規(guī)?；i場(chǎng)偽狂犬病疫苗凈化措施研究

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)專業(yè)學(xué)位研究生學(xué)位論文論文題目：規(guī)模化豬場(chǎng)偽狂犬病疫苗凈化措施研究學(xué)號(hào)：z2012004研究生：劉勁松專業(yè)學(xué)位（類別）：獸醫(yī)碩士研究方向（領(lǐng)域）：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)所在學(xué)院：動(dòng)物醫(yī)學(xué)院校內(nèi)導(dǎo)師：顏其貴教授校外導(dǎo)師：張紹元高級(jí)獸醫(yī)師提交時(shí)間：2015-10-25四川農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生處制論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，學(xué)位論文中不包含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：2015年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意四川農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。研究生簽名：2015年月日導(dǎo)師簽名:年月日一、文獻(xiàn)綜述1偽狂犬病病原學(xué)豬偽狂犬病(Porcinepseudorabies,PR)又名奧葉茲基病(Aujeszkysdisease，AD)，本病由豬Ⅰ型皰疹病毒引起，是一種急性傳染病，可使多種動(dòng)物發(fā)病，主要發(fā)病癥狀為發(fā)熱、中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙等。1813年，本病首次在美國(guó)的牛群中發(fā)現(xiàn)，后來本病傳播到美洲及歐洲等40余個(gè)地區(qū)和國(guó)家。Aujeszky于1902年證實(shí)本病是由病毒引起的，故名奧葉茲基病，Sabin和Wright于1934年在實(shí)驗(yàn)室確診病原體為Ⅰ型皰疹病毒[1]。本病流行于世界各地，一度對(duì)各國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。自然界中豬和鼠類是病毒的主要貯存宿主和疫源動(dòng)物，豬更是原發(fā)感染宿主、病毒貯存者、長(zhǎng)期排毒者。豬在感染后，日齡不同，其臨床表現(xiàn)癥狀差異很大：哺乳豬多出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和發(fā)熱，有的伴隨腹瀉，病死率可達(dá)80%以上；育肥豬癥狀較輕微，多為隱性感染；懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等繁殖障礙癥狀。通常情況，偽狂病的病死率及嚴(yán)重程度會(huì)隨著豬的日齡增加而降低。自劉永純1948年在我國(guó)首次報(bào)道本病后，目前全國(guó)所有省市基本都流行過本病，本病為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病的二類傳染病，并給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2,3]。1.1病毒基因組偽狂犬病毒（PseudorabiesVirus,PRV）的分類學(xué)名稱是豬皰疹病毒Ⅰ型，病毒粒子為直徑150～180nm的圓形，核衣殼為直徑為105～110nm的二十面體對(duì)稱[3]，病毒粒子主要是由宿主細(xì)胞衍生而來，結(jié)構(gòu)為脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，病毒囊膜為最外層。囊膜表面有長(zhǎng)約8～10nm纖突，呈放射狀排列。病毒核內(nèi)DNA為線狀雙股DNA，大小約150kb，存在形式是高分子質(zhì)量的連環(huán)體，有高達(dá)74.5%的G+C含量，組成部分包括：獨(dú)特短區(qū)段、內(nèi)部重復(fù)序列(IR)、獨(dú)特長(zhǎng)區(qū)段、和末端重復(fù)序列(TR)，結(jié)構(gòu)特征符合皰疹病毒基因組的典型結(jié)構(gòu)。成熟的病毒粒子包含50多種蛋白質(zhì)，約有70～100種蛋白質(zhì)可通過基因組包含的ORF編碼，而這些ORF數(shù)目可超過70個(gè)[4]。多基因協(xié)同控制機(jī)制可影響PRV的毒力，機(jī)制主要包括TK、gI、gD和gE基因，其中TK基因是主要的影響因素，它的活性和PRV的毒力呈正相關(guān)關(guān)系，活性越強(qiáng)，病毒對(duì)宿主的毒力越強(qiáng)。因此，大多制備缺失基因疫苗。1.2病毒蛋白1.2.1病毒結(jié)構(gòu)蛋白通過測(cè)序可發(fā)現(xiàn)，其基因組由72個(gè)閱讀框組成，可編碼70種蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)和命名的有g(shù)B、gG、gH、gC、gE、gN、gK、gD、gL、gI、gMl1種糖蛋白[5]，主要分兩大類：一類是必需糖蛋白，主要包括gD、gB、gL、gH；另一類是非必需糖蛋白，主要包括gC、gG、gE、gK、gI、gN、gM，其中g(shù)G是外分泌蛋白，gD、gC和gE的主要作用是病毒免疫誘導(dǎo)[6]。目前，主要的研究方法在對(duì)糖蛋白上突變株失活株的插入以及失活的研究。當(dāng)今，主要是進(jìn)行構(gòu)建缺失突變株。gD主要作用是：幫助病毒穿透細(xì)胞、介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的穩(wěn)定結(jié)合、病毒黏附細(xì)胞表面耐受肝素。缺失gD基因的毒株，無法在病毒粒子表面合成gD蛋白，無法不可逆吸附在細(xì)胞膜上，無法感染細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，gD蛋白主要作用在病毒的穿透過程，不是病毒在細(xì)胞間傳播過程。同時(shí)gD具有中和保護(hù)能力，可刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗gD抗體，也是PR主要的免疫原性蛋白之一。gC是主要但不是必須糖蛋白。gC在感染細(xì)胞中主要的形式存在為，92ku成熟糖蛋白形式以及具有N-糖基化的74ku前體形式。主要作用包括：結(jié)合肝素樣受體介導(dǎo)吸附作用、介導(dǎo)病毒的釋放以及中和抗原[7]。gE是非必需的，主要控制毒力的大小和病毒的復(fù)制。另外，gE基因促進(jìn)PRV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的擴(kuò)散，因此gE是PRV毒力的主要影響因素，但由于PRV的毒力是受多基因協(xié)調(diào)控制機(jī)制控制的，gE基因缺失的疫苗株往往有一定的毒力[8]。1.2.2病毒非結(jié)構(gòu)蛋白根據(jù)性質(zhì)以及對(duì)毒力的作用，可將這些非結(jié)構(gòu)蛋白分為3類：病毒編碼的與DNA代謝或磷酸化有關(guān)的酶、與病毒裝配有關(guān)的衣殼蛋白以及介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)并擴(kuò)散的囊膜糖蛋白。主要參與完成：宿主細(xì)胞的裂解和病毒的包裝、細(xì)胞出芽、基因調(diào)節(jié)使宿主細(xì)胞的復(fù)制中止以及復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合等。另外，非結(jié)構(gòu)蛋白直接的影響病毒的毒力強(qiáng)弱。編碼胸苷激酶（TK）基因是在PRV中首先發(fā)現(xiàn)的，與毒力有關(guān)的基因，主要對(duì)毒力和持續(xù)感染有重要影響，呈正相關(guān)關(guān)系[9]。因此，通過改造PRV的基因組，獲得TK基因變異株，具有重要意義。此外，由于插入有PK的突變株，會(huì)使得毒力有明顯的變化，認(rèn)為影響病毒毒力的另一基因是蛋白激酶PK基因。研究表明，PK酶活性不是主要影響病毒復(fù)制的因素，但它有可能通過對(duì)體外一個(gè)主要的磷酸蛋白磷酸化來有效促進(jìn)組織培養(yǎng)中的病毒生長(zhǎng)。1.3培養(yǎng)特性PRV的血清型唯一，不同點(diǎn)主要體現(xiàn)在毒力和生物學(xué)特征等方面。病毒可在雞胚和細(xì)胞中培育。病毒具有泛嗜性，能在多種組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖，其中以兔腎和豬腎細(xì)胞(包括原I代細(xì)胞和傳代細(xì)胞系)最易引起明顯的細(xì)胞病變，表現(xiàn)為：細(xì)胞腫脹變圓，開始呈散在的灶狀，隨后逐漸擴(kuò)展，直至全部細(xì)胞圓縮脫落，同時(shí)有大量多核巨細(xì)胞形成[10]。當(dāng)接種量大時(shí)，細(xì)胞可在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)典型病變。最早的病毒增殖和傳代的方法是接種到雞胚絨毛尿囊膜上，但雞胚不是偽狂犬病毒的敏感培養(yǎng)組織。也可用其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)[11]，常采用抵抗力較成年鼠低的1日齡小鼠培養(yǎng)，也可用兔組織代替[12]。1.4抵抗力偽狂犬病毒對(duì)外界環(huán)境如低溫、干燥抵抗力較強(qiáng)。在污染的豬舍及雜物上能存活30天左右，肉中可存活5W以上，3%的來蘇兒，2%的火堿能很快殺死病毒，常用消毒劑及紫外線照射可殺滅病毒，對(duì)甲醛、石炭酸及脂溶性有機(jī)溶劑如氯仿、乙醚等較敏感[13]。2偽狂犬病流行病學(xué)2.1傳染源豬和鼠類為本病毒的貯存宿主，其他哺乳動(dòng)物的感染和接觸患病的豬、鼠相關(guān)。感染豬可垂直和水平傳播本病，并不斷排毒，造成豬群循環(huán)感染，是本病流行時(shí)間長(zhǎng)、短時(shí)間較難清除的主要原因。2.2傳播途徑豬場(chǎng)中，病豬及帶毒豬、污染的物品及接觸疫源的人員在本病的流行中起著媒介作用。經(jīng)現(xiàn)在研究，空氣傳播為本病的主要傳播途徑，牛、羊在發(fā)病豬場(chǎng)附近放牧曾發(fā)生過感染本病的報(bào)道。在豬群中病毒主要通過豬的鼻分泌物、接觸疫源的人員、污染病原的飼料、飲水等物品傳播。