微生物檢測(cè)領(lǐng)域新技術(shù)介紹課件

產(chǎn)品經(jīng)理鄒黎明回顧近幾年微生物檢測(cè)儀器的變化沉降法測(cè)浮游菌回顧近幾年微生物檢測(cè)儀器的變化人工稀釋自動(dòng)稀釋回顧近幾年微生物檢測(cè)儀器的變化傳統(tǒng)滅菌及手動(dòng)倒平板自動(dòng)制備及分裝系統(tǒng)回顧近幾年微生物檢測(cè)儀器的變化手工液體分裝自動(dòng)液體分裝蠕動(dòng)泵液體分裝回顧近幾年微生物檢測(cè)儀器的變化手工計(jì)數(shù)簡(jiǎn)單的自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)壓力傳感式累加計(jì)數(shù)高級(jí)自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)回顧近幾年微生物檢測(cè)儀器的變化手工鑒定數(shù)據(jù)編碼軟件輔助鑒定全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)靈敏度問題

導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果檢測(cè)速度問題

通常需要3-7天靈敏度問題25g+225g(mL)稀釋→均質(zhì)→增菌（1－3次）→取1mL菌液提取DNA→PCR檢測(cè)一般定量PCR方法的檢測(cè)限從數(shù)十個(gè)至幾千個(gè)菌，也即是說250mL體系里要有數(shù)萬個(gè)至上百萬個(gè)菌才有可能檢出。免疫磁分離方法，無需選擇性增菌，快速實(shí)現(xiàn)高特異性分離。大樣循環(huán)，提高靈敏度減少樣品基質(zhì)的干擾減少其它微生物的干擾，減少假陽(yáng)性BiomereiuxVIDASTECRAELISADuPontBAXIDAHORAPIDLTROCHELightCyclerBioRad-IQBioAppliedBioSystemsCepheidSmartCyclerBioControlGDSOXOIDBECTONDICKINSONMETHODKEY=PCR

methods=Colourimetricmethods=PlateBased

MethodsPATHATRIXHASBEENSUCCESFULLYCOUPLEDTO….

取樣量比較完整樣品250,000μlPCR/ELISA5μl-100μl=225ml+25gfoodsample–standardPathatrix=50mlPooledsub-sample=0.05-0.1mlPCR/ELISAsub-sampleKEY

混合樣50,000μl非選擇性增菌數(shù)小時(shí)或過夜250mL或1375mL循環(huán)捕獲免疫磁分離大樣分離原理外磁場(chǎng)捕獲磁分離免疫磁分離大樣分離原理洗滌去除干擾雜質(zhì)撤離磁場(chǎng)，洗脫，實(shí)現(xiàn)大樣濃縮通常絕大多數(shù)病毒帶負(fù)電荷，Matrix公司提供一種試劑PCAT50，它是一種帶磁性的陽(yáng)離子樹脂，可以將大量樣品中的病毒通過循環(huán)捕獲進(jìn)行濃縮純化，可以大大提高靈敏度，減少樣品基質(zhì)的干擾。Pathatrix免疫純化30分鐘定量PCR快速確認(rèn)<1hrSTANDARDPATHATRIXSAMPLEReplacecapandBeadBeatfor5minonVortexGeniewithTurboMixonhighestsettingTransfer25μlofbeadsuspensionintoSmallBeadTubeAdd100μlPBStoRe-suspendthebeadsPLATEOUTbeadsuspensionfromPathatrix(75μl)Transfer10μlofbeadfreesupernatantto‘unknown’vialPCR+VE?MagneticCaptureRackCaptureBeadsfor1minAdd10μlofPCRReconstitutionBufferto‘unknown’testvial(optional)25μl

Transfer18μlfrom‘Unknown’testvials9618μlUR10μlTestSample10μlReconstitutionBufferMIXWELLCapandSpin(3secs)tocapillaries.

