng)度（卩m）|長(zhǎng)臂長(zhǎng)度（卩m）|短臂長(zhǎng)度（卩m）丨臂比（長(zhǎng)臂/短臂）|染色體類(lèi)型丨I I I I I II I1 1 1 1 1 1IIIIIIIII | | | L一I I、簡(jiǎn)要描述實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的染色體組型結(jié)果。實(shí)驗(yàn)十三細(xì)胞核內(nèi)DNA的鑒定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握鑒定植物組織細(xì)胞中 DNA分布的孚爾根（Fenlgen）反應(yīng)染色法。二、 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明孚爾根染色法是鑒別細(xì)胞中 DNA的組織化學(xué)方法。細(xì)胞中的 DNA在1MHCI,60C水解作用下，其嘌呤堿與脫氧核糖之間的糖苷鍵被破壞，嘌呤堿脫掉，使脫氧核糖的第一個(gè)碳原子上潛在的醛基獲得自由狀態(tài)。水解后，組織經(jīng)水洗，移入希夫（ Schiff）試劑中，希夫試劑與露出來(lái)的醛基發(fā)生反應(yīng)，使試劑中無(wú)色的亞硫酸品紅分子轉(zhuǎn)變成紫紅色的品紅堿。 因此，？根據(jù)紫紅色出現(xiàn)的部位， ？即可鑒定DNA的存在。??這一反應(yīng)是1924年由Feulgen和Rossenbeck所發(fā)現(xiàn)和確定的，是DNA的一個(gè)特異性檢查法。三、 實(shí)驗(yàn)材料用具藥品、材料水稻、小麥、玉米、蠶豆、洋蔥等的根尖。2、用具顯微鏡、恒溫水浴鍋、試管、載玻片、蓋玻片、鑷子、刀片、吸水紙。、藥品配制（1） ？1MHCl量取比重為1.18的濃HCl82.5ml，加蒸餾水917.5ml即可。（2）？希夫試劑將0.5g堿性品紅徐徐加入煮沸的100ml蒸餾水中，用玻璃棒攪拌，使之充分溶解，待溶液冷卻至58C左右，過(guò)濾于棕色瓶中。當(dāng)濾液冷卻至25C左右時(shí)，再加入10ml1MHCl和0.5g亞硫酸氫鈉，搖動(dòng)，溶解后密封于棕色瓶中，置于黑暗低溫處。次日檢查溶液顏色，須呈無(wú)色透明或淡茶色才可使用。若稍呈紅色可加入0.5g活性炭連續(xù)搖動(dòng)，在4C下靜置過(guò)夜，然后過(guò)濾脫色。（3）漂洗液將5ml1MHCI和5ml10%亞硫酸氫鈉溶液分別倒入容量瓶中，再用蒸餾水定容至100ml。注意，此液必須隨用隨配。四、實(shí)驗(yàn)步驟、取材植物根尖的取材參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)八《有絲分裂》。、?水解試管1:取洋蔥根尖數(shù)條，放入試管，加入數(shù)滴 1MHCI浸沒(méi)根尖，在60C下水解10min，?然后用蒸餾水換洗2次。試管2（對(duì)照）：另取洋蔥根尖數(shù)條，投入試管，加蒸餾水浸沒(méi)根尖，在60C下處理10min,然后把蒸餾水倒去。以下各步驟兩試管相同。水解是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一，重要的是時(shí)間和溫度。因?yàn)楹怂岬乃庥袃煞N方式 :嘌呤堿被很快除掉，脫氧核糖中的醛基顯露出來(lái)，②組蛋白和核酸愈來(lái)愈多地被除掉。在短時(shí)間作用后,?第1種方式占優(yōu)勢(shì),這時(shí)用希夫試劑染色,染色體的染色作用強(qiáng)。如果溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng),造成水解過(guò)度,糖與醛基之間的鍵被破壞,醛基流失到水解液中,使水解液中的希夫反應(yīng)增強(qiáng),而染色體中希夫反應(yīng)減弱。反之,則不能出現(xiàn)顯露的醛基,不能呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。、？染色兩試管中均滴加希夫試劑，浸沒(méi)根尖，立即置于陰暗處處理 0.5?1h,然后用漂洗液換洗3次，每次2min,再用蒸餾水換洗2次，每次2min。、?壓片鏡檢分別取上述兩試管中的根尖,置于載玻片上,滴一滴 45%醋酸,然后壓片鏡檢。五、作業(yè)、分別制作經(jīng)孚爾根染色和對(duì)照處理的臨時(shí)片2張,并根據(jù)鏡檢結(jié)果繪圖。、比較根尖經(jīng)鹽酸水解處理與否所獲得的結(jié)果,并作出解釋。實(shí)驗(yàn)十四高等植物核DNA的簡(jiǎn)易快速提取一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)高等植物核DNA的簡(jiǎn)易提取方法和純度檢測(cè)技術(shù)，為外源 DNA的花粉管道導(dǎo)入提供DNA。