有報(bào)道，感染本病的種豬的精液和乳汁也能傳播本病。2.3易感動(dòng)物偽狂犬病毒可發(fā)生于多種哺乳動(dòng)物和鳥類，本病毒廣泛分布世界各地。本易感動(dòng)物種類較多，如：豬、羊、犬、馬、貓、兔、貂、狐、鼠及多種野生物。人類感染本病毒的報(bào)道較少，但世界各地都有零星的報(bào)告：如土耳其、波蘭、歐洲和我國(guó)臺(tái)灣都曾有報(bào)道的案例。2.4流行特點(diǎn)本病能發(fā)生垂直傳播，通過母豬，胎兒及所生仔豬可發(fā)生感染，病毒豬群之間通過接觸、空氣及污染物可發(fā)生水平傳播，造成本病流行時(shí)間長(zhǎng)、清除困難。本病的發(fā)病率與死亡率與日齡呈負(fù)相關(guān)，即日齡越小病死率越高，日齡越大病死率越低。本病一年四季都可能發(fā)生，但多在發(fā)生在寒冷的冬春季節(jié)。豬場(chǎng)生物安全措施不到位，飼養(yǎng)流程管理混亂，環(huán)境衛(wèi)生差，預(yù)防保健疫苗免疫不到位、各種應(yīng)激因素都容易誘發(fā)本病。3偽狂犬病臨床癥狀該病對(duì)豬的危害最為嚴(yán)重，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死白胎或木乃伊胎等；公豬睪丸萎縮、陰囊水腫、出現(xiàn)死精、無精等無法使用而淘汰；哺乳仔豬病死率極高、多出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、高熱、呼吸困難及少部分發(fā)生腹瀉；育肥豬一般呈不表現(xiàn)癥狀的隱性感染；母豬多表現(xiàn)繁殖障礙癥狀：流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎及死胎，并且母豬流產(chǎn)后會(huì)發(fā)生屢配不孕的現(xiàn)象，多會(huì)持續(xù)半年時(shí)間；種公豬感染后會(huì)出現(xiàn)陰囊炎、睪丸炎，從而出現(xiàn)死精、無精、精子活力低、畸形率高而無法正常使用。本病還會(huì)造成免疫抑制現(xiàn)象，造成其它疫苗免疫失敗，同時(shí)增加其它疫病的易感性，造成混合感染，增加豬病的復(fù)雜性與豬群的病死率。3.1乳豬臨床癥狀乳豬感染本病后，因日齡不同，癥狀與病死率差異較大。1周以內(nèi)的病死率可達(dá)100%；多表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、吐白色泡沫、嗜睡、眼瞼發(fā)紅腫脹，體溫40℃～42℃，多數(shù)在41℃左右，聽到刺激聲可出現(xiàn)倒地尖叫、抽搐等。豬可出現(xiàn)眼瞼、嘴角、頜下水腫。腹部皮現(xiàn)出現(xiàn)米粒大小不一的紫色斑點(diǎn)，嚴(yán)重呈全身敗血癥狀，豬只站立不穩(wěn)，共濟(jì)失調(diào)，角弓反張，持續(xù)時(shí)間4到10分鐘。病情最短為幾小時(shí)，最長(zhǎng)5~7天。出現(xiàn)典型神經(jīng)癥狀與拉黃色稀便的豬只，多預(yù)示預(yù)后不良，少數(shù)耐過豬只多為僵豬。3.2仔豬臨床癥狀仔豬臨床表現(xiàn)癥狀與乳豬相似，但癥狀要輕得多，發(fā)病率20%到40%，死亡率10%到20%不等?；疾∽胸i多出現(xiàn)尖叫、站立不穩(wěn)、口吐白沫等明顯的神經(jīng)癥狀，后期多表現(xiàn)為嗜睡，急性病例多24~48h死亡，一般多3到5天死亡。耐過豬常出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育受阻而變?yōu)榻┴i。3.3中豬臨床癥狀2月齡以上的豬只多為隱性感染而臨床癥狀輕微，低熱、結(jié)膜潮紅、流鼻涕、有的鼻液呈膿性；有些表現(xiàn)為咳嗽、精神萎靡不振，有的呈犬坐勢(shì)呼吸，大多采食量下降，部分出現(xiàn)拉黃色稀便及嘔吐，大部分豬只在7天左右可以康復(fù)，嚴(yán)重者病情可長(zhǎng)達(dá)至20天左右。若表現(xiàn)僵直、驚厥、行走困難、共濟(jì)失調(diào)、間歇性倒地后四肢痙攣等神經(jīng)癥狀，常預(yù)示著預(yù)后不良。3.4母豬臨床癥狀3.4.1懷孕母豬懷孕母豬多表現(xiàn)為繁殖障礙癥狀，分娩延遲或提前無規(guī)律，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、活仔弱仔居多，初生重小，流產(chǎn)后不發(fā)情或?qū)遗洳辉械?。母豬發(fā)病沒有明顯的季節(jié)性，便以天氣較冷的冬春季多發(fā)，極少數(shù)懷孕母豬也可能發(fā)生死亡。3.4.2空懷母豬空懷母豬多癥狀不明顯，有部分出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、便秘、采食量減少等，也有個(gè)別的出現(xiàn)敗血癥狀。也有的體溫持續(xù)在40℃～42℃之間，最后衰竭死亡。感染母豬屢配不孕，返情率增高。3.5公豬臨床癥狀公豬臨床上多表現(xiàn)為隱性感染，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)睪丸炎、陰囊積液，精液可能帶毒，檢測(cè)精液出現(xiàn)無精、死精或精從活力低下，無法種用而淘汰4偽狂犬病病理變化感染偽狂犬病毒而流產(chǎn)的母豬，主要發(fā)生胎盤炎。流產(chǎn)胎兒全身淋巴結(jié)可出現(xiàn)壞死；急性死亡的乳豬，扁桃體有壞死灶，喉頭有白色纖維素性偽膜，喉粘膜有出針尖狀的出血點(diǎn)；肺部有水腫、有散在小的壞死點(diǎn)與出血點(diǎn)、有的呈小葉性肺炎；腦膜有充血、水腫現(xiàn)象，腦膜下大量積液；胃、腸、膀胱粘膜有充血出血現(xiàn)象；有些病豬會(huì)出現(xiàn)結(jié)膜炎癥狀；肝、脾有大小不一的白色壞死灶，腎臟表面有針尖狀出血點(diǎn)。組織學(xué)病變主要是：中樞神經(jīng)系統(tǒng)的彌散性非化膿性腦膜腦炎及神經(jīng)節(jié)炎，有明顯的血管套及彌散性局部膠質(zhì)細(xì)胞壞死。5偽狂犬病診斷方法5.1臨床診斷根據(jù)本病的臨床癥狀，結(jié)合流行病學(xué)，可做出初步鑒別診斷，確診必須依據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷。5.2實(shí)驗(yàn)室診斷5.2.1病毒分離通過實(shí)驗(yàn)室分離鑒定到偽狂犬病病毒是確診本病準(zhǔn)確的方法。病料多采集病豬的扁桃體、腦組織，病料處理后接種于豬、倉鼠腎傳細(xì)胞或雞胚成纖維細(xì)胞上，進(jìn)行接種培養(yǎng)鑒定。無法進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，可將病料接種在家兔了身上，家兔會(huì)出現(xiàn)劇癢癥狀。通過實(shí)驗(yàn)室分離到病毒后用中和試驗(yàn)以確診本病[14]。5.2.2血清學(xué)診斷啃檢測(cè)偽狂犬血清抗體的方法主要有：列為國(guó)際貿(mào)易中抗體檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、血清中和試驗(yàn)(SNT)、瓊脂免疫擴(kuò)散、乳膠凝集試驗(yàn)等。王隆柏等[15]推薦經(jīng)典中和試驗(yàn)檢測(cè)豬血清中PRV中和抗體，該方法耗時(shí)長(zhǎng)(72h以上)，但可靠性高、靈敏度高，特異性強(qiáng)，適合于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。5.2.3免疫熒光抗體試驗(yàn)Stewart等首先應(yīng)用熒光抗體染色法檢查病毒和病料接種的豬腎傳PK-15培養(yǎng)物，取得了成功。AllanGM等建立了檢測(cè)PRV實(shí)驗(yàn)感染豬和自然感染豬腦及咽喉的間接免疫熒光技術(shù)，可在取得病料2小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果，病毒抗原最低檢出量為101.3TCID50/g的腦壓印片。Sabo等建立了豬臟器冰凍切片的直接FA技術(shù)，腦組織中病毒抗原的最小檢出量為104.5TCID50/g。5.2.4組織切片組織切片熒光抗體檢測(cè)法：取病豬腦或扁桃體的冰凍切片或壓片，用直接免疫熒光檢測(cè)，在幾小時(shí)就能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。該方法對(duì)于乳仔豬較敏感，對(duì)于成年豬病毒分離效果要敏感些。黃駿明[16]等建立了(FA)技術(shù)，取病豬腦組織，作冰凍切片進(jìn)行FA檢查，可直接檢測(cè)出試驗(yàn)感染、組織培養(yǎng)及自然感染病料中的PRV，能在2h內(nèi)得到結(jié)果，現(xiàn)場(chǎng)偽狂犬病的診斷非常實(shí)用。5.2.5PCRPCR檢測(cè)豬偽狂犬病病毒，利用PCR可從患病動(dòng)物的組織病料或分泌物中擴(kuò)增豬偽狂犬病病毒的基因，確診本病。PCR方法能進(jìn)行活體采樣，同時(shí)可進(jìn)行大批量的樣本檢測(cè)，具有敏感、快速特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，特別適合于臨床診斷。田云[17]等根據(jù)偽狂犬病毒的gE基因的特點(diǎn)，建立了PRV野毒的熒光定量PCR方法。該方法可以區(qū)分疫苗毒與野毒感染，對(duì)于豬場(chǎng)偽狂犬病的凈化提供了一種有效的檢測(cè)方法。楊雪[18]等建立了一種基于偽狂犬病病毒gE基因的檢測(cè)偽狂犬病病毒的PCR方法，能夠檢測(cè)到的最低DNA模板量為10pg。劉園園[19]等根據(jù)偽狂犬病病毒gE基因的保守序列建立了檢測(cè)偽狂犬病病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。李明鳳[20]等利用PCR技術(shù)擴(kuò)增PRVgH基因的187bp片段，建立了SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。Huang[21]等建立了快速檢測(cè)偽狂犬病病毒的多重PCR方法。Lee等[22]建立了檢測(cè)豬偽狂犬病病毒、圓環(huán)病毒的多重PCR方法。Yue等[23]建立了檢測(cè)豬細(xì)小病毒、藍(lán)耳病毒、偽狂犬病病毒臨床樣品的多重PCR方法。這些方法都可用于偽狂犬病的凈化檢測(cè)。5.2.6核酸探針診斷郭萬柱[24]等用斑點(diǎn)雜交法，能檢測(cè)到10pg的PRV-DNA，且有很高的準(zhǔn)確性。Brown等建立了檢測(cè)感染豬體內(nèi)PRV-DNA的原位雜交法。Mase等用生物素和地高辛標(biāo)記探針技術(shù)、魏偉等用光敏生物素標(biāo)記PRV特異性糖蛋白GP50克隆重組顆粒PUP作為探針都能有效地檢測(cè)偽狂犬病毒。