EPG技術(shù)在植物病毒病研究中的應(yīng)用

EPG技術(shù)在植物病毒病研究中的應(yīng)用摘要：刺吸電位圖譜（electricalpenetrationgraph，EPG）技術(shù)在植食性刺吸式昆蟲，如蚜蟲、粉虱、葉蟬和薊馬等研究中的應(yīng)用日益深入，已涉及寄主專化性、植物的抗蟲機(jī)制以及病毒傳播等領(lǐng)域，該文從植物病毒病入手，介紹EPG技術(shù)的在該領(lǐng)域的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：刺吸電位圖譜；植物病毒??；半持久性病毒；非持久性病毒Applicationofelectricalpenetrationgraph(EPG)inplantvirusdiseasesstudiesAbstract:Theelectricalpenetrationgraph(EPG)technologyismoreandmorewidelyusedinsttdingpiercingsuckinginsects,suchasaphid,whitefly,leafhopperandthrips.Ithasbeenadoptedtostudyhostspeciality,plantresistanceandvirustransmission.WereviewedthereseachprogressandapplicationprospectsofEPGthroughexampleofplantvirustransmission.Keywords:Electricalpenetrationgraph;plantvirusdisease;semipersistentviruses;nonpersistentviruses.刺吸電位圖譜（electricalpenetrationgraph，EPG）技術(shù)是一種用于研究植食性刺吸式口器昆蟲在寄主植物上刺探和取食行為的電生理技術(shù)。植物病毒病是植物的癌癥，目前沒有有效的藥劑，利用EPG技術(shù)同時(shí)結(jié)合電鏡技術(shù)、分子手段等可以揭示植物病毒病的傳播機(jī)理。這對于有效的防治植物病毒病的傳播有一定的指導(dǎo)作用。1EPG技術(shù)研究概況1.1刺吸電位技術(shù)及其發(fā)展1964年，Mclean和Kinsey首次設(shè)計(jì)了交流系統(tǒng)的電子取食監(jiān)測(electricalfeedingmonitor),用于檢測蚜蟲口針在植物組織內(nèi)的取食行為,初步證明蚜蟲的不同刺探行為和蚜蟲口針在植物組織中不同位置以及蚜蟲唾液分泌的輸出波形。并認(rèn)為利用該技術(shù)記錄蚜蟲取食行為能夠幫助理解植物病毒的獲得[1]。1966年，Schaefers首次描述了直流系統(tǒng)的原始方法，并于1968年使用60Hz的交流電作為電壓系統(tǒng)[1][2]。Brown&Holbrook在1976年提出改進(jìn)，使用20Hz的交流電作為電壓系統(tǒng)。1978年，W.F.Tjallingii根據(jù)以上的改進(jìn)做出了最終的修改，應(yīng)用10-30mV的電壓，稱為刺吸電位圖譜electricalpenetrationgraph(EPG)，同時(shí)增加信號放大器對該系統(tǒng)進(jìn)行信號放大，記錄了6種不同的波形存在,并用了高值的輸人阻抗，使儀器能輸出更加準(zhǔn)確、細(xì)致的波譜[3]。后來這兩套系統(tǒng)統(tǒng)稱為EPG，其中交流系統(tǒng)為AC-EPG，直流系統(tǒng)稱為DC-EPG。直流系統(tǒng)比交流系統(tǒng)能更好的識別昆蟲的取食細(xì)節(jié)[4]。而20世紀(jì)80年代中期,EPG技術(shù)與計(jì)算機(jī)聯(lián)用，明顯地提高了分析效率[5]。目前各研究機(jī)構(gòu)使用的大多數(shù)為DC-EPG，這兩套系統(tǒng)各有特點(diǎn)，現(xiàn)在美國正在研發(fā)可以同時(shí)使用兩套系統(tǒng)的AC-DC-EPG，這樣就可以使兩種互補(bǔ)更充分的利用刺吸電位系統(tǒng)。1.2波形分析與植物病毒病早期的關(guān)于蚜蟲的EPG研究，主要是建立蚜蟲的取食行為與EPG波形的對應(yīng)關(guān)系和對波形的分析。Mclean和Kinsey建立了蚜蟲的取食和分泌唾液的波形記錄，及豌豆蚜Acythosiphonpisum取食刺吸行為與電子記錄波形的對應(yīng)關(guān)系，后來又觀察了溫度對刺吸行為的影響[3][6][7]。