PlacetestcapillariesinR.A.P.I.D.LTcarousel,Check-/+

PCRcontrolsareinposition1&2CloselidandfollowscreenshotprotocoltobeginPCRtestBeadfreeSupernatant單獨(dú)用定量PCR檢測(cè)微生物干擾物質(zhì)多單獨(dú)用定量PCR需要將菌增菌至104-105/mL，時(shí)間較長(zhǎng)免疫磁分離可大大減少干擾免疫磁分離由于采用了大樣循環(huán)，只需將菌增菌至102-103/mL就已經(jīng)足夠。減少樣品基質(zhì)的干擾，提高檢測(cè)靈敏度加快檢測(cè)速度處理公共應(yīng)急突發(fā)事件，將免疫磁分離與定量PCR結(jié)合，快速在2小時(shí)內(nèi)獲取結(jié)果。做為一個(gè)方法儲(chǔ)備“零”成本微生物鑒定時(shí)代即將來臨美國(guó)MIT公司全稱MicroEmagingTechnology是一家上市高新技術(shù)公司(OTCBB"MMTC"),MIT采用全新專利技術(shù)研發(fā)的MIT1000致病微生物快速鑒定系統(tǒng)，是一項(xiàng)具有劃時(shí)代的影響深遠(yuǎn)的革命性的技術(shù)，對(duì)微生物檢測(cè)領(lǐng)域無疑是一次質(zhì)的飛躍和突破，從此政府和企業(yè)不必再承擔(dān)高昂的微生物鑒定成本。MIT1000采用全新設(shè)計(jì)理念，與傳統(tǒng)的檢測(cè)表型或基因型方法鑒定微生物的原理完全不同，它采用660nm激光照射微生物活體細(xì)胞，通過35個(gè)光學(xué)檢測(cè)器全方位檢測(cè)反射和透射光譜信號(hào)，信號(hào)經(jīng)過特殊算法合成一個(gè)光譜圖，每種微生物的特征圖譜是不同的，用各種標(biāo)準(zhǔn)菌株建立光譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定時(shí)系統(tǒng)只需分析10-50個(gè)細(xì)胞的光譜圖，在10分鐘內(nèi)將檢測(cè)到的圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，給出最可能的鑒定結(jié)果。35個(gè)光學(xué)檢測(cè)頭全方位檢測(cè)光譜信號(hào)鑒定10-50個(gè)微生物即可出結(jié)果鑒定10-50個(gè)微生物即可出結(jié)果鑒定10-50個(gè)微生物即可出結(jié)果鑒定成本低至1元人民幣，與其它產(chǎn)品相比，無需專用鑒定耗材，檢測(cè)成本幾乎可以忽略鑒定速度快。只需挑取菌種，用無菌過濾水稀釋后上機(jī)鑒定，10分鐘出鑒定結(jié)果。目前可鑒定26種常見致病菌，數(shù)據(jù)庫(kù)正在不斷升級(jí)中。已經(jīng)獲得AOAC權(quán)威認(rèn)可芽胞菌：蠟樣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌產(chǎn)氣腸桿菌糞腸球菌E.coli,E.coliO157:H7肺炎桿菌克氏庫(kù)克菌李斯特菌spp奇異變形桿菌，普通變形桿菌綠膿桿菌沙門氏菌：豬霍亂沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌志賀氏菌：鮑氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌葡萄球菌：金黃色葡萄球菌、抗新青霉素型金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌化膿性鏈球菌小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌認(rèn)證號(hào)：2009_060901認(rèn)證結(jié)論：

ThePTMblindtestscoreof99%indicatesthattheMIT1000RMIDSystemcanaccurately

identifyListeriaanddistinguishitfromotherbacteriaandwerecommendthatthisMethodbe

approvedbyAOACRI.Thetestprotocolrequiredatotalof81blindtests–55donebytheMITlaboratoryand26donebytheUSDAARSlaboratory.Eightyof81testswerecorrectlyidentifiedyieldingascoreof99%.食品、藥品和化妝品企業(yè)對(duì)致病菌進(jìn)行快速鑒定用政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)致病菌進(jìn)行快速低成本鑒定CDC、醫(yī)院等對(duì)病原菌進(jìn)行快速鑒定，節(jié)省大量檢測(cè)成本。數(shù)據(jù)庫(kù)還需要再擴(kuò)充在中國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)化問題進(jìn)一步增加AOAC認(rèn)證項(xiàng)目流式細(xì)胞與活細(xì)胞熒光標(biāo)記技術(shù)在微生物快速檢測(cè)中的應(yīng)用華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司樣品過濾或稀釋平板上培養(yǎng)培養(yǎng)2-14天讀數(shù)SinglecellColonyGrowthphase2-14days

90%的微生物測(cè)試使用此方法達(dá)到130年之久，傾注平板法由RobertKoch(1843-1910)和JuliusRichardPetri(1852-1921)發(fā)明，從單細(xì)胞至可見菌落需要幾天時(shí)間速度慢經(jīng)典時(shí)間2–14天事后性的追溯速度與靈敏度的折衷方案靈敏度不一致結(jié)果取決于微生物區(qū)系，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件孢子、受抑制的或厭氧的微生物需要延長(zhǎng)相當(dāng)長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間目前的常規(guī)微生物快速檢測(cè)方法顯微鏡快速計(jì)數(shù)優(yōu)點(diǎn)：輔助適當(dāng)染色劑，可快速地用于澄清的、高菌數(shù)的樣品進(jìn)行定性或粗略定量檢測(cè)，一般用于水、飲料、酒類產(chǎn)品中的無菌檢測(cè)或污染菌檢測(cè)缺點(diǎn)：耗時(shí)費(fèi)力，無法高通量，容易假陰性或假陽(yáng)性，低菌數(shù)的樣品需要過濾濃縮。目前的常規(guī)微生物快速檢測(cè)方法ATP快速檢測(cè)法(三磷酸腺苷)優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)線或管道清潔程度快速檢測(cè)；純培養(yǎng)微生物數(shù)量粗略定量；無菌產(chǎn)品保溫?cái)?shù)天后高通量快速檢測(cè)；缺點(diǎn)：ATP法一般檢測(cè)限細(xì)菌是10000個(gè)，酵母10個(gè)；受非微生物ATP干擾易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；微生物的生長(zhǎng)狀況影響，樣品保存條件，基質(zhì)的干擾等各種因素影響較大物理參數(shù)間接測(cè)定微生物(電導(dǎo)率、二氧化碳、顏色)優(yōu)點(diǎn)：菌數(shù)越高，越快出結(jié)果.電導(dǎo)率方法成本較低缺點(diǎn)：需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線；要讓菌數(shù)長(zhǎng)到上百萬個(gè)才有明顯的信號(hào)變化；基于二氧化碳和顏色變化的方法檢測(cè)成本太高；受樣品基質(zhì)干擾較大；微生物區(qū)系復(fù)雜偏差較大。優(yōu)點(diǎn)：直接對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，無需長(zhǎng)成菌落；檢測(cè)時(shí)間只需1小時(shí)；靈敏度可以達(dá)到1-100個(gè)菌有全自動(dòng)或半自動(dòng)儀器可選缺點(diǎn)：儀器投入較大；檢測(cè)成本相對(duì)較高。