證明通過PCR和分子克隆技術(shù)制備的PRV特異性糖蛋白基因片段的光敏生物探針能有效地用于檢測(cè)偽狂犬病。5.2.7LAMP診斷Fang等[25]根據(jù)PRV的DNA結(jié)合蛋白DBP基因設(shè)計(jì)引物，建立了最低可檢測(cè)DNA的含量為10fg的檢測(cè)方法。楊睿等[26]根據(jù)PRVgE基因的保守序列設(shè)計(jì)4條引物，建立了偽狂犬病病毒LAMP檢測(cè)方法。該方法特異性，靈敏度為普通PCR的100倍，最低可檢測(cè)出質(zhì)量濃度為6.2×10-9g/mL的病毒DNA，并且該方法僅用時(shí)40分鐘左右。5.2.8鑒別診斷本病母豬易發(fā)生繁殖障礙，臨床上注意與藍(lán)耳病、乙腦、細(xì)小、豬瘟、布病、弓形體病相區(qū)別。6偽狂犬疫苗及免疫程序6.1疫苗由于部分豬場(chǎng)對(duì)疫苗免疫的重視不夠，加上豬只流動(dòng)頻繁，免疫程序不科學(xué)等原因，造成偽狂犬病仍在流行。我國(guó)偽狂犬疫苗生產(chǎn)廠家較多，有活苗與滅活苗兩種。單純就免疫效價(jià)來說弱毒苗優(yōu)于滅活苗。滅活疫苗雖能激發(fā)比弱毒疫苗更高的抗體，但據(jù)抗體水平的高低來判斷疫苗的效價(jià)是不夠全面的。因?yàn)闄C(jī)體有多種免疫機(jī)制抵抗病毒的感染，主要有細(xì)胞免疫、體液免疫、干擾素、局部免疫和超感染占位競(jìng)爭(zhēng)等。弱毒疫苗能激發(fā)機(jī)體多種免疫機(jī)制對(duì)機(jī)體提供全面而迅速的保護(hù)。體液免疫在中和病毒方面作用重大，但有有其缺點(diǎn)，免疫效果受其到達(dá)部位的限制，這就需要依賴于細(xì)胞免疫和其它免疫機(jī)制來協(xié)作。一般來說，細(xì)胞免疫在抗病毒感染中占最重要的地位，但起效較慢，但體液免疫及其它免疫起效十分快，因此弱毒疫苗多用于緊急免疫接種。近年來研究和開發(fā)的趨勢(shì)主要是發(fā)展基因工程弱毒疫苗。6.1.1基因工程缺失疫苗通過基因工程技術(shù)，插入或切除一段序列，使得PRV的基因不能完全表達(dá)，減弱PRV的毒性但不改變它的免疫原性。一些糖蛋白（gG、gE、gC、gD）、胸苷激酶和蛋白激酶等是主要的缺失目標(biāo)。目前，已經(jīng)構(gòu)建了多種缺失疫苗。1986年，由Kit等[27]制成被美國(guó)批準(zhǔn)為上市的第1個(gè)基因工程疫苗。該毒株是在BUK株作用下缺失148bp的TK基因，它對(duì)鼠和兔的毒力致弱但同時(shí)又保持其較強(qiáng)的免疫原性，可抵抗強(qiáng)毒，縮短強(qiáng)毒排出時(shí)間。Marchioli等[28]構(gòu)建的TK－/gG－雙基因缺失株，包括缺失276bp的TK基因和缺失gG的基因。接種動(dòng)物后，結(jié)果表明不適合接種犬、貓、牛，但接種小鼠和豬后，可產(chǎn)生較好的免疫性。Quint等[29]和Vanoirschot等[30]分別構(gòu)建了不同親本的TK－/gE－雙基因缺失株，該疫苗接種的豬有較強(qiáng)的抵抗力。陳煥春[31]等篩選獲得的TK－/gE－/LacZ+基因缺失株，不會(huì)返強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定。接種不同日齡的豬后，用gE－ELISA檢測(cè)，免疫效果較為明顯。接種疫苗后的動(dòng)物，在試驗(yàn)期內(nèi)均表現(xiàn)正常。顯示生物安全性極高，可用于病毒的防制。6.1.2亞單位疫苗亞單位疫苗是高效表達(dá)病原保護(hù)性抗原基因的疫苗，利用基因工程方法制成。亞單位疫苗為結(jié)構(gòu)蛋白，目前發(fā)現(xiàn)，機(jī)體中糖蛋白中的gB、gC、gD均產(chǎn)生中和抗體，這些抗體無論在任何情況下都有中和病毒的能力。因此gB、gC、gD是研制的首選糖蛋白。Marchioli等在以pSV-DHFR為載體的人巨細(xì)胞病毒（HCMV）中，在立即早期啟動(dòng)子的下游插入克隆的PRV保護(hù)性抗原基因gD，然后在中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中轉(zhuǎn)入，通過氨喋呤，篩選出1株細(xì)胞株，可以表達(dá)gD蛋白的CHOgD-17，擴(kuò)大培養(yǎng)后，得到表達(dá)產(chǎn)物配，免疫豬經(jīng)鼻內(nèi)接種，可使得免疫豬產(chǎn)生抗體，增強(qiáng)抵抗力。陳振海等[32]得到的純的高效價(jià)Adv-gC病毒液，此重組病毒通過間接免疫熒光試驗(yàn)證明，可以表達(dá)PRVgC蛋白，對(duì)免疫BALB/c小鼠進(jìn)行肌肉注射，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。攻毒試驗(yàn)表明，此重組病毒能提供100%的免疫保護(hù)。6.1.3DNA疫苗DNA疫苗（核酸疫苗），宿主細(xì)胞吸收直接接種的細(xì)菌免疫原性基因和有病毒的質(zhì)粒。在細(xì)胞中，免疫原性基因表達(dá)，病毒抗原合成，機(jī)體的免疫應(yīng)答被激活。Gerdts等[33]構(gòu)建了DNA疫苗。PRV-75V19毒株的毒力可完全被表達(dá)gC的核酸疫苗抵抗，部分接種豬能抵抗強(qiáng)毒NIA-3株，但PRV強(qiáng)毒株可繼續(xù)攻擊接種表達(dá)gD的核酸疫苗的豬。肌肉或皮下注射3次1μg的gC核酸疫苗，抗gC的抗體能在血清中檢測(cè)到，部分注射后的豬可以對(duì)NIA-3產(chǎn)生抵抗，以及特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。6.2免疫程序6.2.1初生仔豬免疫程序PRV可感染各種年齡的豬，本病可在豬群中可水平傳播與垂直傳播[34]。并且我國(guó)多數(shù)的豬場(chǎng)未采取分點(diǎn)式飼養(yǎng)，豬場(chǎng)生物安全制度措施不完善、免疫程序設(shè)計(jì)不合理、從業(yè)人員整體素質(zhì)不高，造成偽狂犬病毒在豬群之間、豬場(chǎng)之間不斷傳播[35]。本病造成損失的大小與豬場(chǎng)的管理狀況與疫苗免疫水平有很大的相關(guān)性。國(guó)外研究表明，母豬免疫狀況良好，母源抗體對(duì)仔豬保護(hù)能達(dá)到8W～14W，我國(guó)測(cè)定的母源抗體保護(hù)的時(shí)間多為8~10周。仔豬超前免疫：一般都是乳豬出生后立即進(jìn)行滴鼻免疫，免疫后1~2小時(shí)吃初乳。這種方式可以有效地阻斷野毒的感染，但母源抗體會(huì)影響疫苗的效果。二免時(shí)間的確定：現(xiàn)在多是根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)仔豬的抗體水平而確定一般在70日齡左右，原因有二：首先，仔豬此時(shí)已斷奶20d以上，已渡過了對(duì)應(yīng)激很敏感的斷奶期，并適應(yīng)的飼新的飼養(yǎng)方式和環(huán)境，此時(shí)免疫疫苗，應(yīng)激相應(yīng)較小；再者，由于存在免疫記憶機(jī)制，免疫后會(huì)迅速地產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，抗體約在70日齡前達(dá)到高峰，產(chǎn)生可靠的免疫保護(hù)力(疫苗免疫有效保護(hù)期約為4個(gè)月左右)，并一直維持到仔豬的育肥期結(jié)束。6.2.2仔豬及商品豬免疫程序(0/70模式)超前免疫程序：仔豬出生后立即用偽狂犬基因缺失苗滴鼻，每個(gè)鼻孔0.5ml，頸部肌肉注射1ml[36]，接種后1.5～2h后食初乳。二免程序：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗體水平情況決定二免日齡，一般多在70天左右,每頭仔豬頸部肌注射1頭份。6.2.3種豬免疫程序免疫母豬一是為了使母豬免受偽狂犬野毒的感染，同時(shí)要讓仔豬從母乳中獲得較高的母源抗體。感染上野毒的母豬會(huì)長(zhǎng)期帶毒與排毒，免疫感染過的母豬能縮短其帶毒與排毒的時(shí)間，將有助于控制疫情的擴(kuò)散。母豬一般是在配種前與產(chǎn)前各免疫一次，公豬每年免疫接種4次。孫建華，宋迎春[37]在未曾發(fā)生過豬偽狂犬病的豬場(chǎng)，針對(duì)一起免疫偽狂犬疫苗而發(fā)生流產(chǎn)的案例得到了的車結(jié)論可以看出，對(duì)妊娠母豬的免疫一定要慎重。妊娠母豬接種PRV疫苗后較短的時(shí)間內(nèi)會(huì)產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，但也會(huì)出現(xiàn)短時(shí)間的排毒。為了防止病毒水平傳播，建立定期檢測(cè)制度，淘汰陽性豬只，這樣最終才能建立偽狂犬病陰性群。6.3免疫注意事項(xiàng)豬群免疫前必須先做免疫監(jiān)測(cè)，否則極易對(duì)豬場(chǎng)造損失，并且會(huì)存在潛在危險(xiǎn)。疫苗都是在豬群健康的情況下接種才會(huì)起到保護(hù)作用，而實(shí)際生產(chǎn)中，豬群的亞臨床狀態(tài)不易發(fā)現(xiàn)。不進(jìn)行檢測(cè)免疫，豬只的抗體干擾和免疫抑制會(huì)使疫苗免疫效果降低[38]。從理論上來講，一個(gè)豬場(chǎng)接種不同基因缺失的活疫苗，可發(fā)生基因重組的風(fēng)險(xiǎn)，但是在生產(chǎn)實(shí)踐中還未發(fā)現(xiàn)這種情況的發(fā)生。在條件允許的情況下盡可能地一個(gè)豬場(chǎng)只使用一種弱毒苗。在針對(duì)偽狂犬病的防控方面，要定期檢測(cè)豬群，淘汰陽性豬只，并執(zhí)行合理的免疫程序讓種豬群長(zhǎng)期保持偽狂犬病野毒陰性[39]。一定要做到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)豬群的抗體水平。7我國(guó)豬偽狂犬病的流行現(xiàn)狀7.1豬偽狂犬病流行情況我國(guó)曾于2000年左右暴發(fā)過大面積偽狂犬病疫情，隨著科技的發(fā)展、檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，通過疫苗免疫、檢測(cè)淘汰陽性豬只，成功的在部分地區(qū)的豬場(chǎng)實(shí)現(xiàn)了偽狂犬病的凈化。2012年冬天起，山東、河南、河北等地都有發(fā)生豬偽狂犬病案例的報(bào)道，具體情況如下：發(fā)病豬群表現(xiàn)明顯的偽狂犬病臨床癥狀，部分場(chǎng)的野毒陽性率升高，甚至100%，有的呈爆發(fā)性流行，有的僅表現(xiàn)亞臨床癥狀，部分豬場(chǎng)gB抗體陽性率偏低。