基因功能的基本策略

基因功能分析的基本策略StrategyforGeneFunctionAnalysis郭睿山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室后基因組研究焦點：基因功能研究CentralDogmaDNARNAtranscriptionProteintranslationTranscriptionFactorsAlt.SplicingAlt.Poly-A,Alt.TranslatinStartCentralDogmaDNARNAtranscriptionProteintranslationTranscriptionFactorsTGSPTGSTGS:TranscriptionalGeneSilencingPTGS:PostTranscriptionalGeneSilencing反向遺傳學——ReverseGeneticsGeneDNASequenceGeneDisruptionPhenotypeAnalysisFunctionDevelopmentPhysiologyCellBiologyGeneticallyLinkHomologousrecombinationOverexpressionAnti-senseRNAi抑制基因表達觀察功能變化KnockOut法Antisense法Ribozyme法RNAi法RNA干擾技術基因敲除技術基因轉染細胞模型轉基因動物模型基因功能分析的基本策略將某一基因從動物基因組中剔除或將外源基因引入動物基因組產生經過基因工程修飾（改造）的動物實現在整體和細胞水平認識基因的功能第一節(jié)轉基因技術

transgenictechnology

將外源源基因因導入入受精精卵細細胞或或胚胎胎干細細胞中中通過外外源基基因與與細胞胞染色色體DNA之間隨隨機發(fā)發(fā)生重重組將外源源基因因插入入到受受體細細胞染染色體體DNA中轉基因因動物物基因轉轉染細細胞模模型轉基因因動物物轉基因因動物物模型型實驗驗步驟驟轉基因載體體的構建；；將轉基因載載體導入受受精卵細胞胞或胚胎干干細胞；將轉基因受受精卵或胚胚胎干細胞胞植入假孕孕小鼠子宮宮內；對轉基因動動物進行鑒鑒定。轉基因載體體結構基基因報告基基因增強子子啟動子子受精全能性性細胞胞注射

