畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶實驗方案

重組畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶搖瓶培養(yǎng)實驗一、實驗?zāi)康氖炀殦u瓶發(fā)酵的操作流程和無菌操作技術(shù)。掌握細胞濃度、產(chǎn)物濃度的表征和測定方法。熟悉測定生長曲線和產(chǎn)物生成曲線的方法。二、畢赤酵母簡介甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)是80年代初被開發(fā)和研制的一種新型酵母表達系統(tǒng)。40年前，Ogata等人首次發(fā)現(xiàn)有些酵母能夠利用甲醇作為唯一的碳源和能源進行生長。隨后，甲醇營養(yǎng)酵母作為潛在的單細胞蛋白(singlecellprotein,SCP)來源立即引起廣泛關(guān)注，最初將其作為高蛋白的動物飼料在市場上銷售。在20世紀(jì)70年代，PhillipsPetroleum公司開發(fā)出畢赤酵母利用甲醇生長的培養(yǎng)基、發(fā)酵操作手冊和高密度連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)工藝。70年代的石油危機導(dǎo)致了甲烷價格的急劇上升，與此同時，動物飼料蛋白的主要替代源一一大豆價格的下降，導(dǎo)致利用甲醇生產(chǎn)SCP在經(jīng)濟上已不再合適。在以后的10年中，PhiLLipsPetroLeum公司與SIBIA公司合作開發(fā)利用畢赤酵母作為生物體表達外源蛋白的研究，研究人員分離了醇氧化酶(alcoholoxidase,AOX)的基因和啟動子，構(gòu)建了表達載體和菌株，開發(fā)了畢赤酵母基因操作相關(guān)技術(shù)。成熟的SCP發(fā)酵方法的開發(fā)，加上醇氧化酶強啟動子的可調(diào)控表達特性，極大地影響著外源蛋白在畢赤酵母中的高水平表達。1993年，PhillipsPetroleum公司委托Invitrogen公司代理畢赤酵母表達系統(tǒng)產(chǎn)品。畢赤酵母能在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中快速生長，其中醇氧化酶AOX——甲醇代謝途徑的關(guān)鍵酶可達細胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源的培養(yǎng)細胞中則檢測不到AOX。AOX的合成是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的。其基因啟動子具有明顯的調(diào)控功能，可用于調(diào)控外源基因的表達。此調(diào)控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊誘導(dǎo)機制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中處于非表達狀態(tài)，而在培養(yǎng)液中加入甲醇后，外源基因即被誘導(dǎo)表達。巴斯德畢赤酵母中存在著一種稱為微體的細胞器，其中大量合成過氧化物酶，因此也稱為過氧化物酶體。與大腸桿菌等原核表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母作為一種低等真核生物，除了具有遺傳操作簡單、細胞生長快、易于培養(yǎng)等原核生物的特點外，又具有真核生物完整的蛋白表達、正確加工和修飾功能，能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)表達蛋白過程中存在的不足；而與高等哺乳動物細胞相比，又具有產(chǎn)量高、培養(yǎng)成本低、產(chǎn)物的分離純化簡單等優(yōu)點。因此，畢赤酵母表達系統(tǒng)因其具有表達效率高、外源基因遺傳穩(wěn)定、易實現(xiàn)高密度培養(yǎng)、產(chǎn)物可分泌和蛋白翻譯后加工等眾多其它表達載體所無法比擬的優(yōu)點，已成為近年來極受青睞的外源蛋白表達宿主，受到越來越多的重視和利用。截止2005年，已有500多種外源蛋白通過畢赤酵母表達系統(tǒng)得到克隆表達，這些外源蛋白產(chǎn)品涉及食品、飼料、紡織和醫(yī)藥品等關(guān)系國計民生的多個行業(yè)。然而，要實現(xiàn)眾多新的外源蛋白產(chǎn)品在工業(yè)發(fā)酵罐水平下大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，除了構(gòu)建高效、穩(wěn)定的畢赤酵母生產(chǎn)菌株外，利用過程控制的方法和手段，最大限度地提高生物反應(yīng)器中基因工程菌的總生物量，發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力，提高單位體積培養(yǎng)液中目標(biāo)蛋白的表達水平是實現(xiàn)大規(guī)模、商業(yè)化重組蛋白生產(chǎn)、提高生產(chǎn)效率的一個關(guān)鍵因素。三、畢赤酵母生產(chǎn)表達外源蛋白的發(fā)酵過程Table2—^tch'a胃叫用叫wi瞠StrainGenotypeApplicationGS115SeJectlcncfexpressionvectorscontainingX-3HWildtypeSelertianofZeocin^-reslstantexpressfonvectorsKM71h/亳ooxk-ARGA,如。4SelectioncfexpressionactorscontainingHJSdtogeneratestrainswithMur:phenotypeKM71HSelectioncfZeocin^-resliiantexpressionsectorstogeneratestrainswithMuHphenotypeSMDt148fil$4rpep4SelectioncfexpressionvectorscantainirgtljS4togeneratestrainswithoutproteaseAacTMtySMD1168Hpep4SelectionofZeocin"11-resistantexpressednvectorstogeneratestrainswithoutproteanAactivity一般而言，畢赤酵母高密度流加培養(yǎng)生產(chǎn)表達外源蛋白過程由甘油分批培養(yǎng)、甘油流加培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)表達三個不同階段構(gòu)成。甘油分批培養(yǎng)的目的是為了積累一定的生物量，同時抑制AOX啟動子及外源蛋白表達；甘油流加培養(yǎng)是通過限制性的甘油流加，進一步增加生物量，盡可能地獲得高細胞濃度，同時解除過量甘油對AOX啟動子的抑制作用，為細胞進入誘導(dǎo)期作準(zhǔn)備；甲醇誘導(dǎo)表達階段是通過添加誘導(dǎo)劑甲醇，實現(xiàn)AOX高水平轉(zhuǎn)錄和外源蛋白的高效表達。PichiaGenome(his4)5"AOX1orTT3"Gene5"AOX1orTT3"GeneofInterestTT3^AQX1=ExpressionCassette四、木聚糖酶簡介木聚糖是植物細胞壁的主要成分之一，屬于非淀粉多糖。作為半纖維素的一種，在自然界中是含量僅次于纖維素的可更新多糖，存在于各種陸生植物的幾乎所有部位.它從僅由6-1，4糖苷鍵連接的多聚糖線形分子到以a-糖甘鍵形成取代基支鏈的高度分枝的異質(zhì)多糖，結(jié)構(gòu)變化的范圍很大。通常，木聚糖以異質(zhì)多糖形式存在并與纖維素結(jié)合在一起。木聚糖酶是木聚糖的專一降解酶。屬于水解酶類，包括內(nèi)切木聚糖酶、外切木聚糖酶和木糖苷酶三種。內(nèi)切木聚糖酶能隨機切斷木聚糖主鏈上的木聚糖苷鍵，生成分子量不同的木寡糖；外切木聚糖酶則從木聚糖非還原性末端切下單個的D-木糖；而木糖苷酶則水解木寡糖生成D-木糖，且僅能水解木二糖。三者酶解作用產(chǎn)生的D-木糖可以被動物吸收和利用。近年來對木聚糖酶的研究發(fā)現(xiàn)，它應(yīng)用于飼料中提高了飼料營養(yǎng)價值，突破了飼料資源開發(fā)利用的局限，增強了動物的生產(chǎn)與抗病能力，減少了動物排泄物造成的污染，作為一種環(huán)保添加劑，在發(fā)展環(huán)保型畜牧業(yè)中具有十分重要的意義與價值。五、畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶搖瓶實驗方案1.培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20。甘油生長培養(yǎng)基(g/L)：甘油20mL/L，MgSO41，K2SO41，(NH4)2SO45,CaSO40.1，H3PO42%(v/v)，PTM110mL/L，KOH20，pH6.0。甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L):甲醇10mL/L，MgSO41，K2SO41，(NH4)2SO45,CaSO40.1，H3PO42%(v/v)，PTM110mL/L，KOH20，pH6.0。PTM1組成(g/L)：CUSO.-5HO6g,Nal0.08g，MnSO/HQ3g,N^MoO.0.2g,HBO.0.02g，CoCL20.5g，ZnCL220g,FeSO4-7H2O65g,H2SO45mL,生物素0.2g培養(yǎng)基配置要求：KOH等其它試劑溶解后在滅菌前加入；PTM1、調(diào)pH用氨水和甲醇在滅菌后、接種前添加。調(diào)pH用氨水的用量需提前確定。2.操作步驟如圖1：菌株培養(yǎng)皿活化（30°C,2-3d）挑取活化后菌株于種子培養(yǎng)基250mL搖瓶種子培養(yǎng)（30°C，220rpm，24h）