發(fā)病豬群主要表現(xiàn)為10日齡以上哺乳仔豬出現(xiàn)頑固性腹瀉、個(gè)別仔豬有嘔吐或神經(jīng)癥狀，病死率60%-70%；保育豬、肥育豬表現(xiàn)呼吸道癥狀、長(zhǎng)長(zhǎng)緩慢，病死率10%-30%左右不等。解剖癥狀主要為：淋巴結(jié)呈廣泛性水腫、腎與肺有小出血點(diǎn)、用脾臟及扁桃體都有壞死灶。通過病料送檢，經(jīng)PCR鑒定確診為偽狂犬病病毒陽性。豬群表現(xiàn)偽狂犬病的臨床癥狀后，全群進(jìn)行偽狂犬疫苗緊急免疫接種，很快就能控制病情，一般2周左右恢復(fù)正常。7.2豬偽狂犬病疫情上升的主要原因7.2.1頻繁引種豬場(chǎng)引種頻繁：由于生產(chǎn)條件的限制，部分豬場(chǎng)無法培育足夠數(shù)量的后備種豬，或無法培育后備種豬，根據(jù)生產(chǎn)的需要，淘汰生產(chǎn)成績(jī)不好的種豬，引進(jìn)新的后備種豬成為必須，而且大部分豬場(chǎng)未對(duì)引入的后備種豬進(jìn)行偽狂犬野毒的檢測(cè)，造成疫病的引入。7.2.2偽狂犬病疫苗免疫松懈免疫程序不規(guī)范：由于近年來養(yǎng)豬行情不是特別好，為了節(jié)省費(fèi)用，部分豬場(chǎng)對(duì)偽狂犬疫苗，只免疫種豬不免疫商品豬。未免疫疫苗的豬只成了病毒的“保種基地”。部分豬場(chǎng)免疫程序不合理，造成漏免或豬群抗體水平不整齊，而造成豬群發(fā)病。7.2.3不重視生物安全措施部分豬場(chǎng)生產(chǎn)管理混亂、生物安全制度落實(shí)不到位，消毒工作是應(yīng)付，導(dǎo)致外源性感染。場(chǎng)內(nèi)未進(jìn)行有效地滅鼠，部分場(chǎng)還飼養(yǎng)了犬、貓等寵物。7.2.4返飼自家苗導(dǎo)致了種豬帶毒率增高2011年冬季以來，我國(guó)大面積流行傳染性胃腸炎、流行性腹瀉，疫情不易控制。部分豬使用病料如小腸及內(nèi)容物、稀便等返飼懷孕母豬，若病料中含有PRV將會(huì)造成疫病的感染，部分豬場(chǎng)取小豬的病料做“自家苗”滅活不完全也極易造成偽狂犬病的流行。7.3當(dāng)前豬偽狂犬病的防控狀況據(jù)報(bào)道，2012年分離到PR具有某種變異，但是現(xiàn)有的疫苗仍能有效地控制病情。證明加強(qiáng)疫苗免疫，仍是控制本病的重要手段。7.4當(dāng)前豬偽狂犬病的防控和凈化方案7.4.1良好的生物安全措施是前提良好的生物安全措施是控制本病的前提：豬場(chǎng)人員、物品、車輛的進(jìn)出應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，生產(chǎn)區(qū)與生活區(qū)分開，并定期進(jìn)行消毒。場(chǎng)內(nèi)禁止飼養(yǎng)其他動(dòng)物、定期滅鼠。制訂嚴(yán)格的引種計(jì)劃，定點(diǎn)引種，引種后進(jìn)行隔離30天以上，并對(duì)所引的種豬進(jìn)行全群檢測(cè)，淘汰偽狂犬野毒陽性豬只，隔離結(jié)束后，檢測(cè)全為陰性的豬只才能入群。7.4.2科學(xué)飼養(yǎng)管理是基礎(chǔ)保證豬舍內(nèi)空氣質(zhì)量，注意保溫與通風(fēng)，合理的飼養(yǎng)密度，實(shí)行全進(jìn)全出制度，控制豬舍內(nèi)環(huán)境溫濕度，讓不同的豬只生活在溫、濕度適宜的豬舍。采取綜合措施降低對(duì)豬只的各種應(yīng)激。7.4.3疫苗有效免疫接種是控制凈化該病的重要措施通過有效地免疫疫苗，可預(yù)防本病導(dǎo)致的仔豬感染死亡和母豬繁殖障礙癥狀，縮短排毒時(shí)間與減少排毒量，控制疫情的繼續(xù)發(fā)展，降低死淘損失。種豬每年免疫4次。商品豬一般多按照“0~70”模式，即初生滴鼻、70日齡左右肌注。每季度進(jìn)行一次疫苗抗體（gB）檢測(cè)，對(duì)疫苗抗檢測(cè)陰性豬補(bǔ)注疫苗，以提高抗體水平。7.4.4果斷淘汰檢測(cè)陽性豬是凈化本病的關(guān)鍵豬場(chǎng)偽狂犬凈化最大障礙是豬場(chǎng)存在患病豬只和隱性感染者。對(duì)于需要凈化的場(chǎng)，每年進(jìn)行3~4次野毒抗體各疫苗抗體檢測(cè)，抽樣檢測(cè)的方法為：種母豬按照10~15%比例，種公豬及后備種豬全部抽檢，商品豬按5~10%比例抽檢，有繁殖障礙的種豬全部抽檢。對(duì)檢測(cè)出野毒陽性的豬只，全部淘汰，疫苗抗體陰性豬重新免疫一次疫苗，再次檢測(cè)，合格者留下，不合格者淘汰。綜上所述，嚴(yán)格的生物安全措施，嚴(yán)格控制引種，檢測(cè)和淘汰陽性種豬、制訂科學(xué)的免疫程序，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，選用優(yōu)質(zhì)高效的疫苗免疫等是控制和凈化偽狂犬病的的必須考慮的。8凈化研究現(xiàn)狀本病為全球養(yǎng)豬業(yè)重要的傳染病之一，也是我國(guó)的二類傳染病。許多國(guó)家采取多種措施進(jìn)行防控，經(jīng)濟(jì)和養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家都投入巨大進(jìn)行凈化方案的研究與實(shí)施。20世紀(jì)初歐洲確診本病后，高度重視，20世界前半葉本病流行于東歐及巴爾干半島，20世紀(jì)后半葉，本病由于毒力增強(qiáng)在西歐多次爆發(fā)。由于當(dāng)時(shí)技術(shù)限制，較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)只有滅活疫苗，無法區(qū)分野毒與疫苗毒，對(duì)凈化無從下手。后來研制出基因缺失苗，才使凈化成為可能。目前，現(xiàn)行的主要商品化的偽狂犬疫苗為：基因缺失弱毒苗與滅活苗?；驕缁蠲缬捎谄浯_診的免疫效果，占很大的市場(chǎng)占有率，在歐美及我國(guó)應(yīng)用較多；滅活苗由于不存在排疫苗毒的問題，安全性相當(dāng)高，但其免疫效力次于弱毒苗[40]。一些國(guó)家和地方利用基因缺失苗成功地凈化了本病。8.1歐洲各國(guó)的凈化方案各國(guó)采用的凈化方案都是結(jié)合自身國(guó)情，量身訂制的。英國(guó)采取的是撲殺與隔離、嚴(yán)格執(zhí)行合群檢測(cè)來實(shí)施凈化，在上世紀(jì)80上代末成功凈化本病[41]，荷蘭、比利時(shí)等國(guó)也基本成功凈化了本病，1990年開始，法國(guó)政府強(qiáng)行在全國(guó)推行本病的凈化計(jì)劃，根據(jù)不同區(qū)域制訂不同的凈化策略，經(jīng)過近6年時(shí)間，54%豬場(chǎng)達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)，其他豬場(chǎng)或區(qū)域豬群的感染率呈下降趨勢(shì)。8.2美國(guó)的凈化方案從1998年開始，美國(guó)用15年時(shí)間成功凈化本病，采用的方法為免疫基因工程缺失苗結(jié)合血清學(xué)檢測(cè)方法。凈化計(jì)劃主要分為五個(gè)階段：第一階段：1989～1998年，建立實(shí)施根除偽狂犬病項(xiàng)目(PseudorabiesEradicationProgram)。首先對(duì)豬群進(jìn)行偽狂犬病野毒檢測(cè)，確定是否作為凈化豬群，然后注射疫苗，再進(jìn)行野毒檢測(cè)，淘汰陽性豬和建立陰性群。第二階段：1999年至2001年，在第一階段基礎(chǔ)上，全群撲殺陽性豬群，防止本病的擴(kuò)散。第三階段：強(qiáng)制撲殺確診感染豬,控制偽狂犬病的流行率在10%以下。第四階段：禁止使用疫苗，執(zhí)行嚴(yán)格的監(jiān)控手段，達(dá)到12個(gè)月內(nèi)不出現(xiàn)新的感染豬群。第五階段：維持野毒陰性群狀態(tài)。8.3國(guó)內(nèi)的凈化方案我國(guó)偽狂犬病根除計(jì)劃由陳煥春[42]等人提出。通過ELISA方法檢測(cè)野毒抗體、淘汰陽性豬只，重復(fù)免疫與檢測(cè)，配合基因缺失疫苗免疫，不斷重復(fù)免疫與檢測(cè)，最終達(dá)到凈化的目標(biāo)。任慶海[43]等人利用ELISA方法檢測(cè)野毒抗體，配合免疫gE基因缺失苗也成功對(duì)豬場(chǎng)實(shí)施了凈化。在經(jīng)過為期1年的的監(jiān)測(cè)和凈化工作成功將山東某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的核心豬群豬偽狂犬病病毒帶毒率由8.82%下降到3.23%，大幅度的提高了該場(chǎng)的生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益，達(dá)到了凈化的目標(biāo)。吳學(xué)敏[44]等也采用類似方法，對(duì)福建不同地區(qū)3個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行凈化，取得一定成效。9.研究目的意義眾所周知，豬場(chǎng)疫病是影響?zhàn)B豬效益的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年我國(guó)生豬死亡率高達(dá)8%-10%，其中因?yàn)閭魅静∫鸬乃劳雎收?0%以上。2012年以來，北方和南方地區(qū)曾大面積暴發(fā)豬偽狂犬病，出現(xiàn)以流產(chǎn)為主的母豬繁殖障礙性疫病，引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)gE抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，野毒抗體陽性率可達(dá)40%以上，表明偽狂犬病廣泛存在于規(guī)?；i場(chǎng)。為此，規(guī)?；i場(chǎng)實(shí)施偽狂犬病的監(jiān)測(cè)及凈化，減少偽狂犬病引起的繁殖障礙性疫病引起的損失，既符合國(guó)家規(guī)劃的要求，也符合養(yǎng)殖業(yè)的實(shí)際需求。本研究選擇具有代表性的養(yǎng)殖模式豬場(chǎng)，即選擇核心豬場(chǎng)和擴(kuò)繁豬場(chǎng)進(jìn)行豬偽狂犬病的凈化實(shí)踐，采用淘汰偽狂犬野毒陽性與疫苗抗體陰性豬只的方法，配合綜合的生物安全措施，實(shí)施豬場(chǎng)偽狂犬病的凈化，以維持原種豬和二元種豬的偽狂犬病陰性，以提供偽狂犬病陰性種豬。二、試驗(yàn)研究部分1材料1.1動(dòng)物本研究供試豬場(chǎng)有4個(gè)，包括1個(gè)核心種豬場(chǎng)、3個(gè)擴(kuò)繁場(chǎng)，存欄基礎(chǔ)母豬4200多頭（完全按周節(jié)律、兩點(diǎn)式生產(chǎn)），種豬與哺乳仔豬、保育豬集中在一點(diǎn)飼養(yǎng)，育肥豬飼養(yǎng)場(chǎng)地置于另一地點(diǎn)。