1緒論-3酶分離純化-2課件

酶學(xué)彭益強(qiáng)Enzymology國(guó)立華僑高校生物工程與技術(shù)系一細(xì)胞裂開二酶的提取三離心分別四過濾與膜分別五沉淀分別六層析分別(link)七電泳分別(link)八萃取分別(link)九酶的結(jié)晶(link)十濃縮與干燥(link)主要內(nèi)容go第五節(jié)酶的分別純化六層析分別是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子大小和形態(tài)、分子極性、吸附力、分子親和力和支配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相中的分布程度不同而達(dá)到分別。層析分別中一個(gè)相是固定的,稱為固定相;另一個(gè)相是流淌的,稱為流淌相;各組分移動(dòng)速度步同,使不同組分分純化;層析分別設(shè)備簡(jiǎn)潔,操作簡(jiǎn)潔;層析分別層析柱表4-5層析分別方法層析方法分離依據(jù)吸附層析吸附力不同分配層析各組分在兩相中分配系數(shù)不同離子交換層析離子交換劑上解離基團(tuán)對(duì)離子親和力不同凝膠層析各組分相對(duì)分子量不同親和層析生物分子與配基間專一又可逆親和力層析聚焦等電特性與離子交換層析特性結(jié)合一、吸附層析(link)二、支配層析(link)三、離子交換層析(link)四、凝膠層析(link)五、親和層析(link)附：視頻動(dòng)畫1、色譜柱2、液相色譜生產(chǎn)上常用的層析分別方法go一、吸附層析一個(gè)相中的物質(zhì)在兩相界面上密集現(xiàn)象稱為吸附；吸附產(chǎn)生緣由：固體表面分子與固體內(nèi)部分子受的作用力不同；主要是范德華力。常用于酶分別純化的：硅藻土、氯化鋁、磷酸鈣、羥基磷灰石、活性碳。不同物質(zhì)吸附力、解析力不同，移動(dòng)距離不同，而分別。利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，而使混合液中各組分分別。１、吸附層析原理２、洗脫方法（１）溶劑洗脫法洗脫曲線洗脫液體積物質(zhì)濃度（２）置換洗脫法ＡＢ洗脫液體積物質(zhì)濃度吸附層析（續(xù)）（３）前緣洗脫法ＡＡ＋ＢＡ＋Ｂ＋Ｃ洗脫液體積物質(zhì)濃度３、吸附劑與洗脫劑的選擇（１）吸附劑的選擇極性物易被極性表面吸附；溶解度大的越難吸附；吸附劑分無機(jī)和有機(jī)吸附；用于酶分別純化的有硅藻土、氧化鋁等，在低pH值、低離子強(qiáng)度下對(duì)酶有較強(qiáng)吸附作用，提高難度pH，離子強(qiáng)度即可洗脫。（２）洗脫劑的選擇對(duì)于極性組分用極性大的溶液；留意點(diǎn)：洗脫劑不與吸附劑反應(yīng)、對(duì)各組分溶解度大、流淌性好，有確定純度。back二、支配層析支配系數(shù)指溶質(zhì)在兩互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩溶劑中濃度比值。通常用一種多孔性固體支持物吸著一種溶劑為固定相。不同溶質(zhì)有不同支配系數(shù)，移動(dòng)速度不同，從而分別。（１）紙上層析濾紙為支持物，以濾紙纖維結(jié)合水為固定相，有機(jī)相為流淌相，支配系數(shù)不同而分別。（２）薄層層析固定相支持物鋪在支持板上成為薄層，有吸附薄層層析，支配薄層層析。back三、離子交換層析利用離子交換上的可解離基團(tuán)對(duì)各種離子的親和力不同，而使不同物質(zhì)分別。酶是兩性物質(zhì)，當(dāng)溶液的pH值大于酶的等電點(diǎn)時(shí)，酶分子帶負(fù)電荷，可用陰離子交換劑進(jìn)行層析分別，反之，用陽離子交換劑。用于酶分別純化的常用離子交換劑離子交換樹脂：大孔徑離子交換樹脂。離子交換纖維素：DEAE-纖維素，AE-纖維素，CMC（羧甲基纖維素）離子交換凝膠：DEAE葡聚糖凝膠、DEAE聚丙烯酰胺凝膠等。1、離子交換劑的處理與裝柱；2、上柱；3、冼脫和收集；4、離子交換劑的再生。