郭開元發(fā)酵工程課程設(shè)計(jì)

成績成績課程設(shè)計(jì)說明書（論文）題目：酵母菌高密度發(fā)酵課程名稱：發(fā)酵工程原理與技術(shù)學(xué)院：生物與食品工程學(xué)院學(xué)生姓名：郭開元學(xué)號(hào)：201206030011專業(yè)班級(jí)：生物工程12-1指導(dǎo)教師：李安華2015年5月24日課程設(shè)計(jì)任務(wù)書設(shè)計(jì)題目酵母菌高密度發(fā)酵學(xué)生姓名郭開元所在學(xué)院生物與食品工程學(xué)院專業(yè)、年級(jí)、班生物工程12-1設(shè)計(jì)要求：1、樹立正確的設(shè)計(jì)指導(dǎo)思想，嚴(yán)謹(jǐn)負(fù)責(zé)、實(shí)事求是、刻苦鉆研、勇于探索的作風(fēng)和學(xué)風(fēng)。2、根據(jù)所給資料，按照任務(wù)書中提出的范圍和要求按時(shí)獨(dú)立完成，不得延誤，不得抄襲他人成果。3、說明書應(yīng)字跡清楚文字通順，并附有各項(xiàng)設(shè)計(jì)成果表，摘引其他書籍或雜志的材料必須注明出處。4、繪制流程圖要明確清晰、布置勻稱、圖面整潔。5、設(shè)計(jì)應(yīng)嚴(yán)格按有關(guān)設(shè)計(jì)規(guī)范進(jìn)行。6、設(shè)計(jì)結(jié)束后，以個(gè)人為單位提交設(shè)計(jì)說明書一份（后附流程圖）。學(xué)生應(yīng)完成的工作：1、在老師的指導(dǎo)下確定設(shè)計(jì)題目2、查閱相關(guān)資料和文獻(xiàn)制定實(shí)驗(yàn)路線，并由指導(dǎo)老師檢查路線的合理性和可操作性。3、給出檢驗(yàn)規(guī)則。4、在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)際發(fā)酵操作，并完成實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)的測定與記錄。5、完成課程設(shè)計(jì)說明書的初稿，經(jīng)過指導(dǎo)老師修改，最后定稿參考文獻(xiàn)閱讀：[1]李寅等著，高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù)[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2006[2]陳思如，蕭熙佩酵母生物化學(xué)[M].濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，1990[3](日)山根恒夫(周斌譯),生化反應(yīng)工程[M].西安:西安大學(xué)出版社,1992[4]陳洪章，李佐虎，酵母菌的高密度發(fā)酵[J].工業(yè)微生物工作計(jì)劃：2015.5.112015.5.13接受設(shè)計(jì)任務(wù)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)。2015.5.142015.5.18整理文獻(xiàn)資料，進(jìn)行產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用設(shè)計(jì)。2015.5.192015.5.24整理設(shè)計(jì)內(nèi)容，完成課程設(shè)計(jì)說明書。任務(wù)下達(dá)日期：2015年5月11日任務(wù)完成日期：2015年5月24日指導(dǎo)教師（簽名）：學(xué)生（簽名）：酵母菌的高密度發(fā)酵摘要：酵母的高密度發(fā)酵是一個(gè)相對概念，一般指菌體濃度在100g/ml以上。根據(jù)高密度培養(yǎng)活性干酵母的生長特點(diǎn)，用上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司生產(chǎn)的SGJ-10L型發(fā)酵罐，采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)技術(shù)，維持葡萄糖的濃度處于適當(dāng)范圍，并用分批補(bǔ)加氮源的方法，控制溶氧濃度在20%-80%，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速300-400rpm。培養(yǎng)期間每隔2h對發(fā)酵液的還原糖含量，氨基氮含量，菌體密度進(jìn)行一次測定。關(guān)鍵詞：活性干酵母、分批補(bǔ)料培養(yǎng)、還原糖、氨基氮、菌體濃度目錄1設(shè)計(jì)背景.…………………..11.1酵母菌高密的狀態(tài)……….11.2高密度發(fā)酵的定義.