Tjallingii建立了蚜蟲穿刺行為的波形記錄，發(fā)現(xiàn)A波、B波和C波與分泌唾液有關(guān)，而D波與吸食有關(guān)，后來又對EPG電路和電位下降波形（potentialdrops，pd）做了全面深入的研究[2][4][8]。Kimmins和Tjallingii在對甘藍(lán)蚜Brevicorynebrassicae(L.)的研究中，將EPG與電鏡技術(shù)結(jié)合，將蚜蟲的口針切除，發(fā)現(xiàn)只有發(fā)生韌皮部的波形（E波）后切斷口針才會(huì)有汁液流出，并從顯微照片上看出，口針頂端已經(jīng)刺穿篩管的原生質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)腔；其中，E波和pd波電勢水平較低，反映了細(xì)胞膜內(nèi)外的電勢差，是2個(gè)關(guān)鍵的波形,pd波持續(xù)時(shí)間短，一般在1min之內(nèi)，與傳播非持久性病毒有關(guān),而E波持續(xù)時(shí)間少則幾分鐘，多則幾個(gè)小時(shí)，它反映了口針刺吸韌皮部篩管的過程，2波又可以分為2個(gè)亞波，E1波和E2波，E1波表示昆蟲分泌水溶性唾液，E2波則表示在韌皮部被動(dòng)吸食。一般認(rèn)為，E2波時(shí)間超過10min即為在韌皮部持續(xù)吸食[9]。Jean-MichelLett和MartineGranier結(jié)合投射電子顯微鏡技術(shù)，基于波形之間的相關(guān)性和精細(xì)的探針通路結(jié)構(gòu)認(rèn)為昆蟲的活動(dòng)與五種波形有關(guān)，和蚜蟲在非維管細(xì)胞中短暫的攝取不同，葉蟬（CicadulinambilaNaudé）的EPG波形中，波形2對應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)活躍的攝取細(xì)胞內(nèi)容物，導(dǎo)致細(xì)胞器的完整性受到嚴(yán)重影響，以此確定葉蟬是典型的從細(xì)胞核中獲得雙生病毒[10]。利用EPG技術(shù)可以確定昆蟲媒介獲得病毒的位置，接種病毒的時(shí)間等，對不同類型的植物病毒有不同的數(shù)據(jù)參考。2植物病毒病農(nóng)業(yè)病害主要有真菌病害、細(xì)菌病害和病毒病害三大類，植物病害是僅次于真菌的病原體。它是內(nèi)含感染性核酸，外披蛋白質(zhì)外殼的實(shí)體，其特征是能感染寄主細(xì)胞和通過感染引起病害現(xiàn)象[11]。其中病毒對寄主的危害比其他病原物要重，而且較難防治[12]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中愈來愈突出，由于病毒對寄主植物細(xì)胞的絕對寄生性和植物沒有動(dòng)物那樣完整的免疫代謝系統(tǒng)使得植物一旦被病毒侵染就終生處在被病毒危害的狀態(tài)[13]，每年給世界各地的農(nóng)作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[17]。植物病毒有“植物癌癥”之稱，到目前為止還沒有很有效的方法來防治[18]。其中，對煙草病毒害的防治對策也停留在防對病毒病種類、株系分布及流行規(guī)律研究；進(jìn)一步加強(qiáng)病毒病的測報(bào)技術(shù)研究；開展抗病育種研究；栽培防病措施研究；抗病毒劑的篩選及利用；開展綜合防治示范研究這幾個(gè)階段[14]。當(dāng)前馬鈴薯病毒病的防治策略主要是生產(chǎn)脫毒種薯、選育抗病毒病品種和利用抗病毒物質(zhì)以及控制傳毒媒介[15]。果樹病毒病屬于難治療病害，迄今還沒有一種有效的藥物。較為可行的控制措施是實(shí)行檢疫，控制其擴(kuò)展[16]。2.1傳毒媒介及其與植物病毒病的關(guān)系植物病毒的傳染方式很多，其中有介體傳染和無介體傳染，即主要有以下幾種方式：嫁接傳梁，汁液傳染(也稱接觸傳染)昆蟲和螨類傳染，線蟲和真菌傳染，其中以昆蟲最為重要[20]。而在昆蟲傳播中，蚜蟲傳播植物病毒病的能力居昆蟲的首位，具統(tǒng)計(jì)傳毒昆蟲約有465種，其中蚜蟲占242種左右[21]。從應(yīng)用研究的角度來看，媒介的傳播對病毒病的傳播是非常重要的，了解病毒病的傳播和控制需要了解媒介及其行為。病毒在蚜蟲體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)（循環(huán)型病毒和非循環(huán)型病毒）和病毒滯留在蚜蟲體內(nèi)的位點(diǎn)或者靶組織是對病毒傳播機(jī)制最好的理解[22]。2.2蚜傳植物病毒根據(jù)攝入的病毒顆粒是否在蚜蟲體內(nèi)復(fù)制、病毒在蚜蟲體內(nèi)的時(shí)間、病毒在蚜蟲體內(nèi)的運(yùn)輸路線可將植物病毒病分為循環(huán)型傳播病毒和非循環(huán)型傳播病毒。