其中，核心種豬一場(chǎng)存欄母豬800余頭，實(shí)行全進(jìn)全出，兩點(diǎn)式、周節(jié)律生產(chǎn)；擴(kuò)繁場(chǎng)一場(chǎng)存欄母豬1000余頭，實(shí)行全進(jìn)全出，兩點(diǎn)式、周節(jié)律生產(chǎn)；擴(kuò)繁二場(chǎng)存欄母豬1200余頭,實(shí)行全進(jìn)全出，兩點(diǎn)式、周節(jié)律生產(chǎn)；擴(kuò)繁三場(chǎng)存欄母豬1200余頭,實(shí)行全進(jìn)全出，兩點(diǎn)式、周節(jié)律生產(chǎn)。1.2試劑與儀器酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司（BioTek），ELX800)。偽狂犬gE試劑盒(批號(hào)：CL456)和gB檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：DL520)，購自北京愛德士元亨生物科技有限公司。2方法2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組核心種豬一場(chǎng)、擴(kuò)繁一場(chǎng)為一組，所用疫苗為進(jìn)口偽狂犬疫苗(西班牙海博萊)；擴(kuò)繁二場(chǎng)、擴(kuò)繁三場(chǎng)為一組，所用偽狂犬疫苗為國(guó)產(chǎn)疫苗。2.2試劑盒使用方法2.2.1gI(gE)檢測(cè)試劑盒使用方法按照試劑盒提供的操作流程進(jìn)行操作。2.2.2gB抗體檢測(cè)試劑盒使用方法按照試劑盒提供的操作流程進(jìn)行操作。2.3凈化具體流程第一步：首先進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，根據(jù)調(diào)查結(jié)果結(jié)合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（偽狂犬野毒gE抗體陽性率≤10%），確定選定的目標(biāo)場(chǎng)能否進(jìn)行偽狂犬病的凈化。第二步：對(duì)確定凈化的目標(biāo)場(chǎng)分組，分批次全群種豬進(jìn)行偽狂犬gE、gB抗體檢測(cè),仔豬進(jìn)行抽樣檢測(cè)。第三步：通過檢測(cè)結(jié)果嚴(yán)格淘汰gE抗體陽性豬，針對(duì)gB抗體陰性豬只進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，免疫后30天再次進(jìn)行g(shù)B抗體檢測(cè),淘汰再次檢測(cè)gB抗體檢測(cè)陰性豬只。第四步：凈化后的監(jiān)測(cè)，通過對(duì)豬場(chǎng)所有種豬的檢測(cè)與淘汰后，留下的種豬群每季度監(jiān)測(cè)一次，并加強(qiáng)綜合防控措施,確定凈化的效果。2.3.1流行病學(xué)調(diào)查對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行偽狂犬病的流行病學(xué)調(diào)查，摸清豬場(chǎng)PRV疫病的情況，采用連續(xù)深層采樣法。樣本采集信息見表1。表1流行病學(xué)調(diào)查的樣本采集及檢測(cè)指標(biāo)豬只類型采樣比例樣本類型檢測(cè)指標(biāo)10-30日齡乳豬每間產(chǎn)房采集1/2總窩數(shù)；1-2頭病弱仔/窩血清PRV抗體55-65日齡仔豬15頭病弱保育仔豬/間保育舍血清PRV抗體165日齡以上的后備豬100%血清PRV抗體妊娠母豬、哺乳母豬15%血清PRV抗體公豬100%血清PRV抗體根據(jù)凈化方案，首先對(duì)選定豬場(chǎng)進(jìn)行PRV的流行病學(xué)調(diào)查，摸清豬場(chǎng)主要疫病的情況，確定豬場(chǎng)是否能進(jìn)行部分疫病的凈化。偽狂犬凈化的基本條件是野毒抗體陽性率≤10%可實(shí)施偽狂犬病的凈化，如野毒陽性率大于＞10%則不進(jìn)行凈化。2.3.1.1經(jīng)產(chǎn)母豬采樣對(duì)場(chǎng)內(nèi)的經(jīng)產(chǎn)母豬采集血樣檢測(cè)偽狂犬病原。采樣比例為全部母豬的15%.采樣母豬局限在中后期妊娠舍，采樣母豬固定在產(chǎn)前70-30天內(nèi)的母豬，產(chǎn)前30天母豬不采樣，以防流產(chǎn)。2.3.1.2后備母豬采樣對(duì)場(chǎng)內(nèi)的后備母豬采血樣檢測(cè)偽狂犬病原。逐頭檢測(cè)，后備種豬暫時(shí)留在隔離舍一個(gè)月，等待兩個(gè)月的檢測(cè)結(jié)果出來之后，一起轉(zhuǎn)入后備舍。2.3.1.3公豬和后備公豬的采樣對(duì)場(chǎng)內(nèi)的公豬和后備公豬的血液、精液要逐頭采樣，逐頭檢測(cè)；精液從現(xiàn)在開始收集，血樣一次采集完成。2.3.1.4經(jīng)產(chǎn)母豬的采樣利用采集的母豬血樣，檢測(cè)母豬偽狂犬抗體（gE）。2.3.1.5產(chǎn)房?jī)?nèi)仔豬的采樣一周之內(nèi)產(chǎn)房有問題的仔豬采集臍帶血和病料，確診病原，明確產(chǎn)房是否發(fā)生的垂直感染。2.3.1.6保育豬的采樣保育豬按每棟抽取15頭病弱豬的血樣。2.3.2能否進(jìn)行偽狂犬病凈化的判定根據(jù)凈化方案，對(duì)選定豬場(chǎng)進(jìn)行主要傳染病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,摸清豬場(chǎng)主要疫病的情況，確定豬場(chǎng)是否能進(jìn)行部分疫病的凈化(本研究只做偽狂犬方面的論述)。偽狂犬凈化的基本條件是野毒(gE)抗體陽性率≤10%可實(shí)施偽狂犬病的凈化，如野毒陽性率大于＞10%則不進(jìn)行凈化(凈化成功機(jī)率不大，凈化成本高，經(jīng)濟(jì)損失大)。2.3.3凈化檢測(cè)前偽狂犬疫苗加強(qiáng)免疫確定能進(jìn)行凈化的豬場(chǎng)，對(duì)所有種豬群選擇高質(zhì)量的gE基因缺失苗(Bartha-K61株)對(duì)種群進(jìn)行1次以上的密集免疫措施，最大限度地減少種豬的排毒和縮排毒時(shí)間，免疫后30天后進(jìn)行采血檢測(cè)。核心一場(chǎng)與擴(kuò)繁一場(chǎng)免疫進(jìn)口的偽狂犬疫苗(（西班牙海博萊生物大藥廠，喜可凈，疫苗中含豬偽狂犬病病毒Bartha—K61株，至少為105.5TCID50/頭份))，擴(kuò)繁二場(chǎng)與擴(kuò)繁三場(chǎng)免疫國(guó)產(chǎn)的偽狂犬疫苗(國(guó)內(nèi)某知名生物制品廠，偽狂犬病病毒gE自然基因缺失毒株（Bartha-k61株病毒含量至少106.0TCID50/頭份)。2.3.4全群種豬分組由于四個(gè)種豬場(chǎng)所處的地理位置、生產(chǎn)的軟硬件設(shè)施、種豬群的健康狀況、生物安全措施等不一致。為了驗(yàn)證豬偽狂犬病凈化措施與方案具有普遍性與可復(fù)制性，也為了尋找經(jīng)濟(jì)實(shí)用的豬偽狂犬疫苗。根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況，對(duì)種豬場(chǎng)進(jìn)行分組凈化，其中核心一場(chǎng)與擴(kuò)繁一場(chǎng)采用國(guó)外的豬偽狂犬疫苗(西班牙海博萊)；擴(kuò)繁二場(chǎng)與擴(kuò)繁三場(chǎng)采用國(guó)產(chǎn)豬偽狂犬疫苗進(jìn)行對(duì)照。2.3.4.1海博萊疫苗免疫組核心種豬一場(chǎng)存欄母豬800余頭；擴(kuò)繁場(chǎng)一場(chǎng)存欄母豬1000余頭。兩個(gè)豬場(chǎng)都實(shí)行按周節(jié)律、兩點(diǎn)式的全進(jìn)全出生產(chǎn)模式。核心一場(chǎng)生產(chǎn)軟硬件設(shè)施較好，為國(guó)家級(jí)的核心育種場(chǎng)，擴(kuò)繁一場(chǎng)為新建的擴(kuò)繁場(chǎng)。本組使用西班牙海博萊的偽狂犬基因缺失疫苗(BarthaK61株)—喜可凈。2.3.4.2國(guó)產(chǎn)疫苗免疫組擴(kuò)繁二場(chǎng)存欄母豬1200余頭；擴(kuò)繁三場(chǎng)存欄母豬1200余頭。兩個(gè)豬場(chǎng)都實(shí)行按周節(jié)律、兩點(diǎn)式的全進(jìn)全出生產(chǎn)模式。本組兩個(gè)場(chǎng)建場(chǎng)較早，生產(chǎn)軟硬件設(shè)施遜于核心一場(chǎng)與擴(kuò)繁一場(chǎng)。本組使用國(guó)產(chǎn)疫苗基因缺失苗(Bartha-K61株)。2.3.5凈化方確定后的豬場(chǎng)偽狂犬疫苗免疫程序流行病學(xué)調(diào)查結(jié)束后，對(duì)符合凈化基本要求的，參與本研究的場(chǎng)的所有種豬(含后備種豬)加強(qiáng)免疫一次偽豬犬基因缺失疫苗(Bartha-K61株)。其余豬只的免疫方案按豬場(chǎng)正常免疫程序執(zhí)行，后備母豬配種前免疫2次，間隔墻4周，每次1頭份；種公豬\種母豬每年免疫4次；哺乳仔豬初生吃初乳前滴鼻超免1次；保育育肥豬65~70日齡二免(育肥豬未進(jìn)行凈化)。2.3.6實(shí)施流行病學(xué)調(diào)查與凈化的時(shí)間安排實(shí)施時(shí)間：2年（2013年4月至2015年4月）。2013年3月進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的采樣檢查和偽狂犬疫苗的加強(qiáng)免疫。2013年5月1日至6月15日核心一場(chǎng)與擴(kuò)繁一場(chǎng)的全群采樣檢測(cè)工作。2013年7月1日至8月15日完成擴(kuò)繁二場(chǎng)與擴(kuò)繁三場(chǎng)全群采樣檢測(cè)工作。然后按季度進(jìn)行偽狂犬病毒gE、gB抗體監(jiān)測(cè)，至2015年4月結(jié)束。3結(jié)果3.1流行病學(xué)調(diào)查情況通過對(duì)供試4個(gè)豬場(chǎng)的母豬和仔豬進(jìn)行抽樣調(diào)查，并采用PRVgE、gB抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)所采集的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，獲得豬群PRV野毒感染的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，調(diào)查結(jié)果見表2。