２、離子交換層析的主要操作過程１、離子交換劑的選擇與處理是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)；引入不溶性母體的活性基團(tuán)可以是酸性基團(tuán)，作為陽離子交換劑；也可是堿性基團(tuán)，作為陰離子交換劑；平衡常數(shù)Ｋ；（１）離子交換劑的選擇；（２）離子交換劑的處理。back四、凝膠層析混合物隨流淌相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時(shí)，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分別的技術(shù)。凝膠層析是60年頭初發(fā)展起來的一種快速而又簡(jiǎn)便的分別技術(shù)。目前它已被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)及醫(yī)藥學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。從廣義上說凝膠是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，如自然物質(zhì)中的馬鈴薯淀粉及瓊脂糖凝膠，人工合成品的葡聚糖凝膠及帶離子交換基團(tuán)的葡聚糖凝膠等。制成顆粒狀，裝進(jìn)凝膠層析柱運(yùn)用。設(shè)備簡(jiǎn)潔，操作便利（不需經(jīng)過再生處理可反復(fù)運(yùn)用）。不須要有機(jī)溶劑，以及對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分別效果，適于不同分子量的各種物質(zhì)。凝膠顆粒McBain(1928)提出；Synge與Tiselins（1950）在說明凝膠層中的電泳和電滲現(xiàn)象時(shí)引用了分子篩的概念。此后發(fā)覺在柱層析中也有這種現(xiàn)象，于是很多工作者嘗試了一系列適用于生物高分子分別純化用的分子篩。1959年P(guān)orath與Flodim將部分水解的葡聚糖凝膠交聯(lián)，得到了商品名為交聯(lián)葡聚糖（Sephadex)的分子篩。該分子篩具有很多良好的性能，在蛋白質(zhì)的分別分析中已被廣泛接受。分子篩概念凝膠是分子篩的一種１、凝膠層析的基本原理凝膠顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，加入欲分別的混合物，大量蒸鎦水或其它稀溶液洗柱;分子量最大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，最終流出柱外。整個(gè)過程和過濾相像，故又名凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾等。由于物質(zhì)在分別過程中的阻滯減速現(xiàn)象，有人也稱之為阻滯擴(kuò)散層析、排阻層析等。Kd：支配系數(shù)，Kd小的物質(zhì)先流出。Ve：冼脫體積，表示某一組分從進(jìn)入導(dǎo)析柱到流出液中出現(xiàn)該組分高峰時(shí)，所需的冼脫液的體積。Vo：外體積。層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積Vi：內(nèi)體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和。表征式探討Kd=1Kd=00<Kd<1Ve=V0,組分足夠大,不進(jìn)入膠粒微孔,最先流出Ve=V0+Vi,可自由擴(kuò)散,最終流出Kd小的先流出,Kd大的后流出凝膠層析的基本原理（續(xù)）大分子小分子在凝膠內(nèi)流淌速度差異理論：（１）流淌分別理論（２）擴(kuò)散理論組分冼脫體積與相對(duì)分子量（Ｍ）關(guān)系：ＫavLgM葡聚糖凝膠Ｇ２００葡聚糖凝膠Ｇ１００Ｋav：相對(duì)洗脫體積1、葡聚糖凝膠：以葡聚糖為單體聚合而成的高分子聚合物。商品名為Sephader，從G-10到G-200共有8種型號(hào)。