細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課件

病毒培養(yǎng)技術(shù)

任務(wù)1病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)任務(wù)2病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)任務(wù)3病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1病毒培養(yǎng)技術(shù)任務(wù)1病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)1任務(wù)1病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)動物的選擇

應(yīng)當(dāng)選擇SPF動物。選擇動物的條件下：①選用對病毒易感性高。②動物健康、體重、年齡盡可能一致，符合培養(yǎng)病毒要求。③遺傳特性相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性、準(zhǔn)確性和可比性。④外購動物要了解當(dāng)?shù)貏游锶航】担曫B(yǎng)及免疫接種情況，接前要經(jīng)過健康觀察，以免誤用帶有病原體動物。

2任務(wù)1病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)動物的選擇21.皮內(nèi)接種2.皮下接種3.肌肉接種4.靜脈接種5.腹腔接種動物接種途徑和方法31.皮內(nèi)接種動物接種途徑和方法3動物接種后的飼養(yǎng)管理與收獲病毒

1.接種病毒后的動物,每天觀察和檢查規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)，主要有精神、食欲、糞便、尿液、被毛狀態(tài)、活動情況和接種部位的局部反應(yīng)，每天測體溫1次，做好記錄。2.出現(xiàn)反應(yīng)癥候動物，按規(guī)定方法剖殺，采取含病毒高的組織臟器。4動物接種后的飼養(yǎng)管理與收獲病毒1.接任務(wù)2病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)能力目標(biāo)：能夠運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)完成對特定病毒的培養(yǎng)。工序過程：如何完成此項(xiàng)任務(wù)？選擇禽胚前孵育接種后孵育收獲病毒任務(wù)導(dǎo)入禽胚的特點(diǎn)5任務(wù)2病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)能力目標(biāo)各工序操作要點(diǎn)工序1禽胚的選擇

理想的禽胚是SPF雞胚，常以非免疫雞胚補(bǔ)充。工序2禽胚的接種前孵育孵化前消毒，溫度37.5～38.5℃，相對濕度50%～60%，定時(shí)翻蛋，保證通風(fēng)。孵化4～5d照蛋檢查，淘汰無精蛋和死胚，孵化至所培養(yǎng)病毒需要的日齡即可接種。

6各工序操作要點(diǎn)工序1禽胚的選擇6工序3禽胚的接種途徑各工序操作要點(diǎn)痘病毒和皰疹病毒，10～13日齡

流感、新城疫、傳支等，9～11日齡鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等，6～8日齡正粘病毒和副粘病毒，10～11日齡7工序3禽胚的接種途徑各工序操作要點(diǎn)痘病毒和皰疹病毒，10工序4禽胚的接種后孵育

接種后，蠟淚封孔，置37℃下孵化，每天照蛋2次以上，通過禽胚的病變初步確定病毒的存在及增殖情況，淘汰24h內(nèi)死胚。各工序操作要點(diǎn)病毒感染指征：死亡充血、出血或出現(xiàn)壞死灶畸形出現(xiàn)痘斑8工序4禽胚的接種后孵育接種后，蠟淚封工序5病毒的收獲

各工序操作要點(diǎn)絨毛尿囊膜接種尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種9工序5病毒的收獲各工序操作要點(diǎn)絨毛尿囊膜接種尿照蛋任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)10照蛋任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)10尿囊腔接種法獸用生物制品技術(shù)11尿囊腔接種法獸用生物制品技術(shù)11接種部位消毒任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)12接種部位消毒任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)12尿囊腔接種任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)13尿囊腔接種任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)13收獲尿囊液—每枚雞胚收獲尿囊液6～8ml任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)14收獲尿囊液—每枚雞胚收獲尿囊液6～8ml任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊影響禽胚培養(yǎng)病毒的因素㈠種蛋質(zhì)量1.病原微生物；2.母源抗體；3.抗生素㈡孵化技術(shù)1.溫度控制在37～39.5℃。有些病毒對溫度比較敏感，如雞胚接種傳染性支氣管炎病毒后，不應(yīng)超過37℃；2.濕度雞胚孵化濕度標(biāo)準(zhǔn)為53%～57%，水禽胚孵化濕度比雞胚高5%～10%；3.通風(fēng)禽胚發(fā)育是需氧量較大，加強(qiáng)通風(fēng)換氣；4.翻蛋及時(shí)翻動促進(jìn)發(fā)育等，但因地制宜。㈢接種技術(shù)通常雞胚發(fā)育到13～14日齡，鴨胚發(fā)育至15～16日齡，尿囊液含量最高，平均6～8ml，羊水1～2ml。15影響禽胚培養(yǎng)病毒的因素15任務(wù)3病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)子任務(wù)1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)常用的細(xì)胞上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)的方式原代培養(yǎng)：從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。

次代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞培養(yǎng)物輕微消化后，再洗下分裝至含新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將培養(yǎng)細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

16任務(wù)3病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)子任務(wù)1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)16細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。即：利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使活體動物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至2～4個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液的培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長、增殖的一種方法。廣義上:還包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。17細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture)培養(yǎng)常用的細(xì)胞上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的染色體和繁殖特性，可分為：⑴原代細(xì)胞

直接利用新鮮動物組織經(jīng)胰蛋白酶消化、分散，獲得單個(gè)細(xì)胞，如雞胚成纖維細(xì)胞，此細(xì)胞對病毒的檢測最為敏感，但制備和應(yīng)用不方便。