………11.3影響高密度發(fā)酵的因素………………….12設(shè)計(jì)方案……………………22.1培養(yǎng)方式的選擇………….22.2實(shí)驗(yàn)流程………………….23實(shí)施方案……………………33.1材料……….33.2種子液的培養(yǎng)…………33.3發(fā)酵罐的準(zhǔn)備…………….33.4發(fā)酵罐的滅菌…………….43.5接種操作………………….43.6發(fā)酵中的補(bǔ)料…………….43.7取樣與分析方法………….43.8發(fā)酵罐的倒灌…………….54結(jié)果與結(jié)論…………………54.1測量數(shù)據(jù)………………….54.2實(shí)驗(yàn)曲線圖及結(jié)果分析………………….55收獲與致謝…………………76參考文獻(xiàn)………………….87附件……….9.設(shè)計(jì)背景1.1酵母菌高密度發(fā)酵的狀態(tài)酵母菌是一種兼性厭氧菌,當(dāng)酵母在低濃度的葡萄糖中進(jìn)行好氧生長時(shí)，它能把葡萄糖分解成二氧化碳和水。當(dāng)酵母在厭氧條件下生長時(shí),葡萄糖主要生成乙醇和二氧化碳。早在巴斯德時(shí)代,人們已知道大量通風(fēng)不長生乙酸,并且采用了補(bǔ)料技術(shù)（1915年）。但由于酵母菌的乙醇發(fā)酵酶系是組成酶,不受其他影響,而其呼吸酶系是阻遏酶系,受其他條件影響較大[2]。在發(fā)酵中如果提高發(fā)酵液中的碳源含量,酵母菌就會(huì)生成乙醇或乙酸,但其生物量則有所下降;如果將碳源保持在最低水平,就會(huì)限制酵母的生長.而利用分批補(bǔ)料發(fā)酵的方式，既可以滿足高密度發(fā)酵時(shí)酵母細(xì)胞對營養(yǎng)源的大量需求,又能減少生長抑制物質(zhì)的產(chǎn)生。1.2高密度發(fā)酵的定義高密度發(fā)酵（highcelldensitycultivation，HCDC）是指在一定條件和培養(yǎng)體系下，獲得最多的細(xì)胞量，由此更多的或更有效地獲得目的產(chǎn)物。即利用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率（單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的量）。通常認(rèn)為菌體密度超過30g/L即為高密度發(fā)酵,但是對于一些極端微生物或自養(yǎng)微生物，細(xì)胞濃度如果達(dá)到1g/L也算比較高的細(xì)胞密度[1]。酵母高密度理論值上限是多少呢?山根恒夫[3]以面包酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中所占體積分率的大小加以說明,不含上清液的菌體濃度最大為280g/L,該值為物理上限。假定細(xì)胞為球形,以最大密度堆積,可得細(xì)胞真正所占有的體積為整個(gè)細(xì)胞沉淀層體積的74%,因此,高密度濃度可達(dá)150~200g/L。一般酵母廠每升發(fā)酵液中酵母干菌體重在30g以下[4]。要達(dá)到高密度發(fā)酵并非易事，限制酵母菌高密度發(fā)酵的因素主要表現(xiàn)在營養(yǎng)供給不適宜、生產(chǎn)抑制性物質(zhì)的積累和發(fā)酵液流變學(xué)特性的影響。1.3影響高密度發(fā)酵的因素培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)、溶解氧（DO）、壓力、CO2、溫度、pH值、接種量、生長抑制性物質(zhì)、發(fā)酵液的流變狀態(tài)。2.設(shè)計(jì)方案2.1培養(yǎng)方式的選擇微生物的培養(yǎng)方式主要有分批、連續(xù)和補(bǔ)料分批3種。在本次酵母菌發(fā)酵中，我們采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)發(fā)酵的定義：是以分批發(fā)酵為基礎(chǔ)，介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù)。在分批發(fā)酵培養(yǎng)開始時(shí)投入較低的濃度底物，當(dāng)微生物開始消耗底物后，間歇或連續(xù)的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基而不從發(fā)酵罐中放出培養(yǎng)液的一種發(fā)酵方式。這是在現(xiàn)代發(fā)酵工藝得到優(yōu)化的一種發(fā)酵方式，能有效的優(yōu)化微生物培養(yǎng)過程中的化學(xué)環(huán)境，使微生物處于最佳的生長環(huán)境。這種方式一方面可以避免某些營養(yǎng)成分初始濃度過高出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，另一方面可以防止限制性營養(yǎng)成分被耗盡而影響細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的形成。補(bǔ)料分批培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于各種各樣的初級(jí)、次級(jí)生物產(chǎn)品和蛋白等的發(fā)酵生產(chǎn)中。