2、瓊脂糖凝膠：商品名為Sepharose（瑞典）Bib-gelA（美國(guó)）Gelarose（丹麥）。3、聚丙烯酰胺凝膠：商品名為Bio-gelP。２、凝膠的選擇與處理加入的酶液量為凝膠床體積的10%左右，不超過30%；冼脫液體積為凝膠床體積的120%左右；冼脫液與干膠溶漲和裝柱平衡用液相同。３、凝膠層析操作過程back五、親和層析利用生物分子對(duì)之間所具有的專一而又可逆的親和力使生物分子分別純化。可用于親和層析生物分子對(duì)酶-底物、酶-競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、酶-輔酶。配基(ligand)作為固定相（成對(duì)互配生物分子的任何一方）的一方；母體（載體、擔(dān)體）(matrix)不溶性，常用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等。１、親和層析母體和配體配基母體樣品樣品機(jī)理圖有兩大類力氣，構(gòu)成分子之間的專一性吸引力。一是兩個(gè)分子之間，其構(gòu)形有如積木般的互補(bǔ)，會(huì)因?yàn)榉兜氯A力的關(guān)系，產(chǎn)生專一性吸引力另一則為兩分子之間，因?yàn)槟承┗鶊F(tuán)間產(chǎn)生了二級(jí)鍵，所造成的吸引力。２、親和層析方法（１）共價(jià)親和層析（２）水層析（３）金屬離子親和層析（４）免疫親和層析（５）染料親和層析（６）凝集素親和層析back七電泳分別不同的物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)及顆粒大小和形態(tài)不同，因而在確定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不相同，因此可使它們分別。定義帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過程稱為電泳。原理水平電泳槽泳動(dòng)度帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度酸堿中F>0F=0H+H+OH-遷移原理圖其它因素（1）電場(chǎng)強(qiáng)度:指每厘米的電壓降；（2）溶液pH值:確定了顆粒分子所帶的凈電荷；（3）溶液離子強(qiáng)度:越高,顆粒泳動(dòng)越慢；（4）電滲:溶液對(duì)固體支持物的相對(duì)泳動(dòng)；此外,緩沖液的黏度、溫度對(duì)顆粒的泳動(dòng)速度也有影響。用途（酶工程領(lǐng)域）酶的純度鑒定;酶分子量測(cè)定;酶等電點(diǎn)測(cè)定;小批量酶的分別純化.水平電泳儀垂直電泳槽發(fā)展形式一、紙電泳二、薄層電泳三、薄膜電泳(link)四、凝膠電泳(link)五、等電聚焦電泳(link)常用的電泳技術(shù)毛細(xì)管電泳槽

back常用的電泳技術(shù)（續(xù)）一、紙電泳以濾紙為支持體的電泳技術(shù)二、薄層電泳將支持體與緩沖液調(diào)成適當(dāng)厚度的薄層進(jìn)行電泳三、薄膜電泳以醋酸纖維等高分子物質(zhì)制成的薄膜為支持體。back四、凝膠電泳垂直管型盤狀電泳；垂直板型電泳。定義以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支撐物（通常是聚丙烯酰胺凝膠）的電泳技術(shù)。形態(tài)單面垂直電泳槽

1、聚丙烯酰胺凝膠的制備（操作）電泳染色脫色定性、定量（測(cè)量電泳遷移率）制備凝膠go電泳圖譜膠膜放入底座膠膜固定在底座上

加膠放電梳

制膠完成取出

放入電泳槽中