表2備選豬場(chǎng)偽狂犬病狀況場(chǎng)名豬只類型樣本量（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）核心一場(chǎng)種豬12043.310688.3仔豬4500920擴(kuò)繁一場(chǎng)種豬14574.812183.4仔豬6023.31423.3擴(kuò)繁二場(chǎng)種豬16563.613280仔豬8033.81012.5擴(kuò)繁三場(chǎng)種豬16074.412980.6仔豬8533.51214.1從表2可以看出，各個(gè)備選場(chǎng)均存在一定比例的偽狂犬病野毒感染，野毒感染陽性率為3-5%之間，僅有核心一場(chǎng)的仔豬沒有感染偽狂犬病野毒。但所有場(chǎng)的PRVgE抗體陽性率皆≤10%，符合行業(yè)內(nèi)對(duì)豬偽狂犬凈化的基本條件，仔豬PRVgE抗體陽性率低于10%，說明豬群存在野毒垂直傳播，但散毒的風(fēng)險(xiǎn)不是很大，通過檢測(cè)淘汰及綜合的生物安全措施，能保證群體呈PRVgE抗體陰性；PRVgB抗體種豬陽性率都≥80%，說明種豬群整體免狀況較好，仔豬由于未免疫及母源抗體的干擾PRVgB抗體陽性率較低屬正常現(xiàn)象。3.2凈化檢測(cè)結(jié)果3.2.1核心一場(chǎng)的凈化檢測(cè)結(jié)果核心一場(chǎng)所有種豬(包含后備種豬)分三批進(jìn)行檢測(cè)，仔豬每批次抽檢病弱豬15頭左右；每批次間隔15天左右。檢測(cè)結(jié)果將表3、表4和表5。表3核心一場(chǎng)第1批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬2006316482后備母豬3026.730100公豬160016100后備公豬6006100保育豬1516.7320合計(jì)26793.421982從表3可以看出，核心一場(chǎng)第1批次抽樣中，公豬和后備公豬沒有感染PRV野毒，同時(shí)對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)良好；母豬、后備母豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。表4核心一場(chǎng)第2批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬30041.323779后備母豬25142392保育豬1516.7426.6合計(jì)34041.226477.6從表4可以看出，核心一場(chǎng)第2批次抽樣中，母豬、后備母豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度；抽檢保育豬存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。表5核心一場(chǎng)第3批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬30051.722976.3后備母豬25282184保育豬15213.3320合計(jì)34092.625374.4從表5可以看出，核心一場(chǎng)第3批次抽樣中，后備母豬和保育豬的PRV野毒感染強(qiáng)度較高；抽檢保育豬對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。從3批次抽檢和普檢結(jié)果看，核心一場(chǎng)中公豬沒有感染PRV野毒，且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性良好，沒有感染風(fēng)險(xiǎn)；母豬和后備母豬存在一定的感染強(qiáng)度，保育豬的感染強(qiáng)度高于其他豬群。3.2.2擴(kuò)繁一場(chǎng)的凈化檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)繁一場(chǎng)所有種豬(包含后備種豬)分三批次進(jìn)行凈化檢測(cè)，保育豬抽檢20頭左右病弱仔豬；每批次間隔15天左右。監(jiān)測(cè)結(jié)果見表6、表7和表8。表6擴(kuò)繁一場(chǎng)第1批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬30082.724782.3后備母豬4037.52972.5公豬200020100后備公豬8112.5787.5保育豬20315420合計(jì)388153.930779.1從表6可以看出，擴(kuò)繁一場(chǎng)第1批次抽樣中，公豬沒有感染PRV野毒，同時(shí)對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)良好；母豬、后備母豬、后備公豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。表7擴(kuò)繁一場(chǎng)第2批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬39792.331779.8后備母豬3026.72893.3保育豬2015420合計(jì)447122.734978.1從表7可以看出，擴(kuò)繁一場(chǎng)第2批次抽樣中，母豬、后備母豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。表8擴(kuò)繁一場(chǎng)第3批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬30662.023677.1后備母豬2813.62692.8保育豬2015630合計(jì)35482.326875.7從表8可以看出，擴(kuò)繁一場(chǎng)第3批次抽樣中，母豬、后備母豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。從3批次抽檢和普檢結(jié)果看，擴(kuò)繁一場(chǎng)中公豬沒有感染PRV野毒，且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性良好，沒有感染風(fēng)險(xiǎn)；母豬和后備母豬存在一定的感染強(qiáng)度，保育豬的感染強(qiáng)度高于其他豬群。3.2.3擴(kuò)繁二場(chǎng)的凈化檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)繁二場(chǎng)豬群所有種豬(含后備種豬)分三批次進(jìn)行凈化檢測(cè)，保育豬抽檢50頭左右病弱仔豬；每批次間隔15天左右。監(jiān)測(cè)結(jié)果見表9、表10和表11。表9擴(kuò)繁二場(chǎng)第1批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬348123.426475.8后備母豬40253690公豬240024100后備公豬10110990保育豬5259.61426.9合計(jì)47419434773.2從表9可以看出，擴(kuò)繁二場(chǎng)第1批次抽樣中，公豬沒有感染PRV野毒，同時(shí)對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)良好；母豬、后備母豬、后備公豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。表10擴(kuò)繁二場(chǎng)第2批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬415153.630773.9后備母豬3827.13694.7保育豬48714.61531.3合計(jì)501244.832464.6從表10可以看出，擴(kuò)繁二場(chǎng)第2批次抽樣中，母豬、后備母豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。表11擴(kuò)繁二場(chǎng)第3批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬415153.630773.9后備母豬3827.13694.7保育豬48714.61531.3合計(jì)501244.832464.6從表11可以看出，擴(kuò)繁二場(chǎng)第3批次抽樣中，母豬、后備母豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。從3批次抽檢和普檢結(jié)果看，擴(kuò)繁二場(chǎng)中公豬沒有感染PRV野毒，且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性良好，沒有感染風(fēng)險(xiǎn)；母豬和后備母豬存在一定的感染強(qiáng)度，保育豬的感染強(qiáng)度高于其他豬群。3.2.4擴(kuò)繁三場(chǎng)的凈化檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)繁三場(chǎng)豬群所有種豬(含后備種豬)分三批次進(jìn)行凈化檢測(cè)，保育豬抽檢50頭左右病弱仔豬;每批次間隔15天左右。監(jiān)測(cè)結(jié)果見表12-表14。表12擴(kuò)繁三場(chǎng)第1批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬35892.526874.8后備母豬4224.83583.3公豬200020100后備公豬6006100保育豬38615.8923.7合計(jì)464173.733872.8從表12可以看出，擴(kuò)繁三場(chǎng)第1批次抽樣中，公豬和后備公豬沒有感染PRV野毒，同時(shí)對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)良好；母豬、后備母豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。表13擴(kuò)繁三場(chǎng)第2批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬44061.432874.5后備母豬3013.32480保育豬4224.8921.4合計(jì)51291.836170.5從表13可以看出，擴(kuò)繁三場(chǎng)第2批次抽樣中，母豬、后備母豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。