在此過程中，我們使用50L的發(fā)酵罐采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)方式對酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)過程中的溶氧、pH以及溫度等發(fā)酵參數(shù)，每隔兩小時(shí)取料測定料液OD值、氨基氮、還原糖等數(shù)據(jù)，直到發(fā)酵結(jié)束。2.2實(shí)驗(yàn)流程器材、試劑、菌種的準(zhǔn)備→種子培養(yǎng)液的配制與滅菌→搖瓶接種發(fā)酵罐的安裝及調(diào)試→發(fā)酵罐的清洗→發(fā)酵培養(yǎng)基的配制滅菌→發(fā)酵罐的接種↓發(fā)酵罐條件的控制↓取樣↓清洗發(fā)酵罐←培養(yǎng)基滅菌處理←發(fā)酵結(jié)束←補(bǔ)料及調(diào)節(jié)pH↑流加培養(yǎng)基的配置及滅菌打掃實(shí)驗(yàn)室→實(shí)驗(yàn)結(jié)束3.方案實(shí)施3.1材料3.1.1活性干酵母由生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室購買的活性干酵母3.1.2培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：葡萄糖25g/L，尿素3g/L，KH2PO410g/L，MgSO42.5g/L，酵母膏15g/L，pH5.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO415g/L，KH2PO48.0g/L，MgSO43.0g/L，酵母膏15g/L，消泡劑0.3ml/L，ZnSO40.4g/L。流加培養(yǎng)基：KH2PO49.0g/L，MgSO42.5g/L，K2SO43.5g/L，Na2SO40.28g/L，葡萄糖500g/L。調(diào)節(jié)pH的氨水濃度：30%氨水3.1.3試劑和器材（1）試劑：葡萄糖、酵母膏、尿素、KH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4、ZnSO4、K2SO4、Na2SO4、氨水、消泡劑(2)器材：電子天平、鑰匙、量筒、燒杯、玻璃棒、3個(gè)1000ml三角瓶、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋。3.1.4發(fā)酵儀器與設(shè)備空壓機(jī)、發(fā)酵罐、蒸汽加熱器、分光光度儀等3.2種子液的培養(yǎng)用接種環(huán)從保存斜面中接一環(huán)至裝液量為60mL的1000mL搖瓶中，250r/min,30℃，搖瓶培養(yǎng)24h，制作三瓶種子液。3.3發(fā)酵罐的準(zhǔn)備3.3.1發(fā)酵罐的清洗發(fā)酵罐的清洗發(fā)酵罐使用前后都應(yīng)認(rèn)真清洗，特別是前后兩次培養(yǎng)采用不同的菌株時(shí)，更應(yīng)注意清洗和殺菌工作。發(fā)酵罐內(nèi)可進(jìn)行清洗的任何部分都應(yīng)認(rèn)真清洗，否則都可能成為雜菌的滋生地。易被忽略而未能充分清洗的地方有噴嘴內(nèi)部與取樣管內(nèi)以及罐頂?shù)忍帯?.3.2發(fā)酵罐溶氧電極和PH電極的校正用標(biāo)準(zhǔn)溶液校正電極3.4發(fā)酵罐的滅菌配制發(fā)酵培養(yǎng)基并加入發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌①排氣管為硅膠管,一端裝有過濾裝置，以保證蒸汽能自由出入發(fā)酵罐，同時(shí)不會(huì)出現(xiàn)染菌現(xiàn)象．②取樣口上連接一段硅膠管，在硅膠管上安裝節(jié)流夾，以防止培養(yǎng)基在滅菌時(shí)流出。③裝入發(fā)酵罐容積60％的培養(yǎng)基后，通入高壓蒸汽加熱發(fā)酵罐,在121℃下滅菌20min。當(dāng)滅菌完成后，確認(rèn)排氣口正常后，以0.3-0.5L/min的通氣量通入過濾氣體．接通冷卻水管腳開挽拌在低轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)基的冷卻．3.5接種操作接種是在發(fā)酵罐頂部接種口進(jìn)行。適當(dāng)降低通風(fēng)量，在接種口四周纏繞上經(jīng)酒精浸泡的脫脂棉，點(diǎn)燃后戴上石棉手套,迅速打開接種口，將菌種加入到發(fā)酵罐中，接種量為3％，然后將接種口蓋子在火焰中滅菌后蓋好。在30℃，pH5.0下進(jìn)行，攪拌速度為300rpm。通氣量100L/h.的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。3.6發(fā)酵過程中的補(bǔ)料進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)基的配制滅菌后，用補(bǔ)料瓶進(jìn)行補(bǔ)料，期間要注意無菌操作和要注意蠕動(dòng)泵運(yùn)轉(zhuǎn)中自于硅膠管的彎曲折疊，出現(xiàn)的阻塞現(xiàn)象以及水的滲漏等問題。特別需要注意在一定的階段泡沫有可能大量生成。3.7取樣與分析方法3.7.1還原糖含量的測定還原糖含量測定用的是菲林試劑法。