安裝防護(hù)罩整套安裝完畢準(zhǔn)備電泳制膠圖示Back按裝置不同分垂直管型盤狀和垂直板型片狀；按凝膠組成系統(tǒng)不同分：2、凝膠電泳分類（1）連續(xù)凝膠電泳；（2）不連續(xù)凝膠電泳;（3）梯度凝膠電泳;（4）SDS-凝膠電泳;接受相同濃度的單體和交聯(lián)劑，相同pH值和濃度的緩沖液制備成連續(xù)勻整的凝膠，然后在同一條件下進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙兩烯酰胺在催化劑作用下聚合而成；丙烯酰胺單體濃度對(duì)凝膠孔徑有顯著影響1、連續(xù)凝膠電泳公式所運(yùn)用的凝膠由二或三層不同孔徑，不同pH的凝膠層組成;稀釋品在電泳定性中濃縮成層后再進(jìn)入分別膠分別。提高分率實(shí)力;使凈電荷不同或凈電荷相同但分子大小形態(tài)不同的物質(zhì)分別.2、不連續(xù)凝膠電泳樣品膠濃縮膠分別膠凝膠層由上至下分別為：樣品膠、濃縮膠、分別膠樣品膠包含樣品的大孔徑凝膠濃縮膠用于樣品濃縮成導(dǎo)線的大孔徑凝膠，不含樣品，其它與樣品膠一樣分別膠使樣品中各組分電泳分別的孔徑較小的凝膠濃縮膠成層，快離子、慢離子緣由凝膠中的丙烯酰胺濃度由上至下形成由低到高的連續(xù)梯度，凝膠內(nèi)部孔徑由上至下漸漸減小。不同分子量的顆粒電泳后停留在與其大小相對(duì)應(yīng)的位置上。適宜用于測(cè)定球蛋白等分子的分子量3、濃度梯度凝膠電泳4、SDS-凝膠電泳在聚丙烯酰胺凝膠制備時(shí)，加入1~2%的SDS（十二烷基硫酸鈉）而成。1967，Shapiro等發(fā)覺。前述的凝膠電泳中，遷移率主要取決于蛋白電荷及分子大小及形態(tài)；SDS-凝膠電泳中，電泳遷移率取決于蛋白分子量大小，而與其分子形態(tài)及其所帶電荷無關(guān)，故該方法主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)或酶的分子量。兩種不同形式的電泳為什么SDS-凝膠電泳會(huì)不受蛋白分子所帶電荷及分子形態(tài)影響呢？SDS陰離子帶負(fù)電荷，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上結(jié)合大量陰離子掩蓋了蛋白質(zhì)間原來的電荷差別；SDS與蛋白結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變更，在水溶液中變成長(zhǎng)橢圓形，短軸均為18A，長(zhǎng)軸與蛋白分子量成正比。故蛋白質(zhì)電泳遷移率主要取決于其分子量大小,關(guān)系可用如下式表示:取對(duì)數(shù):故測(cè)定某一蛋白質(zhì)的分子量,只需比較該蛋白質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白在SDS-凝膠電泳的遷移率即可.back五、等電聚焦電泳在電泳系統(tǒng)中加入兩性電解質(zhì)載體（在電場(chǎng)中能夠形成一個(gè)由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度），當(dāng)不同蛋白質(zhì)等進(jìn)入該體系中即移動(dòng)（聚焦）到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)得以分別。IEF原理pH連續(xù)增高pI點(diǎn)等電聚焦電泳分別酶蛋白pH大pH?。?）分辯率高（等電點(diǎn)僅差0.01~0.02pH）；（2）防止擴(kuò)散；（3）不管加樣部位；（4）樣品稀，重現(xiàn)性好；（5）測(cè)定等電點(diǎn)精確。等電聚焦電泳顯著特點(diǎn)等電聚焦電泳缺點(diǎn)（1）要求無鹽溶液，會(huì)產(chǎn)生沉淀；（2）對(duì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度低的組分不適。等電聚集電泳的實(shí)現(xiàn)1、兩性電解質(zhì)載體2、穩(wěn)定pH梯度形成3、支持pH梯度的介質(zhì)4、聚集電泳的操作1、兩性電解質(zhì)1966年Vesterberg等人合成載體兩性電解質(zhì)以后等電聚焦電泳才發(fā)展起來;為了獲得穩(wěn)定的pH梯度,必須要有性能優(yōu)良的載體兩性電解質(zhì),一般是由一系列帶有不同電荷性質(zhì)(因而有不同pI值)被稱為Ampholyte的聚氨基酸組成；當(dāng)酶試樣加在凝膠的一端進(jìn)行電泳時(shí),由于Ampholyte分子量小,泳動(dòng)快,先在電場(chǎng)中形成一梯度.