表14擴(kuò)繁三場(chǎng)第3批樣本豬偽狂犬病毒抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬39592.332081.1后備母豬4624.34086.9公豬200020100后備公豬6005100保育豬4037.51127.5合計(jì)486142.937677.4從表14可以看出，擴(kuò)繁三場(chǎng)第3批次抽樣中，公豬和后備公豬沒有感染PRV野毒，同時(shí)對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)良好；母豬、后備母豬和保育豬則存在一定的PRV野毒感染強(qiáng)度，單均在設(shè)定的范圍之內(nèi)；抽檢保育豬不僅存在野毒感染，而且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性差。從3批次抽檢和普檢結(jié)果看，核心一場(chǎng)中公豬和后備公豬沒有感染PRV野毒，且對(duì)PRV疫苗的反應(yīng)性良好，沒有感染風(fēng)險(xiǎn)；母豬和后備母豬存在一定的感染強(qiáng)度，保育豬的感染強(qiáng)度高于其他豬群。3.3凈化監(jiān)測(cè)與淘汰3.3.1核心一場(chǎng)凈化監(jiān)測(cè)與淘汰情況凈化檢測(cè)是指種豬中所有的豬只都必須檢測(cè)偽狂犬野毒抗體，疫苗免疫抗體；而凈化監(jiān)測(cè)是按比例進(jìn)行抽樣檢測(cè)，每次檢測(cè)數(shù)量較少。淘汰標(biāo)準(zhǔn):偽狂犬gE抗體陽性豬只、免疫兩次疫苗gB抗體陰性豬只，對(duì)于仔豬檢出上述情況者、全窩淘汰。定期監(jiān)測(cè)按季度進(jìn)行，每個(gè)季度進(jìn)行一次。結(jié)果見表15-表21。表15核心一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬80006986.3后備母豬12001191.7公豬160016100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬5000918保育仔豬50001428合計(jì)2140012558.4表16核心一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬80006885后備母豬18001688.9公豬160016100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬40001127.5保育仔豬4200819.1合計(jì)2020012561.9表17核心一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬80006682.5后備母豬13001292.3公豬120012100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬46001021.7保育仔豬3800718.4合計(jì)1950011357.9表18核心一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬80006176.25后備母豬160016100公豬140014100后備公豬4004100產(chǎn)房仔豬42001330.9保育仔豬4500920合計(jì)2010011758.2表19核心一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬80006378.8后備母豬18001794.4公豬140014100后備公豬4004100產(chǎn)房仔豬50001632保育仔豬50001122合計(jì)2160012557.9表20核心一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬80006783.8后備母豬170017100公豬160016100產(chǎn)房仔豬46001634.8保育仔豬48001020.8合計(jì)2070012660.9表21核心一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬80006885后備母豬18001794.4公豬160016100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬47001327.7保育仔豬49001122.4合計(jì)2160013160.6從表中可以看出通過全群檢測(cè)淘汰PRVgE抗體陽性種豬與仔豬；對(duì)PRVgB抗體陰性豬只，補(bǔ)打疫苗后，檢測(cè)仍為陰性的豬只也給予淘汰。在3次檢測(cè)淘汰后，通過與7次抽樣監(jiān)測(cè)，未發(fā)病豬群存在偽狂犬野毒存在，達(dá)到了凈化的目標(biāo)。3.3.2擴(kuò)繁一場(chǎng)凈化監(jiān)測(cè)與淘汰監(jiān)測(cè)結(jié)果見表22-表28。表22擴(kuò)繁一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬103008986.4后備母豬18001794.4公豬160016100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬47001327.7保育仔豬49001122.4合計(jì)2390015263.6表23擴(kuò)繁一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬9944.18484.8后備母豬1516.715100公豬140014100后備公豬4004100產(chǎn)房仔豬4524.41226.7保育仔豬5036918合計(jì)227104.413860.8表24擴(kuò)繁一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬107008983.2后備母豬16001487.5公豬160016100后備公豬3003100產(chǎn)房仔豬42001023.8保育仔豬4600817.4合計(jì)2300014060.9表25擴(kuò)繁一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬98008081.6后備母豬15001386.7公豬200020100后備公豬4004100產(chǎn)房仔豬48001327.1保育仔豬50001122合計(jì)2350014160.0表26擴(kuò)繁一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬105008984.76后備母豬14001392.9公豬200016100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬45001327.7保育仔豬42001122.4合計(jì)2320014863.8表27擴(kuò)繁一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬97007981.4后備母豬21001780.9公豬200020100后備公豬5005100產(chǎn)房仔豬43001023.2保育仔豬40001127.5合計(jì)2260014262.8表28擴(kuò)繁一場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬108008982.4后備母豬18001794.4公豬240024100后備公豬5005100產(chǎn)房仔豬42001330.9保育仔豬45001124.4合計(jì)2420014961.5從表中可以看出通過全群檢測(cè)淘汰PRVgE抗體陽性種豬與仔豬；對(duì)PRVgB抗體陰性豬只，補(bǔ)打疫苗后，檢測(cè)仍為陰性的豬只也給予淘汰。在3次檢測(cè)淘汰后，通過與7次監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬群偽狂犬病野毒清除干凈，達(dá)到了凈化的目標(biāo)。3.3.3擴(kuò)繁二場(chǎng)凈化監(jiān)測(cè)結(jié)果與淘汰監(jiān)測(cè)結(jié)果見表29-表34。表29擴(kuò)繁二場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬120009982.5后備母豬40003690公豬240024100后備公豬1000880產(chǎn)房仔豬40001537.5保育仔豬3600822.2合計(jì)2700019070.3表30擴(kuò)繁二場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬118008471.2后備母豬38003592.1公豬260026100后備公豬8008100產(chǎn)房仔豬39001025.6保育仔豬4200819.1合計(jì)2710017163.1表31擴(kuò)繁二場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬120008671.7后備母豬35003085.7公豬260026100后備公豬4004100產(chǎn)房仔豬4000922.5保育仔豬3600616.7合計(jì)2610016161.7表32擴(kuò)繁二場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬115009885.2后備母豬30002893.3公豬260026100后備公豬4004100產(chǎn)房仔豬42001228.6保育仔豬35001028.6合計(jì)2520017870.6表33擴(kuò)繁二場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬124008971.7后備母豬36003494.4公豬240024100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬34001235.3保育仔豬3600925合計(jì)2600017466.9表34擴(kuò)繁二場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬120009276.7后備母豬35003085.7公豬260026100后備公豬4004100產(chǎn)房仔豬42001023.8保育仔豬3600822.2合計(jì)2610017065.1擴(kuò)繁二場(chǎng)凈化結(jié)果，從表中可以看出通過種豬群的全群普檢，仔豬及保育豬抽樣，淘汰全部gE抗體陽性豬只；gB抗體不合格者，補(bǔ)注疫苗4周后再次檢測(cè)，抗體不合格予以淘汰。在3批次檢測(cè)淘汰后，通過6次定期抽檢，未發(fā)現(xiàn)偽狂犬野毒存在，可以判定擴(kuò)繁二場(chǎng)偽狂犬病的凈化達(dá)到要求。3.3.4擴(kuò)繁三場(chǎng)凈化監(jiān)測(cè)結(jié)果與淘汰監(jiān)測(cè)結(jié)果見表35-表40。