二、 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明植物核DNA是雙鏈高分子，？在根尖、頂芽、黃化苗等幼嫩的組織或器官中含量豐富， 它易溶于水，？而不溶于有機(jī)溶劑。因植物組織內(nèi)含有內(nèi)源核糖核酸酶 （DNase，當(dāng)植物組織破壞時(shí)，？植物核DNA易被降解為短鏈小分子。 ？可以通過(guò)低溫操作，？調(diào)節(jié)pH值，降低DNase的活性，？并在抽提液中加入金屬螯合劑（乙二胺四乙酸二鈉鹽，簡(jiǎn)稱 EDTA除去酶活性所需的輔助因子Ca++和Mg++?可使DNase基本失活。植物核DNA與蛋白質(zhì)、RNA共同存在，在提取過(guò)程中，需要通過(guò)蛋白質(zhì)變性劑（氯仿）和 RNA酶的處理，使植物核DNA純化。三、 實(shí)驗(yàn)材料用具藥品、材料避光培養(yǎng)的小麥、玉米、高粱或水稻等幼苗。、用具冰箱、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、酸度計(jì)、天平、剪子、研缽、燒杯、量筒、三角瓶、試管、玻璃棒、移液管。、?藥品氯化鈉、檸檬酸三鈉鹽、 EDTA十二烷基硫酸鈉（SDS）、氯仿、異戊醇、高氯酸鈉、95%乙醇、RNAB（RNase）。、試劑配制10XSSC1.5M氯化鈉+0.15M檸檬酸三鈉鹽研磨緩沖液0.45M氯化鈉＋0.045M檸檬酸三鈉鹽＋0.1MEDTA＋1%SDS0.1XSSC0.015M氯化鈉+0.0015M檸檬酸三鈉鹽四、實(shí)驗(yàn)方法、植物核DNA的提取（1） 稱取去根的黃化幼苗（10—30g）洗凈剪碎，放入研缽內(nèi)在冰箱內(nèi)冷凍半小時(shí)。加入等量（W/V）的研磨緩沖液，在冰浴下迅速（ 5min）研磨成勻漿。（2）將勻漿倒入三角瓶?jī)?nèi)，加入等體積的氯仿—異戊醇（ 24：1V/V）混合液，充分搖蕩半分鐘，？以脫去組織蛋白質(zhì)。然后離心（4000rpm）5min，用細(xì)口滴管細(xì)心地吸出最上層含核酸的水溶液留用，棄去中、下層細(xì)胞碎片、變性蛋白質(zhì)、氯仿等殘物。（3） 將收集的上清液倒入一個(gè)在72C水浴中予熱的三角瓶?jī)?nèi)，并在72C下繼續(xù)保溫3?4min（不得超過(guò)4min）?，以滅去組織中的DNase然后取出迅速放入冰浴中冷卻，隨后加入上清液四分之一體積的5M高氯酸鈉溶液，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為 1M（4）??再加入等體積的氯仿—異戊醇混合液， ??振蕩半分鐘成乳狀液。???然后離心（4000rpm）5min，用滴管吸出上層含核酸的水溶液，移入燒杯內(nèi)。（5）?以滴管沿?zé)好婢従徏尤?倍體積預(yù)冷的95%乙醇，然后用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，將出現(xiàn)的纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上（纏繞不成功時(shí)，通過(guò)離心收集） 。（6）?將上述沉淀溶解在適量的0.1xSSC溶液中，攪拌到完全溶解后，加入此溶液十分之一體積的10XSSC溶液，使溶液最終濃度為 1xSSC可按步驟（5）、（6）重復(fù)一次。（7）?加入RNase溶液，使其最終濃度為50?70卩g/ml，在37C下保溫30min,以除去RNA?加入此溶液四分之一體積的 5M高氯酸鈉溶液，然后加入等體積的氯仿一異戊醇混合液，?振蕩半分鐘，離心（4000rpm）5min。收集上層水溶液，再次除去殘留的蛋白質(zhì)和所加的 RNase,（8）?按步驟（5）的程序加入乙醇后，將 DNA沉淀挑出，再按步驟（6）的程序?qū)NA最后溶解于1xSSC溶液中，即得到純化的DNA溶液。、DNA純度及濃度測(cè)定（1）純度測(cè)定取少許樣品，用1XSSC緩沖液依次稀釋5倍、25倍、100倍。測(cè)定波長(zhǎng)為230nm260nm和280nm處的光吸收值。計(jì)算比值，女口A230/260>A260/280>1.8，即表明RNA已除干凈，蛋白質(zhì)含量不超過(guò)0.3%,DNA純度符合質(zhì)量要求。（2）濃度測(cè)定從260nm處的光吸收值讀數(shù)可以計(jì)算樣品中的 DNA濃度，1O.D.值相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNADNA濃度（卩g/ml）=50XO.D.260X稀釋倍數(shù)五、作業(yè)人一個(gè)小組，稱取10g黃化苗進(jìn)行DNA的提取，測(cè)定其純度和濃度，并寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)十五外源DNA的花粉管道導(dǎo)入技術(shù)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>