3.7.2氨基氮含量的測定氨基氮含量的測定用的是甲醛滴定法3.7.3菌體濃度的測量用分光光度儀在OD600下測定菌液的吸光度.對于高于1.0的菌液要進(jìn)行稀釋，并進(jìn)行吸光度的測定。此時(shí)菌體密度即為吸收值與稀釋倍數(shù)的乘積。自培養(yǎng)操作開始起，每4h取一次樣。取樣時(shí)將取樣管口流出的最初15mL左右培養(yǎng)液作為廢液，取隨后流出的培養(yǎng)液10mL。3.7.4結(jié)果的整理以時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別以O(shè)D值、氨基氮含量、還原糖含量、pH等為縱坐標(biāo)做圖。3.8發(fā)酵罐的倒灌發(fā)酵過程結(jié)束，需要滅菌后再進(jìn)行罐內(nèi)培養(yǎng)基的處理。處理培養(yǎng)基后進(jìn)行發(fā)酵罐的清洗，保持發(fā)酵罐的干燥和完好。并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的清潔工作。到此實(shí)驗(yàn)結(jié)束。4.結(jié)果與結(jié)論4.1測量數(shù)據(jù)如下表4.1酵母菌高密度培養(yǎng)過程的參數(shù)變化取樣次數(shù)123456789101112時(shí)間0:002:004:006:008:0010:0012:0014:0016:0018:0020:0022:00pH值6.205.615.964.023.903.743.593.463.433.653.933.90OD值0.0000.0740.1700.5080.9321.4281.6402.6794.2124.3134.5205.062氨基氮含量（g/100ml）0.400.220.070.130.140.150.140.120.110.130.140.14還原糖含量(g/100ml)41.3036.0034.8246.3142.2845.3731.2020.132.6083.0873.5423.233備注實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)每隔兩個(gè)小時(shí)取一次樣，補(bǔ)料時(shí)間分別為發(fā)酵開始后6h、5h、4h、4h。OD值最后四個(gè)數(shù)據(jù)稀釋20倍4.2實(shí)驗(yàn)曲線圖及結(jié)果分析 4.2.1OD值分析微生物OD值是反映菌體生長狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，OD是opticaldelnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度。通常400～700nm都是微生物測定的范圍，此時(shí)用的是OD600，需要紫外分光光度計(jì)測最大吸收波長。從圖中看出，OD值隨著時(shí)間在逐漸升高，由此間接測定出菌體濃度在逐漸增大。由于發(fā)酵時(shí)間的縮短，以至于菌體濃度生長曲線不是很完整，只測量到菌體處于對數(shù)生長階段。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后做的鏡檢實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論。在菌體稀釋20倍后做鏡檢，鏡檢結(jié)果顯示菌體鋪滿整個(gè)視野，其中大部分菌體處于出芽生殖階段。圖4.2-1圖4.2-24.2.2氨基氮值分析從圖中看出前期氨基氮含量基本不變，后期氨基氮變化明顯，也正為菌體大量增長需要消耗氨基氮為菌體生長提供原料提供了依據(jù)。4.2.3pH值分析圖中pH數(shù)值不斷下降，是因?yàn)榕囵B(yǎng)過程中，酵母菌有氧呼吸產(chǎn)生大量的二氧化碳溶于培養(yǎng)液后形成碳酸使培養(yǎng)液pH值不斷下降4.2.4還原糖值測定發(fā)酵過程中期還原糖變化不大，但是后期還原糖下降幅度較大，說明培養(yǎng)基內(nèi)還原糖被菌體利用較多，也進(jìn)一步說明菌體濃度的急速增加即以對數(shù)生長方式的快速增值正在進(jìn)行。結(jié)合圖4.2-1中菌體濃度可以得知菌體在發(fā)酵12小時(shí)左右才大量增長，時(shí)間較長的原因是：接種時(shí)接種量較少或接種的種子不在對數(shù)期，進(jìn)而影響到發(fā)酵時(shí)間的延長。5.收獲與致謝課程設(shè)計(jì)是培養(yǎng)學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)，發(fā)現(xiàn)、提出、分析和解決問題，鍛煉實(shí)踐能力的重要環(huán)節(jié)，是對學(xué)生實(shí)際工作能力的具體訓(xùn)練和考察過程。通過這次課程設(shè)計(jì)，讓我更詳細(xì)了解了發(fā)酵工程。這為今后的學(xué)習(xí)和工作都能提供很大的幫助。在這次課程實(shí)習(xí)中，我們精誠合作，積極查找資料，認(rèn)真閱讀文獻(xiàn)，對問題深入探討的同時(shí)，逐步地完善了這個(gè)課程設(shè)計(jì)，彼此