循環(huán)型傳播類病毒進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)過多次跨膜運(yùn)輸?shù)窖馨妥罱K進(jìn)入到唾液腺，通過分泌唾液離開蚜蟲體內(nèi)。非循環(huán)型傳播類病毒則相對簡單一些，僅位于昆蟲的前腸和口器中。可以通過研究蚜蟲的取食器官和消化系統(tǒng)來區(qū)別這兩種病毒。根據(jù)蚜蟲取食病株后攜帶病毒的時(shí)間將循環(huán)型病毒分為半持久性病毒和非持久性病毒[22]。非持久性病毒能夠在幾秒至幾分鐘的時(shí)間內(nèi)獲毒[23]。當(dāng)蚜蟲取食時(shí)，植物汁液和唾液鞘在蚜蟲口針頂端相遇，唾液的分泌能夠增強(qiáng)病毒顆粒的釋放和在植物細(xì)胞中的運(yùn)輸[24]。半持久性病毒也可以在幾分鐘內(nèi)獲毒，但是獲毒效率隨著喂養(yǎng)病株的時(shí)間增加[25]。而且半持久性病毒可以在蚜蟲體內(nèi)存在幾個(gè)小時(shí)到幾天時(shí)間[26]。循環(huán)型傳播類蚜蟲在幾天內(nèi)獲毒，該類病毒由于韌皮部的限制，蚜蟲獲毒和病毒在蚜蟲體內(nèi)的滯留時(shí)間較長，而且必須通過媒介的傳播。根據(jù)病毒是否在蚜蟲媒介體內(nèi)復(fù)制，將循環(huán)型傳播分為循環(huán)非繁殖型和循環(huán)繁殖型。而蚜蟲較長時(shí)間的攜帶某種病毒的模式被成為持續(xù)性的。而兩種模式最主要的區(qū)別是能否將病毒傳給后代[22]。3EPG在植物病毒病中的應(yīng)用3.1非持久性病毒非持久性病毒的傳播和傳播媒介在表皮短暫的刺探有密切關(guān)系。對其傳毒機(jī)制存在口針帶毒假說[27]和吸入-排出假說[28]。近年來的研究結(jié)果表明,蚜蟲傳播植物病毒病與其取食過程中口針刺破細(xì)胞膜的行為相關(guān)[29]。Powell[30]使用EPG技術(shù)初步分析了桃蚜Myzuspersicae傳播馬鈴薯Y病毒、甜菜花葉病毒的試探性取食行為,發(fā)現(xiàn)電位落差(potentialdrop,pd)波(蚜蟲取食行為過程的早期出現(xiàn)的一種EPG波形,是其口針刺破植物細(xì)胞膜所引起的一種電位變化)的出現(xiàn)對桃蚜的成功傳毒具有重要意義,從而支持了蚜蟲主要在細(xì)胞內(nèi)獲毒的假設(shè)。BMart和JLCollar等[31]于1995年證實(shí)非持久性病毒的獲得在細(xì)胞內(nèi)刺探階段（pd波）的最后一個(gè)階段（II-3），接種則在第一個(gè)階段（II-1)完成。pd波的發(fā)生頻率與獲得傳播非持久性病毒效率呈正相關(guān)。張鵬飛等[32]結(jié)合EPG即時(shí)中斷技術(shù)證實(shí)棉蚜獲得黃瓜花葉病毒需要pd波的發(fā)生，它的獲毒效率與穿刺病株細(xì)胞膜的次數(shù)呈正相關(guān)。棉蚜的獲毒發(fā)生在pd波的II-3階段，與棉蚜主動(dòng)吸食植物細(xì)胞汁液的活動(dòng)相關(guān)，這支持了蚜蟲獲毒的“吸入假說”。因此,通過EPG技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合可以研究pd波在蚜蟲獲毒過程中的作用,將有助于揭示蚜蟲傳播非持久性病毒的行為機(jī)理。3.2半持久性病毒植物半持久性病毒的傳播在一些栽培谷物中造成一定的經(jīng)濟(jì)危害，然而這類病毒在研究領(lǐng)域較持久性病毒和非持久性病毒受到的關(guān)注相對較少[33]。半持久性病毒類群中數(shù)量最大的屬于線型病毒組[34]，傳播媒介包括胸緣類同翅亞目的蚜科、粉虱科、粉蚧科三大類群[35]。對半持久性病毒的研究較少，早期利用EPG技術(shù)對傳毒機(jī)理的研究僅局限在傳毒昆蟲的口針穿刺上。1993年Wayadande和Nault[36]研究發(fā)現(xiàn)玉米黃化萎縮病的傳毒媒介葉蟬Graminellanigrifrons(Forbes)在木質(zhì)部吸食之前，口針最初刺穿韌皮部篩管部分時(shí)接種病毒。D.D.Johnson和G.P.Walker[37]以小花錦葵-銀葉粉虱-生菜黃化萎縮病為研究系統(tǒng)，允許帶病毒的粉虱在健康寄主植株上取食，分兩組實(shí)驗(yàn)，一組粉虱在取食使其出現(xiàn)韌皮部取食波（E波），另一組不能出現(xiàn)韌皮部取食波（E波）。通過控制粉虱的取食使非韌皮部取食波時(shí)間相似，及其刺吸過程中細(xì)胞內(nèi)刺探的時(shí)間相似，所有的實(shí)驗(yàn)顯示病毒的接種主要發(fā)生在韌皮部取食階段。