表35擴(kuò)繁三場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬118009883.1后備母豬30002480公豬260026100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬3600925保育仔豬4000922.5合計(jì)2560017267.2表36擴(kuò)繁三場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬1200010587.5后備母豬46004189.1公豬220022100后備公豬8008100產(chǎn)房仔豬38001026.3保育仔豬42001023.8合計(jì)2760019671.1表37擴(kuò)繁三場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬115009885.2后備母豬28002589.3公豬200020100后備公豬1000880產(chǎn)房仔豬35001028.6保育仔豬4000820合計(jì)2480016968.1表38擴(kuò)繁三場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬1220010182.8后備母豬36003191.6公豬220022100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬36001027.8保育仔豬3900923.1合計(jì)2610017667.4表39擴(kuò)繁三場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬1180010488.1后備母豬32002784.4公豬240024100后備公豬6006100產(chǎn)房仔豬38001128.9保育仔豬3600925合計(jì)2540018171.25表40擴(kuò)繁三場(chǎng)PR凈化后的定期監(jiān)測(cè)豬群PRV抗體監(jiān)測(cè)情況豬群類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)（份）gE陽性率（%）gB陽性數(shù)（份）gB陽性率（%）母豬1240010887.1后備母豬36003288.9公豬220022100后備公豬8008100產(chǎn)房仔豬42001638.1保育仔豬41001024.4合計(jì)2730019671.8擴(kuò)繁三場(chǎng)凈化結(jié)果，從表中可以看出通過種豬群的全群普檢，仔豬及保育豬抽樣，淘汰全部gE抗體陽性豬只；gB抗體不合格者，補(bǔ)注疫苗4周后再次檢測(cè)，抗體不合格予以淘汰。在3批次檢測(cè)淘汰后，通過6次定期抽檢，未發(fā)現(xiàn)偽狂犬野毒存在，可以判定擴(kuò)繁二場(chǎng)偽狂犬病的凈化達(dá)到要求。3.4凈化成本與效益3.4.1凈化成本3.4.1.1種豬及仔豬淘汰成本本次檢測(cè)總計(jì)淘汰種豬156頭(種母豬、種公豬、后備種公豬、后備種母豬)，部分為偽狂犬病毒檢測(cè)PRVgE抗體陽性126頭，30頭為PRVgB抗體陰性豬(補(bǔ)注疫苗后重新檢測(cè)PRVgB抗體仍為陰性)；淘汰仔豬43窩(抽樣檢測(cè)PRVgE陽性豬全窩淘汰)；共計(jì)445頭。種豬平均按3000元/頭計(jì)；仔豬平均按300元計(jì)；共計(jì)損失:156ⅹ3000+445ⅹ300=60.15萬。3.4.1.2檢測(cè)費(fèi)用偽狂犬病抗體檢測(cè)費(fèi)40元/豬計(jì),共計(jì)檢測(cè)12188頭,共計(jì)花費(fèi)48.75萬元,3.4.1.3成本合計(jì)凈化成本合計(jì)=種豬及仔豬淘汰成本+檢測(cè)費(fèi)用≈60萬+49萬=109(萬元)。3.4.2凈化提升收益3.4.2.1生產(chǎn)成績(jī)提高及產(chǎn)生的效益凈化前、后豬場(chǎng)產(chǎn)房的窩平均產(chǎn)仔數(shù)、平均初生重、斷奶健仔數(shù)，仔豬的平均成活率等主要生產(chǎn)指標(biāo)有較大提升，見表41。表41凈化前、后豬場(chǎng)產(chǎn)房主要生產(chǎn)指標(biāo)比較場(chǎng)名窩平均產(chǎn)活仔(頭)平均初生重(kg)斷奶健仔數(shù)(頭)平均成活率%哺乳仔豬存欄頭數(shù)凈化前凈化后凈化前凈化后凈化前凈化后凈化前凈化后凈化前凈化后核心一場(chǎng)9.8510.351.261.339.189.7593.2%94.2%13341401擴(kuò)繁一場(chǎng)10.2811.361.321.429.7210.7894.5%94.9%17391922擴(kuò)繁二場(chǎng)10.8911.351.241.3810.1910.6993.6%94.2%22122304擴(kuò)繁三場(chǎng)10.5411.241.281.369.9210.6494.1%94.7%21402282平均值10.3911.071.271.389.7510.4693.8%94.5%從凈化前后產(chǎn)房主要生產(chǎn)指標(biāo)對(duì)比可以看出：偽狂犬病凈化后胎均產(chǎn)活仔數(shù)增加0.68頭；平均初生重增加0.11kg；胎均斷奶健仔數(shù)增加0.71頭；成活率提高0.7%，平均存欄哺乳仔豬數(shù)增加484頭。胎產(chǎn)活仔數(shù)每頭母豬每胎增加0.68頭，按2.2胎計(jì)，每年可新增仔豬數(shù)6300頭，按200元/頭落地成本計(jì)，增加效益約126萬元。凈化前、后豬場(chǎng)母豬及后背母豬的PRVgB免疫抗體、HCV免疫抗體也有一定提高，見表42。表42凈化前后的gE、gB、HCV抗體陽性率的變化從表42可以看出，通過凈化偽狂犬病毒的野毒，解除了病毒對(duì)機(jī)體的免疫的抑制作用，使疫苗免疫的效果得到了提升。在凈化了偽狂犬野素毒后，偽狂犬的gB抗體、豬瘟（HCV）抗體水平均有明顯的提升。3.4.2.2保健費(fèi)用節(jié)省因?yàn)閮艋袅藗慰袢。瑴p少了母豬流產(chǎn)、保育豬的呼吸道疾病，原來保健、治療、疫苗及消毒劑成本為685元/年/母豬(仔豬保健、治療、疫苗及消毒劑成本完全攤銷于母豬)，凈化后保健、治療、疫苗及消毒劑費(fèi)用下降至613元/年/母豬，一年共計(jì)節(jié)省費(fèi)用約30萬元。3.4.2.3提前出欄節(jié)省飼料費(fèi)用肥豬(110公斤)出欄時(shí)間凈化后比凈化前提前約7天，按每頭肥豬每天3公斤飼料，按10元/天/豬計(jì)，按MSY=18頭/年計(jì)，年節(jié)省飼料費(fèi)用約76萬元。3.4.2.4凈化提升的效益凈化產(chǎn)生的效益=生產(chǎn)成績(jī)提升產(chǎn)生的效益+保健費(fèi)用的節(jié)省+提前出欄節(jié)省的飼=126萬元+30萬元+76萬元=232萬元3.4.2.5凈化后年凈效益凈化后提升收益—凈化投入成本=232萬-109萬=123萬3.4.3進(jìn)口疫苗與國(guó)產(chǎn)疫苗評(píng)價(jià)3.4.3.1對(duì)偽狂犬野毒攻擊的保護(hù)效果.根據(jù)凈化的效果及抗體檢測(cè)結(jié)果可以看出：進(jìn)口疫苗與國(guó)產(chǎn)疫苗都可以成功凈化偽狂犬病。進(jìn)口疫苗疫苗抗體的離散度略優(yōu)于國(guó)產(chǎn)疫苗。3.4.3.2對(duì)于疫苗免疫抗體PRVgB(gB)水平的評(píng)價(jià)使用進(jìn)口疫苗(西班牙海博萊)組：共檢測(cè)種豬(含后備種豬)2021頭份，其中PRVgB抗體陽性豬只1626頭份，陽性率為80.45%；使用國(guó)產(chǎn)疫苗組：共檢測(cè)種豬(含后備種豬)2713頭份，其中PRVgB抗體陽性豬只2026頭份,陽性率為74.67%；從中可以看出免疫抗體水平有一定差異，相差5.78%。凈化監(jiān)測(cè)中：進(jìn)口疫苗組共檢測(cè)種豬(含后備種豬)1815頭份，其中PRVgB(gB)抗體陽性豬只1522頭份，陽性率為83.86%；使用國(guó)產(chǎn)疫苗組：共檢測(cè)種豬(含后備種豬)2224頭份，其中PRVgB抗體陽性豬只1819頭份，陽性率為81.79%；從中可以看出免疫抗體PRVgB水平相差2.07%3.4.3.3兩者疫苗成本差異進(jìn)口疫苗約為3.5元/頭份；國(guó)產(chǎn)疫苗約為1.2元/頭份。存欄1000頭基礎(chǔ)母豬的豬場(chǎng)一年免疫注射偽狂犬疫苗約4.8萬頭份;國(guó)產(chǎn)疫苗與進(jìn)口疫苗差價(jià)約為11萬元綜合評(píng)判來看，國(guó)產(chǎn)疫苗與進(jìn)口疫苗都能成功地凈化偽狂犬病，在豬群免疫良好的情況下，此對(duì)照研究PRVgB抗體水平相差2.07%，而國(guó)產(chǎn)苗對(duì)一個(gè)存欄1000頭基礎(chǔ)母豬的豬場(chǎng)可節(jié)省疫苗費(fèi)用約11萬元。從經(jīng)濟(jì)角度來判定，本研究國(guó)產(chǎn)疫苗組成本優(yōu)于進(jìn)口疫苗組。4討論4.1豬場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查與檢測(cè)結(jié)果討論各場(chǎng)偽狂犬野毒情況的摸底見表43(由于本研究重點(diǎn)在于偽狂病的凈化，摸底檢測(cè)只討論偽狂犬病的情況，其他疫病檢測(cè)指標(biāo)不在此累述)。表43各場(chǎng)偽狂犬野毒情況的摸底場(chǎng)名類別樣本數(shù)（份）gE陽性數(shù)gE陽性率（%）gB陽性數(shù)gB陽性率（%）核心一場(chǎng)種豬12043.3%10688.3%仔豬4500920%擴(kuò)繁一場(chǎng)種豬14574.8%12183.4%仔豬6023.3%1423.3%擴(kuò)繁二場(chǎng)種豬16563.6%13280%仔豬8033.8%1012.5%擴(kuò)繁三場(chǎng)種豬16074.4%12980.6%仔豬8533.5%1214.1%從表中可以看出：核心一場(chǎng)種豬偽狂犬野毒PRVgE抗體陽性率為3.3%，仔豬未檢出；種豬PRVgB抗體陽性率88.3%，仔豬PRVgB抗體陽性率為20%；擴(kuò)繁一場(chǎng)偽狂犬野毒PRVgE抗體陽性率為4.8%，仔豬野毒PRVgE抗體陽性率為3.3%；種豬陽性率PRVgB抗體陽性率83.4%，仔豬PRVgB抗體陽性率為23.3%；擴(kuò)繁二場(chǎng)偽狂犬野毒PRVgE抗體陽性率為3.6%，仔豬野毒PRVgE抗體陽性率為3.8%；種豬陽性率PRVgB抗體陽性率80.0%，仔豬PRVgB抗體陽性率為12.5%；擴(kuò)繁三場(chǎng)偽狂犬野毒PRVgE抗體陽性率為4.4%，仔豬野毒PRVgE抗體陽性率為3.5%；種豬陽性率PRVgB抗體陽性率80.6%，仔豬PRVgB抗體陽性率為14.1%；根據(jù)凈化判斷標(biāo)