活細(xì)胞工作站的應(yīng)用課件

形態(tài)暨影像公共平臺(tái)生理129室

形態(tài)暨影像公共平臺(tái)生理129室形態(tài)暨影像公共平臺(tái)激光共聚焦顯微鏡(LaserScanConfocalMicroscope，LSCM，Leica)流式細(xì)胞儀(Flowcytometry，BD)形態(tài)暨影像公共平臺(tái)激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡

(LaserScanConfocalMicroscope)儀器名稱：Leica激光共聚焦顯微鏡型號(hào)：LeicaTCSSP5II國(guó)別：德國(guó)徠卡激光共聚焦顯微鏡

(LaserScanConfocal主要技術(shù)指標(biāo)1.激光器：

HeNeRed:633nm；

HeNeGreen:543nm；

Ar:458nm,476nm,488nm,514nm；近紫外:405nm。2.檢測(cè)通道：3個(gè)光譜型檢測(cè)通道，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍400-800nm。3.掃描系統(tǒng)：線掃描速度(雙向)：2800線/sec，連續(xù)可調(diào)；掃描分辨率：8192×8192像素；最大幀頻：512×512主要技術(shù)指標(biāo)1.激光器：物鏡的配置10×；20×；40×；63×(油鏡)；63×(水鏡)；物鏡的配置10×；利用水浸物鏡進(jìn)行長(zhǎng)期活細(xì)胞觀察水浸物鏡可以獲得最高的分辨率和對(duì)比度。自動(dòng)加水設(shè)備，保證移入樣本后對(duì)比度不會(huì)下降。無(wú)對(duì)焦錯(cuò)誤,運(yùn)動(dòng)過(guò)程中水膜不會(huì)破裂。利用水浸物鏡進(jìn)行長(zhǎng)期活細(xì)胞觀察水浸物鏡可以獲得最高的分辨率和應(yīng)用范圍：用于研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)(囊泡、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)復(fù)合體等的轉(zhuǎn)運(yùn)、分子相互作用、細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化、細(xì)胞分裂和細(xì)胞器發(fā)生過(guò)程等);對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和活動(dòng)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量、定時(shí)和定位分布觀察。研究方法包括免疫熒光染色（單染、雙染、三染）、活細(xì)胞熒光標(biāo)標(biāo)記、FRAP(FlourescenceRecoveryAfterPhoto-bleaching)、FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)等。應(yīng)用范圍：用于研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)(囊泡、細(xì)胞器、蛋活細(xì)胞工作站的應(yīng)用

(Livecellimagingsystem)熒光標(biāo)記蛋白的長(zhǎng)時(shí)間跟蹤觀測(cè)活細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及形態(tài)跟蹤觀測(cè)熒光共定位熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET熒光圖像處理、測(cè)量活細(xì)胞工作站的應(yīng)用

(Livecellimaging活細(xì)胞工作站的優(yōu)點(diǎn)實(shí)時(shí)觀測(cè)自動(dòng)聚焦單細(xì)胞追蹤多位點(diǎn)成像成像速度快活細(xì)胞工作站的優(yōu)點(diǎn)實(shí)時(shí)觀測(cè)活細(xì)胞工作站與共聚焦的區(qū)別活細(xì)胞工作站：細(xì)胞立體感強(qiáng)成像速度快：＜500ms光毒性小多點(diǎn)拍攝主要用于活細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察（GFP，CFP、YFP，RFP）激光共聚焦：平面掃描成像速度慢：1-2min清晰度較好光毒性主要用于固定后的組織、細(xì)胞。活細(xì)胞工作站與共聚焦的區(qū)別活細(xì)胞工作站：活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件的控制溫度的保持；（加熱的載物臺(tái)，加熱循環(huán)空氣，物鏡加熱器，恒溫箱）pH值的保持，即CO2的供應(yīng)（5%CO2）；培養(yǎng)基離子濃度的保持；O2（95%O2）的要求?；罴?xì)胞實(shí)驗(yàn)條件的控制溫度的保持；（加熱的載物臺(tái)，加熱循環(huán)空氣標(biāo)本的準(zhǔn)備要點(diǎn)盡量使用0.17mm厚玻璃底的培養(yǎng)皿（LabＴｅｋ）因?yàn)楦邤?shù)值孔經(jīng)徑物鏡能發(fā)揮其最大效應(yīng)。對(duì)于不容易在玻璃上生長(zhǎng)的細(xì)胞，使用包被了poly-lysine或相似物質(zhì)的玻璃底培養(yǎng)皿。標(biāo)本的準(zhǔn)備要點(diǎn)盡量使用0.17mm厚玻璃底的培養(yǎng)皿（Lab綠色熒光蛋白

（GreenFluorescentProtein，GFP）可溶性蛋白，性質(zhì)穩(wěn)定。熒光基團(tuán)明亮。熒光在活細(xì)胞中即可觀察，不需固定和加工。GFP基團(tuán)和目的基因做成融合蛋白后，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。表達(dá)GFP融合產(chǎn)物的細(xì)胞能在活的狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。綠色熒光蛋白