蛋白質(zhì)分子受電場(chǎng)作用在這一pH梯度中各自遷移到與其等電點(diǎn)相同的位置,經(jīng)洗脫可得純化樣品.（1）足夠緩沖力，限制好pH梯度；（2）足夠?qū)щ娏?，且?dǎo)電系數(shù)相同；（3）分子質(zhì)量小，易分別；（4）與樣品組分不同，不發(fā)生反應(yīng)。2、穩(wěn)定pH梯度形成陽極槽酸液，陰極槽堿液+-H+OH-ABpIB>pIA3、等電聚焦電泳介質(zhì)（1）梯度溶液自由溶液在溶解中不添加穩(wěn)定介質(zhì)，而用機(jī)械方法使pH梯度保持穩(wěn)定，防止對(duì)流；樣品和載體兩性電解質(zhì)干脆與溶液混合；接受臥式電泳槽或豎式電泳管進(jìn)行。密度梯度接受密度梯度溶液使ph梯度穩(wěn)定,防止對(duì)流和避開已分別組分混合;密度梯度溶液由重溶液和輕溶液在梯度混合器中配制而成,常用的是蔗糖和甘油重溶液、部分載體兩性電解質(zhì)和樣品液置于混合室；輕液、部分載體兩性電解質(zhì)和樣品置于貯存室；啟動(dòng)攪拌器打開閥門，引入等電聚焦柱內(nèi)。（2）凝膠用聚丙烯酰胺等凝膠穩(wěn)定pH梯度的等電聚焦電泳制備方法與上述凝膠電泳一樣，但要加載體兩性電解質(zhì)；凝膠電泳兩極緩沖液相同，而凝膠等電聚焦陽極接受酸溶液，陰極接受堿溶液。4、聚集電泳的操作（1）pH梯度支持介質(zhì)的制備；（2）電泳（400V～800V）；（3）分別組分檢測(cè)或進(jìn)行下一步的SDS凝膠電泳。等電聚焦電泳的應(yīng)用與SDS—PAGE組合成雙向電泳；是蛋白質(zhì)組學(xué)中重要的探討技術(shù)。10,000V10–25CPeltiercooling12-stripIPGtraysfor

7,11,17,and18cmstripsback八萃取分別利用兩物質(zhì)在兩相中溶解度不同而使其分別的技術(shù)。按兩相組成不同分：一、有機(jī)溶劑萃取（link)二、雙水相萃?。╨ink)三、超臨界萃取（link)四、反膠束萃?。╨ink)back有機(jī)溶劑萃取利用溶質(zhì)在水和有機(jī)溶液中溶解度不同而分別。應(yīng)留意變性，在低溫下操作；過程：（1）選擇適宜有機(jī)劑；（2）含組分和水溶液與預(yù)冷的有機(jī)劑混合，靜止分層；（3）將水相與有機(jī)相分開；（4）除去有機(jī)劑，獲得產(chǎn)物。有機(jī)相水相back雙水相萃取兩相為互不相溶的兩水相，組分在兩相中溶解度不同而分別。1、雙水相形成將兩種親水性的聚合物都加在水溶液中,超過某一濃度產(chǎn)生兩相;成相是由于聚合物間不相溶,利用生物物質(zhì)在兩相中不同的支配實(shí)現(xiàn)分別.雙水相萃取(續(xù))關(guān)鍵點(diǎn):制備好雙水相系統(tǒng);首先選好適宜溶質(zhì);其次配制好溶液濃度和比例.雙水相相圖:聚合物Q或鹽/%聚合物P/%TBMT’B’C雙節(jié)線系線V1/V2=BM/BT雙水相萃取(續(xù))2、影響物質(zhì)支配的因素兩相組成；高分子聚合物分子量、濃度、極性；兩相溶液比例；酶分子量、電荷、極性；溫度、pH值等。親合支配雙水相萃取技術(shù)：乙二醇抗體人紅細(xì)胞兔紅細(xì)胞back超臨界萃取利用組分與雜質(zhì)在超臨界流體SCF中溶解度不同達(dá)到分別的一種萃取技術(shù)。PSCFGLST超臨界流體：同溫同壓下同物質(zhì)的液氣相的物理特性不同，當(dāng)溫度和壓力達(dá)到某特定數(shù)值時(shí)，氣液特性趨于相同，此數(shù)值為臨界點(diǎn)，當(dāng)溫度和壓力超過此點(diǎn)時(shí)，兩相變?yōu)橐幌?，此態(tài)下之流體稱為超臨界流體。超臨界萃取（續(xù)）超臨界流體物理特性和傳質(zhì)特性介于液體和氣體之間：具有和液體同樣的溶解實(shí)力，密度比氣體大得多，擴(kuò)散系數(shù)接近氣體，黏度大低于液體的。