每瓶種子培養(yǎng)基體積25mL以10%（v/v）接種量吸取2.5mL活化種子培養(yǎng)液于甘油生長培養(yǎng)基250mL搖瓶甘油生長培養(yǎng)（30°C，220rpm，24h）

每瓶甘油生長培養(yǎng)基體積25mL離心（2000rpmX2min）收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)入+等體積誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)250mL搖瓶甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)（30°C，220rpm）

每瓶甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基體積25mL每12h取樣檢測菌體濃度、離心（8000rpmX5min）后測上清液總蛋白濃度；每24h補加甲醇1%（w/v）；誘導(dǎo)培養(yǎng)共72h（3d）發(fā)酵結(jié)束，清洗實驗儀器，撰寫實驗報告圖1畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶搖瓶實驗操作流程圖3.分析檢測1）細胞濃度的測定采用比濁法，使用紫外分光光度儀進行測定。將從搖瓶中所采集的樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋（控制吸光度在0.1-0.7），測定其在600nm下的吸光度OD600。2)發(fā)酵上清液樣品蛋白濃度測定（考馬斯亮藍比色法）原理2)發(fā)酵上清液樣品蛋白濃度測定（考馬斯亮藍比色法）考馬斯亮藍G-250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌５鞍踪|(zhì)含量在0?1000mg范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用比色法測定A595。

試劑配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液稱取100mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100mL,制成1g/L的原液?？捡R斯亮藍G-250蛋白試劑稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。此溶液在常溫下可放置一個月。操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作發(fā)酵上清液樣品制備及檢測"■I取6支帶塞試管，編號后，按下表所示加入相應(yīng)試劑:發(fā)酵上清液樣品制備及檢測"■I操作項目管號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(mL)00.20.40.60.81.0蒸餾水(mL)10.80.60.40.20G-250試劑（mL）各5蛋白質(zhì)含量(g)00.20.40.60.81蓋上塞子，搖勻。放置2min后在595nm波長下比色測定(比色應(yīng)在1h內(nèi)完成)。以牛血清白蛋白含量(g)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的待測發(fā)酵