Fluorassure?

Reagents熒光標(biāo)記試劑ChemScan

?

RDI細(xì)胞掃描讀數(shù)用于可過濾產(chǎn)品D-Count?

全自動(dòng)流式細(xì)胞用于可過濾或不可過濾產(chǎn)品BactiFlow?

緊湊型流式細(xì)胞儀用于可過濾或不可過濾產(chǎn)品基于單個(gè)完整細(xì)胞的熒光標(biāo)記技術(shù)可對(duì)總活菌數(shù)及特定微生物十幾年工業(yè)應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)大量的科學(xué)文獻(xiàn)支持酶活性底物游離熒光色原細(xì)菌活細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn):

酶活力

膜完整性用于:TVC總活菌數(shù)

酵母和霉菌總數(shù)

細(xì)菌酵母霉菌流式細(xì)胞技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

用于可過濾或不可過濾產(chǎn)品的微生物快速計(jì)數(shù)靈敏度可以達(dá)到1-100個(gè)細(xì)胞30-60min完成檢測(cè)單細(xì)胞標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)流式細(xì)胞:

線性流體

單細(xì)胞分析

高靈敏檢測(cè)器紅光檢測(cè)器與鞘液混合后的廢液綠光檢測(cè)器標(biāo)記后的樣品激光鞘液鞘液流速：10mL/min樣品流速：200uL/min前處理后的樣品放入自動(dòng)儀器中

每批25或50個(gè)樣品自動(dòng)化儀器，減少人工操作全自動(dòng)標(biāo)記和過濾

自動(dòng)加所有試劑

自動(dòng)控制保溫溫度和時(shí)間快速靈敏的分析

每小時(shí)50個(gè)樣品

結(jié)果直接顯示每mL多少個(gè)菌數(shù)飲料

果汁及濃縮汁

原奶、UHT奶、巴氏奶

軟飲料食品酸奶

水果制品

甜品

蔬菜制品肉類部分調(diào)味品全球重要客戶名單Antartic,UnileverBestFood,Campbell,Coca-Cola,Danone,Délifruits,EckesGranini,Gerber,IFF,InstitutPasteur,Joker,MoetetChandon,Migro,Mona,Müller,Nestlé,Onken,Sill,SwissDairyFood,Yoplait,Zott,Zuegg,…BDF,L’Oréal,P&G,Roval,YvesRocher,YvesSaintLaurent,…ChemScanòRDI

用于可過濾產(chǎn)品的微生物或原生蟲快速計(jì)數(shù)靈敏度可以達(dá)到1個(gè)細(xì)胞100min完成檢測(cè)2.標(biāo)記3.激光掃描3min1.過濾

1.過濾2.標(biāo)記3.激光掃描樣品過濾濾膜墊板含飽和預(yù)標(biāo)記液主要目的是激活細(xì)胞內(nèi)酶活力，增加膜通透性預(yù)標(biāo)記60min濾膜轉(zhuǎn)移ChemScanRDI

?

激光掃描濾膜墊板含飽和預(yù)標(biāo)記液主要目的是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記標(biāo)記30min對(duì)濾膜進(jìn)行全場(chǎng)掃描3分鐘掃描時(shí)間結(jié)果直接顯示細(xì)胞個(gè)數(shù)激光掃描掃描后的圖像可接顯微鏡快速確認(rèn)固定細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域飲用水總活菌數(shù)、賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲可過濾澄清樣品中的TVC檢測(cè)制藥企業(yè)過程用水中總活菌數(shù)(生物負(fù)載量)半導(dǎo)體企業(yè)生產(chǎn)用水中總菌數(shù)航空燃油領(lǐng)域用于總菌數(shù)檢測(cè)知名藥廠使用該技術(shù)通過FDA認(rèn)證

GSK在2004年獲FDA認(rèn)可

FDA認(rèn)可使用ChemScanRDI用于水中常規(guī)微生物分析SanofiWinthrop獲西班牙權(quán)威認(rèn)證

用于非滅菌產(chǎn)品。

severalsitesinEurope

havebeenauditedbyFDAanddemonstratedtheuseoftheChemScan.Noneoftheinspectorshadanyadverse