溶解度大的物質(zhì)溶解在超臨界流體中，然后升溫或降壓，使其變成氣態(tài)而得到所需物質(zhì)。CO2超臨界萃取工藝(1)萃取.在萃取罐中進(jìn)行;(2)分別.在分別罐中進(jìn)行.萃取罐分離罐超臨界萃?。ɡm(xù)）依據(jù)分別方法不同分別工藝有：1、等壓分別通過溫度變更進(jìn)行溶質(zhì)分別；2、等溫分別通過壓力變更使溶質(zhì)分別；3、吸附分別利用吸附劑將溶質(zhì)從超臨界CO2中吸附分別。在超臨界流體中加入少量夾帶劑提高分別效果。back反膠束萃取反膠束(reversedmicelle)，表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中形成的納米尺度的聚集體，是透亮、熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。利用反膠束將酶蛋白從混合液中萃取出來的純化技術(shù)。1977年Luisi等首先發(fā)覺胰凝乳蛋白酶可以溶解于含雙親物質(zhì)(表面活性劑)的有機(jī)溶劑中,超離心數(shù)據(jù)顯示有機(jī)相中有反膠束的存在,同時(shí),光譜分析(紫外2可見光譜、熒光光譜、旋光光譜)表明這一過程未引起酶的變性;1979年Luisi等考察了蛋白質(zhì)溶液的pH值、蛋白質(zhì)和雙親物質(zhì)的濃度對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響及蛋白質(zhì)在反膠束溶液中的光譜特性;1979年Menger和Yamada對(duì)反膠束溶液中酶的性質(zhì)進(jìn)行了探討。反膠束萃?。ɡm(xù)）1、膠束與反膠束的形成表面活性劑溶于水在水中聚集一起形成（正膠束）;極性基團(tuán)在外,非極性基團(tuán)在內(nèi),溶解非極性物質(zhì);表面活性劑(雙親物質(zhì))在非極性有機(jī)溶劑中自發(fā)聚集體,又稱為反膠團(tuán)、逆膠束(inversemicelle),極核具溶解極性物實(shí)力;反膠束作為液-液萃取法更具選擇性;過程:酶從水相萃取到反膠束相;酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移至其次水相.反膠束萃取（續(xù)）2、表面活性劑由極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)組成，分陽離子、陰離子和非離子型；如AOT（丁二酸乙已基酯磺酸鈉）為陰離子型;反膠束萃取中，通常與某些有機(jī)劑一起運(yùn)用。3、留意因素（1）水相pH,確定了蛋白表面帶電基團(tuán)離子化狀態(tài)；（2）離子強(qiáng)度，確定了帶電表面所賜予的靜電屏蔽程度。降低蛋白質(zhì)與反膠束帶電界面的靜電作用;降低了表面活性劑頭部基團(tuán)間靜電斥力,導(dǎo)致反膠束顆粒變小.back九酶的結(jié)晶定義溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。結(jié)晶是蛋白酶分別純化的一種手段，可獲得較高純度的酶。結(jié)晶的基本原理使母液中酶的溶解度漸漸降低，使處于稍飽和狀態(tài)使酶結(jié)晶出來。（1）酶液中酶的純度50%以上；多次重結(jié)晶，純度提高，收率下降。（2）酶液的濃度，太稀無法結(jié)晶，越濃越簡(jiǎn)潔結(jié)晶，太濃，結(jié)晶小。（3）其它因素：溫度、pH值、離子強(qiáng)度。影響酶結(jié)晶的主要因素鹽析結(jié)晶法有機(jī)溶劑結(jié)晶法透析平衡結(jié)晶等電點(diǎn)結(jié)晶法主要方法一、鹽析結(jié)晶法把飽和鹽溶液（常用硫酸銨）滴加到濃酶液中，至呈微渾濁，低溫（0~100C）靜置，析出結(jié)晶而后再補(bǔ)加飽和鹽溶液至結(jié)晶完全。干脆加固體鹽需緩慢和不斷攪拌。1、加鹽法2、抽提法（1）酶液先經(jīng)硫酸銨鹽析得到酶沉淀；（2）用較高飽和度的冰冷的硫酸銨溶液抽提，使一部分酶溶解；（3）分別后上清液于室溫下靜置，結(jié)晶；（4）剩下的沉淀依次用冰冷的較低飽和度