植入假孕小小鼠后代SouthernblotRT-PCRWesternblot轉基因因小鼠鼠基因轉轉染細細胞模模型實實驗步步驟真核重重組表表達質質粒的的構建建；在原核核細胞胞中復復制擴擴增和和克隆隆化真真核重重組表表達質質粒；；將重組組表達達質粒粒轉染染哺乳乳動物物細胞胞；重組質質粒轉轉染細細胞的的克隆隆化篩篩選、、保存存；轉染細細胞表表達目目的蛋蛋白、、提取取、鑒鑒定。。轉染技技術脂質體體法脂質體體法將待轉轉染的的DNA溶液與與磷脂脂混合合，形形成脂脂質體體結構構，將將脂質質體懸懸液加加入到到細胞胞培養(yǎng)養(yǎng)液中中，與與受體體細胞胞膜發(fā)發(fā)生融融合，，DNA片段隨隨即進進入細細胞質質或細細胞核核內。。電擊法法在外加加電場場的作作用下下，細細胞膜膜電位位發(fā)生生改變變，細細胞質質膜瞬瞬間出出現可可逆性性的電電穿孔孔，從從而使使一定定數量量的外外源DNA從細細胞胞外外擴擴散散到到細細胞胞質質和和細細胞胞核核內內，，并并進進一一步步整整合合到到宿宿主主DNA上，，達達到到轉轉基基因因目目的的。。顯微微注注射射法法將外外源源DNA在顯顯微微操操作作系系統統的的輔輔助助下下，，直直接接將將外外源源DNA注入入哺哺乳乳動動物物受受精精卵卵的的原原核核內內，，使使外外源源基基因因整整合合到到基基因因組組上上，，制制備備轉轉基基因因動動物物。?；蛞驑寴尫ǚ▽⒁D轉染染的的DNA吸附附到到高高黏黏度度的的金金屬屬顆顆粒粒上上，，在在加加速速裝裝置置的的作作用用下下，，將將這這些些粒粒子子高高速速打打入入細細胞胞或或組組織織內內，，達達到到轉轉基基因因目目的的。。磷酸鈣法將待轉染的的DNA溶解在磷酸酸緩沖液中中，使DNA片段與磷酸酸鈣共沉淀淀并形成大大的顆粒；；加入貼壁壁培養(yǎng)的細細胞中被吸吸收，實現現轉基因。。瞬時轉染染：外源DNA不整合到到宿主染染色體中中，可存存在多個個拷貝，，能產生生高水平平的表達達，但通通常只持持續(xù)幾天天。穩(wěn)定轉染染：外源DNA既可以整整合到宿宿主染色色體中，，也可能能作為一一種游離離體存在在。外源源DNA整合到染染色體中中的概率率很小，，通常需需要通過過一些選選擇性標標記進行行反復篩篩選，得得到穩(wěn)定定轉染的的同源細細胞系。。第二節(jié)RNA干擾技術術RNAInterference(RNAi)加工dsRNA形成21-23nt小片段DicerRNAi的要素：：DicerDicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNAsiRNA19ntduplex2nt3’overhangsRNA誘導沉默默復合物物RISC對靶mRNA的切割是以內內切的方式進進行的，而且且切割僅發(fā)生生在與siRNA同源的部分。。RNAi的要素：RISCRISC:RNA-InducedSilencingComplexExonucleaseHomologysearchactivityEndonucleaseHelicase5’3’TargetmRNAOH3’5’P形成RISC復合物，降解解目的mRNAdsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表達達的機理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNARNAi機制DicerRISC堿基互補補酶解RNA干擾實驗驗的基本本過程1.確定干擾擾靶點干涉靶點點序列應應具備的的條件：：①盡量量避開蛋蛋白結合合位點；；②一般般應具有有AA（N19）TT或AA（N21）序列特特征；③G＋C比比比例例為為50%左右右；；④被被干干涉涉的的靶靶序序列列應應該該是是特特異異性性的的，，和和其其它它RNA沒有有同同源源性性；；⑤通通常常一一個個基基因因需需要要設設計計多多個個靶靶序序列列的的siRNA，以以找找到到最最有有效效的的siRNA序列列提供供RNAi在線線技技術術支支持持的的公公司司（（網網站站））2.將候候選選的的靶靶點點序序列列和和相相應應的的基基因因組組數數據據庫庫等等進進行行BLAST比較較3.制備備siRNAsiRNA制備備常常用用的的五五種種方方法法：化學學合合成成體外外轉轉錄錄長片片斷斷dsRNAs經RNaseIII類降降解解siRNA表達達載載體體在在細細胞胞中中表表達達形形成成shRNAsPCR制備的siRNA表達框在細胞胞中表達化學合成質量高，高純純度，高成本本適用于已經驗驗證過抑制效效率的靶點序序列不適于篩選靶靶點序列體外轉錄成本適中，省省時，適用于于篩選靶點序序列不適用于長期期的研究或者者針對某個特特定靶點序列列的大量研究究長片斷dsRNA酶解法dsRNA在體外被RnaseⅢⅢ家族成員切割割成siRNA不需要驗證篩篩選多個靶點點序列不適用于長期期研究或者特特定siRNA序列的研究siRNA表達質?；蛘哒卟《据d體在在細胞中表達達siRNAsAAACCAGCAGAACGTGTACGA載體介導的細細胞內表達siRNA方法的特點操作簡便，穩(wěn)穩(wěn)定性好siRNA表達載體一旦旦構建成功，，可以無限制制的應用于研研究適用于長期的的對于某個基基因的研究，，尤其是帶有有篩選標記的的載體，能夠夠用于構建特特定基因缺陷陷的細胞株4.對目標RNA的干擾轉染靶細胞對目標RNA干涉程度進行行分析：可采采用RT-PCR在RNA水平上監(jiān)測、、Westernblot在蛋白質水平平上進行監(jiān)測測RNAi實例(載體法)：Targetgene：c-myc查找靶基因mRNA利用網絡在線線支持，尋找找siRNA序列根據查找的siRNA序列，合成長長鏈oligo構建載體轉染檢測效應（包包括干擾效應應和生物學效效應）1、檢索文獻獲獲取有實驗證證明有效的靶靶點序列（核核對）目的基因mRNA獲取：載體構建：dsDNA形成：退火載載體的酶酶切和回收連連接接轉轉化鑒鑒定轉染：瓶頸之一含有真核細胞胞篩選標志含含有熒光標標志效應檢測：mRNA水平和蛋白水水平兼顧(a)(b)24h48h干擾組陰性對照組1.00.80.60.40.20mRNA相對表達量c-actinPokemon

500300500300(d)