利用單頭粉虱傳毒，無韌皮部取食波一組的植株獲毒率為5%，而有韌皮部取食波一組的植株獲毒率為48%（P=0.00008）。目前非持久性病毒的傳播機(jī)制存在兩種假說，唾液攝入假說和吸入排泄假說而對于如果其傳播機(jī)理為唾液攝入假說則其病毒接種應(yīng)發(fā)生在E1階段，如果符合吸入排泄假說則其病毒接種則發(fā)生在E2階段。參考文獻(xiàn)（reference）[1]McleanDL,KinseyM.G.ATechniqueforelectronicallyrecordingofaphidfeedingandsalivation.Nature.,1964,202:1358-1359.[2]TjallingiiWF.Electronicrecordingofpenetrationbehaviorbyaphids.Entomol.Exp.Appl.1978.,24:721-730.[3]McleanDL,KinseyMG.Probingbehaviorofthepeaaphid,Acyrthosiphonpisum.I.Definitivecorrelationofelectronicallyrecordedwaveformswithaphidprobingactivities.AnnalsoftheEntomologicalSocietyofAmerica.Soc.1967,60:400-406.[4]TjallingiiWF.Electricalnatureofrecordsignalsduringstyledpenetrationbyaphids.Entomol.Exp.Appl.,1985,38:177-186.[5]羅晨,岳梅,徐洪富,張芝利.EPG技術(shù)在昆蟲學(xué)研究中的應(yīng)用及進(jìn)展.昆蟲學(xué)報(bào).,2005,48(3)：437—443.[6]McleanDL,KinseyMG.Identificationofelectricallyrecordedcurvepatternsassociatedwithaphidsalivationandingestion.Nature.,1965,205:1130-1131.[7]McleanDL,KinseyMG.Probingbehaviorofthepeaaphid,Acyrthosiphonpisum.Ⅲ.Effectoftemperaturedifferencesoncertainprobingactivities.Ann.Entomol.activities.Ann.Entomol.Soc.Amer.,1968,60:400-406.[8]TjallingiiWF.Electronicrecordingofpenetrationbehaviourbyaphids.Entomol.Exp.Appl.,1978,24:721-730.[9]KimminsFM,TjallingiiWF.Ultrastuctureofseveelementpenetrationbyaphidstyletsduringelectricalrecording.Entomol.Exp.Appl.，1985,39:135-141.[10]Jean-MichelLett,MartineGranier,MartialGrondin,PatrickTurpin.ElectricalpenetrationgraphsfromCicadulinambilaonmaize,thefinestructureofitsstyletpathwaysandconsequencesforvirustransmissionefficiency.EntomologiaExperimentalisetApplicata.2001,100(2):93-109.[11]南京農(nóng)學(xué)院主編．普通植物病理學(xué)．北京：農(nóng)業(yè)出版社，1978.[12]徐良忠，郭玉晶，張書圣.植物病毒病化學(xué)防治研究進(jìn)展.青島化工學(xué)院學(xué)報(bào).，2000.21（4）：293-300.[13]江山，韓熹萊.植物病毒病化學(xué)防治的研究進(jìn)展.中國病毒學(xué).1995,10(1):1-7.[14]劉春生，孟凡剛，蘇世臣，史文國，李宗明等.我國煙草病毒病的防治研究策略.中國煙草科學(xué).,2001,(1):46—48.[15]肖雅,何長征,聶先舟,熊興耀.馬鈴薯病毒病防治策略.中國馬鈴薯.,2008,22(2):106-110.[16]侯義龍,張開春,胡文玉,吳祿平.2O世紀(jì)果樹病毒檢測技術(shù)的回顧與展望.