（GreenFluorescentProtTransfectionIncubatethecells:30-40%or70%-80%confluence.Transfection:lipofectamine2000Transienttransfection:usedforimagingdirectly.Selectstablecelllines:48h,G418,2-3weeks.TransfectionIncubatethecellCheckwhetherpDsRed1-mitocanprobemitochondriainCMs

byusingconfocalmicroscope

生理樓2012.09.04MitoGreenpDsRed1MitoMergeX63X63CheckwhetherpDsRed1-mitocan2.5h

2.5h

形態(tài)暨影像公共平臺(tái)生理129室

形態(tài)暨影像公共平臺(tái)生理129室形態(tài)暨影像公共平臺(tái)激光共聚焦顯微鏡(LaserScanConfocalMicroscope，LSCM，Leica)流式細(xì)胞儀(Flowcytometry，BD)形態(tài)暨影像公共平臺(tái)激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡

(LaserScanConfocalMicroscope)儀器名稱：Leica激光共聚焦顯微鏡型號(hào)：LeicaTCSSP5II國(guó)別：德國(guó)徠卡激光共聚焦顯微鏡

(LaserScanConfocal主要技術(shù)指標(biāo)1.激光器：

HeNeRed:633nm；

HeNeGreen:543nm；

Ar:458nm,476nm,488nm,514nm；近紫外:405nm。2.檢測(cè)通道：3個(gè)光譜型檢測(cè)通道，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍400-800nm。3.掃描系統(tǒng)：線掃描速度(雙向)：2800線/sec，連續(xù)可調(diào)；掃描分辨率：8192×8192像素；最大幀頻：512×512主要技術(shù)指標(biāo)1.激光器：物鏡的配置10×；20×；40×；63×(油鏡)；63×(水鏡)；物鏡的配置10×；利用水浸物鏡進(jìn)行長(zhǎng)期活細(xì)胞觀察水浸物鏡可以獲得最高的分辨率和對(duì)比度。自動(dòng)加水設(shè)備，保證移入樣本后對(duì)比度不會(huì)下降。無(wú)對(duì)焦錯(cuò)誤,運(yùn)動(dòng)過(guò)程中水膜不會(huì)破裂。利用水浸物鏡進(jìn)行長(zhǎng)期活細(xì)胞觀察水浸物鏡可以獲得最高的分辨率和應(yīng)用范圍：用于研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)(囊泡、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)復(fù)合體等的轉(zhuǎn)運(yùn)、分子相互作用、細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化、細(xì)胞分裂和細(xì)胞器發(fā)生過(guò)程等);對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和活動(dòng)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量、定時(shí)和定位分布觀察。研究方法包括免疫熒光染色（單染、雙染、三染）、活細(xì)胞熒光標(biāo)標(biāo)記、FRAP(FlourescenceRecoveryAfterPhoto-bleaching)、FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)等。應(yīng)用范圍：用于研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)(囊泡、細(xì)胞器、蛋活細(xì)胞工作站的應(yīng)用

(Livecellimagingsystem)熒光標(biāo)記蛋白的長(zhǎng)時(shí)間跟蹤觀測(cè)活細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及形態(tài)跟蹤觀測(cè)熒光共定位熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET熒光圖像處理、測(cè)量活細(xì)胞工作站的應(yīng)用

(Livecellimaging活細(xì)胞工作站的優(yōu)點(diǎn)實(shí)時(shí)觀測(cè)自動(dòng)聚焦單細(xì)胞追蹤多位點(diǎn)成像成像速度快活細(xì)胞工作站的優(yōu)點(diǎn)實(shí)時(shí)觀測(cè)活細(xì)胞工作站與共聚焦的區(qū)別活細(xì)胞工作站：細(xì)胞立體感強(qiáng)成像速度快：＜500ms光毒性小多點(diǎn)拍攝主要用于活細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察（GFP，CFP、YFP，RFP）激光共聚焦：平面掃描成像速度慢：1-2min清晰度較好光毒性主要用于固定后的組織、細(xì)胞?；罴?xì)胞工作站與共聚焦的區(qū)別活細(xì)胞工作站：活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件的控制溫度的保持；（加熱的載物臺(tái)，加熱循環(huán)空氣，物鏡加熱器，恒溫箱）pH值的保持，即CO2的供應(yīng)（5%CO2）；培養(yǎng)基離子濃度的保持；O2（95%O2）的要求?；罴?xì)胞實(shí)驗(yàn)條件的控制溫度的保持；（加熱的載物臺(tái)，加熱循環(huán)空氣標(biāo)本的準(zhǔn)備要點(diǎn)盡量使用0.17mm厚玻璃底的培養(yǎng)皿（LabＴｅｋ）因?yàn)楦邤?shù)值孔經(jīng)徑物鏡能發(fā)揮其最大效應(yīng)。對(duì)于不容易在玻璃上生長(zhǎng)的細(xì)胞，使用包被了poly-lysine或相似物質(zhì)的玻璃底培養(yǎng)皿。標(biāo)本的準(zhǔn)備要點(diǎn)盡量使用0.17mm厚玻璃底的培養(yǎng)皿（Lab綠色熒光蛋白

（GreenFluorescentProtein，GFP）可溶性蛋白，性質(zhì)穩(wěn)定。熒光基團(tuán)明亮。熒光在活細(xì)胞中即可觀察，不需固定和加工。GFP基團(tuán)和目的基因做成融合蛋白后，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。表達(dá)GFP融合產(chǎn)物的細(xì)胞能在活的狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。綠色熒光蛋白

（GreenFluorescentProtTransfectionIncubatethecells:30-40%or70%-80%confluence.Transfection:lipofectamine2000Transienttransfection:usedforimagingdirectly.Selectstablecelllines:48h,G418,2-3weeks.