Pokemonβ-actin(a)Pokemon蛋白相對表達量干擾組陰性對照組48h72h1.00.80.60.40.20RNA干擾的應用基因治療方面面抗腫瘤——應用RNAi技術抑制腫瘤瘤細胞血管生生長因子如血血管生成素、、angi1、angi2、angi3及VEGF等或其受體的的表達，抑制制腫瘤細胞癌癌基因bcl2、RAS、Tp53等突變基因因及其蛋白白的表達達達到抗腫瘤瘤生長及轉轉移的目的的抗器官移植植排斥反應應——細胞間粘附附分子-1（ICAM-1）是重要的的介導細胞胞粘附和T細胞激活的的分子，應應用與ICAM-1基因序列特特異的siRNA阻斷ICAM-1mRNA和蛋白的表表達，可以以明顯降低低大鼠同種種移植心的的移植物血血管病的發(fā)發(fā)生的程度度和缺血再再灌注損傷傷?？共《尽固垢ａt(yī)學學院運用此此技術來治治療丙型肝肝炎把dsRNA轉入小鼠的的肝細胞，，被分解成成siRNA后與小小鼠體體內的的丙型型肝炎炎病毒毒mRNA相結合合，使使之分分解并并失去去轉譯譯蛋白白質的的功能能。已從體體外試試管實實驗階階段推推進至至體內內的動動物實實驗且在小小鼠模模型看看到丙丙型肝肝炎病病毒被被阻斷斷的明明顯效效果利用siRNA治療疾疾病需需要解解決幾幾個問問題：：導入問問題：：使用用高效效載體體傳遞遞siRNA；給藥方方式：：因為為RNA容易被被降解解，如如何提提高siRNA在體內內的穩(wěn)穩(wěn)定性性；高選擇擇性：：如何何靶向向特定定細胞胞而不不影響響其他他細胞胞。第三節(jié)節(jié)基基因因敲除除技術術GeneKnock-out通過DNA同源重重組定向將將外源源基因因插入入宿主主細胞胞染色色體DNA中從而使使特定定目的的基因因在細細胞內內或生生物體體內失失活EmbryonicStemCells同源重重組targettargetingvectorhomologousrecombination“knockout”TK5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′5′3′3′3′3′待剔除除基因因克隆克隆載載體重組載載體切割基基因使使待剔剔除基基因失失去活活性陽性標標記基基因Neor連接HSV-tk打靶載載體打靶載載體內切酶酶消化化線性化化打靶靶載體體轉染基因組組同源重重組同源重重組胚泡植入入假孕孕小小鼠鼠雜合合子子小小鼠鼠正常常小小鼠鼠雜合合子子小小鼠鼠交配配雜合合子子小小鼠鼠兄妹妹交交配配純合合子子小小鼠鼠（（基基因因剔剔除除））9、靜夜夜四無無鄰，，荒居居舊業(yè)業(yè)貧。。。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、雨中中黃葉葉樹，，燈下下白頭頭人。。。05:53:0605:53:0605:5312/23/20225:53:06AM11、以我獨沈沈久，愧君君相見頻。。。12月-2205:53:0605:53Dec-2223-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。05:53:0605:53:0605:53Friday,December23,202213、乍乍見見翻翻疑疑夢夢，，相相悲悲各各問問年年。。。。12月月-2212月月-2205:53:0605:53:06December23,202214、他他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生生白白發(fā)發(fā)，，舊舊國國見見青青山山。。。。23十十二二月月20225:53:06上上午午05:53:0612月月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月225:53上上午12月-2205:53December23,202216、行行動動出出成成果果，，工工作作出出財財富富。。。。2022/12/235:53:0605:53:0623December202217、做做前前，，能能夠夠環(huán)環(huán)視視四四周周；；做做時時，，你你只只能能或或者者最最好好沿沿著著以以腳腳為為起起點點的的射射線線向向前前。。。。5:53:06上上午午5:53上上午午05:53:0612月月-229、沒有失敗，，只有暫時停停止成功！。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多事情努努力了未必有有結果，但是是不努力卻什什么改變也沒沒有。。05:53:0605:53:0605:5312/23/20225:53:06AM11、成功就是是日復一日日那一點點點小小努力力的積累。。。12月-2205:53:0605:53Dec-2223-Dec-2212、世間成事事，不求其其絕對圓滿滿，留一份份不足，可可得無限完完美。。05:53:0605:53:0605:53Friday,December23,202213、不知香積積寺，數里里入云峰。。。12月-2212月-2205:53:0605:53:06December23,202214、意意志志堅堅強強的的人人能能把把世世界界放放在在手手中中像像泥泥塊塊一一樣樣任任意意揉揉捏捏。。23十十二二月月20225:53:06上上午午05:53:0612月月-2215、楚塞塞三湘湘接，，荊門門九派派通。。。。。十二月月225:53上上午午12月月-2205:53December23,202216、少年年十五五二十十時，，步行行奪得得胡馬馬騎。。。2022/12/235:53:0605:53:0623December202217、空山新新雨后，，天氣晚晚來秋。。。5:53:06上午午5:53上午午05:53:0612月-229、楊柳散和風風，青山澹吾吾慮。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、閱讀一切好好書如同和過過去最杰出的的人談話。05:53:0605:53:0605:5312/23/20225:53:06AM11、越越是是沒沒有有本本領領的的就就越越加加自自命命不不凡凡。。12月月-2