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001.,32(2)：144—149.[17]楊洪元,廖旭輝.植物病毒病防治策略的研究進(jìn)展.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào).,2006,12（3）:74-76.[18]熊克娟,陳繩亮,等.植物病毒及其危害.生物學(xué)通報(bào).,2003,38(4):12-13.[20]胡淑霞.論植物病毒的傳毒介體及其傳播方式.生物學(xué)雜志.,1997,14(79):33-34.[21]方中達(dá),等.普通植物病理學(xué).農(nóng)業(yè)出版社.,1979:117-119.[22]JAMESC.K.NG1ANDKEITHL.PERRY.Transmissionofplantvirusesbyaphidvectors.MOLECULARPLANTPATHOLOGY.,2004,5(5):505–511[23]Ng,J.C.K.,Liu,S.J.andPerry,K.L.Cucumbermosaicvirusmutantswithalteredphysicalpropertiesanddefectiveinaphidvectortransmission.Virology.,2000,276:395–403.[24]Martin,B.,Collar,J.L.,Tjallingii,W.F.andFereres,A.Intracellularingestionandsalivationbyaphidsmaycausetheacquisitionandinoculationofnon-persistentlytransmittedplantviruses.J.Gen.Virol.,1997,78:2701–2705.[25]Palacios,I.,Drucker,M.,Blanc,S.,Leite,S.,Moreno,A.andFereres,A.Cauliflowermosaicvirusispreferentiallyacquiredfromthephloembyitsaphidvectors.J.Gen.Virol.,2002,83:3163–3171.[26]Blanc,S.,Hébrard,E.,Drucker,M.andFroissart,R.Molecularbasisofvectortransmission:caulimoviruses.InVirus–Insect–PlantInteractions(Harris,K.,SmithO.P.andDuffus,J.E.,eds).SanDiego:AcademicPress,2001,143–166.[27]Kennedy,J.S.,Day,M.F.&Eastop,V.F..AConspectusofAphidsasVectorsofPlantViruses.London:CommonwealthInstituteofEntomology.,1962,144-147.[28]Gamez,R.&Watson,M.A.(.Failureofanesthetizedaphidstoacquireortransmithenbanemosaicviruswhentheirstyletswerearticiallyinsertedintoleavesofinfectedorhealthytobaccoplants.Virology.1964,22:292-295.[29]LópezAbellaD,BradleyRHE,HarrisKF.Correlationbetweenstyletpathsmadeduringsuperficialprobingandtheabilityofaphidstotransmitnonpersistentviruses.In:HarrisKFed.AdvancesinDiseasesVectorResearch.vol5.NewYork:Springer,1988.251-285.[30]PowellG.Cellmembranepuncturesduringepidermalpenetrationsbyaphids:consequencesforthetransmissionoftwopotyvirus.Ann.Appl.Biol.,1991,119:313-321.[31]B.Marthen,J.L.Collar,W.F.Tjallingii,A.Fereres.Intracellularingestionandsalivationbyaphidsmaycausetheacquisitionandinoculatio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