細(xì)葉黃皮種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018細(xì)葉黃皮種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了細(xì)葉黃皮[Clausenaanisum-olens（Blanco）Merr]種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于細(xì)葉黃皮種子的超低溫長期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程水分測定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程其他項目檢驗術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。細(xì)葉黃皮Clausenaanisum-olens（Blanco）Merr為蕓香科（Clausena）黃皮屬（ClausenaBurm.f.）常綠小喬木，又名雞皮果、山黃皮，其果實、花、葉具有香氣。枝、葉作草藥，祛風(fēng)除濕。鮮果可食用，味酸甜，但多食可致輕度麻舌感。民間將熟果曬干，用酒泡浸，謂有化痰止咳功效。收載于《世界藥用植物速查辭典（2015）》。細(xì)葉黃皮果實Clausenaanisum-olens（Blanco）Merrfruits果實圓球形，偶有闊卵形，徑1~2cm，淡黃色，偶有淡朱紅色，半透明，果皮有多數(shù)肉眼可見的半透明油點，果肉味甜或偏酸，有種子1~2粒。細(xì)葉黃皮種子Clausenaanisum-olens（Blanco）Merrseeds細(xì)葉黃皮的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子暗黃色，扁平，子葉深綠色。種皮膜質(zhì)，基部褐色。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過前處理的細(xì)葉黃皮種子置于液氮（-196℃）中保存。種子的選擇果實采收6月份成熟，當(dāng)果皮變成黃色，質(zhì)軟時，即可采收，去除果肉，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、完整、健康的種子，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r間不超過1個月）。種子前處理生活力檢測參照《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》中的溴麝香草酚藍(lán)（BTB）法測定種子生活力。待測種子在30℃~35℃溫水中浸種2h，隨后取吸脹種子50粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將含胚部分埋入凝膠中。將培養(yǎng)皿置于35℃溫箱中4h后觀察結(jié)果。生活力計算在光下用放大鏡對染色結(jié)果進行觀察鑒定。凡種胚周圍出現(xiàn)黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無活力的種子。計算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的細(xì)葉黃皮種子生活力應(yīng)≥95%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹細(xì)葉黃皮種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為3000:1，室溫條件下干燥處理0~20h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由50%~55%降至39%~50%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量細(xì)葉黃皮種子保存量不少于300粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式細(xì)葉黃皮種子超低溫保存的冷凍方式為分步冷凍法，即將裝有種子和玻璃化保護溶液（PVS2）的15mL凍存管（每管30粒種子）置于4℃冰箱中0.5h，取出立即放入-20℃冰柜中1h，之后迅速投入液氮中保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出1個凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍3min，而后用洗滌液（DS）浸泡3次，每次5min，并用純凈水沖洗干凈。凍后種子生活力檢測取出15粒解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進行超低溫保存后的初始生活力檢測。當(dāng)種子生活力≥80%時視為保存成功?；謴?fù)培養(yǎng)將剩下15粒解凍后的細(xì)葉黃皮種子，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中，溫度25℃~30℃，濕度70%~85%條件下培養(yǎng)。附錄[1]BTB的配制和保存方法精密稱取BTB0.5g，溶解于煮沸過的500ml純水中。濾液若呈黃色，可加數(shù)滴氫氧化鈉溶液，使之變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)綠色，隨后加入3.5g瓊脂溶解，稍稍冷卻即可趁熱倒入9cm培養(yǎng)皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。[2]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亞砜13.6mL，稱取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。注意：配置時需戴手套，并在通風(fēng)廚內(nèi)操作。[3]洗滌液（DS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后，定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。參考文獻[1]肖培根，劉昌孝，江紀(jì)武等.世界藥用植物速查辭典[M].中國醫(yī)藥科技出版社.2015[2]中國科學(xué)院中國植物志委員會.中國植物志.第43（2）卷[M].科學(xué)出版社，2004（1997），43（2）：138[3]ZhangDianxiang.ThomasG.Hartley.DavidJ.Mabberley.Rutaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2008.11:8