⑵二倍體細(xì)胞（細(xì)胞株）

由原代細(xì)胞或次代細(xì)胞選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標(biāo)記的細(xì)胞，如豬腎細(xì)胞株（PK-15）和乳倉鼠腎細(xì)胞株（BHK-21）等。適用于病毒性生物制品的制備，常用于疫苗生產(chǎn)，安全可靠。

⑶傳代細(xì)胞（非二倍體細(xì)胞系、異倍體細(xì)胞）

指不再保持原來細(xì)胞的二倍體細(xì)胞數(shù)，在體外可以無限傳代的細(xì)胞，如人子宮癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）和鼠腎腺癌細(xì)胞（RAG細(xì)胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生產(chǎn)，多用于病毒的分離鑒定。

18培養(yǎng)常用的細(xì)胞上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞181.培養(yǎng)液：生長液、維持液，Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等營養(yǎng)液

。2.細(xì)胞接種量:適宜。3.pH：一般為7.0～7.4因細(xì)胞種類不同而略有差異。4.溫度：一般為37～38℃。5.氣體：氧氣和二氧化碳。6.無菌條件：培養(yǎng)的全過程都要求嚴(yán)格的無菌條件。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件191.培養(yǎng)液：生長液、維持液，Eagle氏液、RPM各種組織是靠細(xì)胞間質(zhì)黏合而成的，要獲得分散的細(xì)胞，必須破壞細(xì)胞間質(zhì)。分散細(xì)胞的方法的三種：⑴機(jī)械分散法：適用于細(xì)胞間連接較松的組織，如禽胚組織。

⑵酶消化法：此法適用于原代細(xì)胞的制備及細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。

⑶螯合劑分散法：一般只用于單層細(xì)胞的分散。

20各種組織是靠細(xì)胞間質(zhì)黏合而成的，要獲

1.單層細(xì)胞培養(yǎng)法

用胰酶將剪碎的組織或傳代細(xì)胞分散成2～6個(gè)成團(tuán)的細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，讓細(xì)胞貼壁生長，靜置培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶生長培養(yǎng)。

2.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法（攪拌培養(yǎng)）

通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細(xì)胞始終分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法。

3.微載體培養(yǎng)通過攪拌懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，使微小細(xì)胞在載體表面繁殖成單層的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，兼有單層和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法211.單層細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)方法21犢牛肝臟單層細(xì)胞22犢牛肝臟單層細(xì)胞22雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理9-11日齡的雞胚23雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理9-11日齡的雞胚23雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理9日齡雞胚11日齡雞胚24雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理9日齡雞胚11日齡雞胚24雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理25雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理25雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理26雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理26子任務(wù)2病毒培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的選擇選擇相應(yīng)易感動物的組織細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)病毒條件⒈血清：促進(jìn)細(xì)胞生長和貼壁的成分。

⒉溫度：多數(shù)為37℃。⒊pH值：pH在7.6～7.8

⒋接毒量與接毒方法：一般按維持液的1～10%接入。

27子任務(wù)2病毒培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的選擇27病毒增值指標(biāo)與收獲

多數(shù)病毒在敏感細(xì)胞增殖可引起細(xì)胞代謝等方面的變化，發(fā)生形態(tài)改變，即細(xì)胞病變（CPE）。通常用CPE作為判定病毒毒力的指標(biāo)，即計(jì)算病毒的TCID50。CPE顯微鏡下主要表現(xiàn)為：①細(xì)胞圓縮②細(xì)胞融合形成合胞體③輕微病變

有些病毒在細(xì)胞上增殖并不產(chǎn)生CPE，可檢查包涵體和血凝性作為病毒增殖的指標(biāo)。28病毒增值指標(biāo)與收獲多數(shù)病毒在敏感細(xì)胞增檢測病毒正常細(xì)胞病變細(xì)胞29檢測病毒正常細(xì)胞病變細(xì)胞29復(fù)習(xí)思考題1.解釋概念：原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞傳代細(xì)胞單層細(xì)胞培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)微載體培養(yǎng)2.用動物培養(yǎng)病毒時(shí)，如何選擇動物？3.用禽胚培養(yǎng)病毒的接種方法有哪些？如何收獲病毒？4.細(xì)胞培養(yǎng)法有哪些種類？有何特點(diǎn)？5.細(xì)胞培養(yǎng)病毒需要哪些條件？30復(fù)習(xí)思考題1.解釋概念：30細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施無菌實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺恒溫培養(yǎng)箱其他設(shè)備（電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、細(xì)胞液氮儲存器、離心機(jī)、恒溫水域鍋、消毒器、抽濾裝置等）31細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施無菌實(shí)驗(yàn)室31

⑴血清的主要成分血清是由血漿去除纖維蛋白而形成，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等，這些物質(zhì)對促進(jìn)細(xì)胞生長活性是達(dá)到生理平衡的。

⑵血清的主要作用

①提供基本營養(yǎng)物質(zhì)

②提供貼壁和擴(kuò)展因子（FN、LN）

③提供激素及各種生長因子（FGF、EGF、PDGF)

④提供結(jié)合蛋白

⑤對培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用血清32⑴血清的主要成分血清32

⑶血清的使用與儲存使用前的處理

56℃滅活30min→去除補(bǔ)體成分儲存條件滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），－20℃儲存；使用前4℃融化。使用濃度

一般為5％～20％，最常用的是10％。血清33⑶血清的使用與儲存血清33氣體環(huán)境和pH氧（O2）參加細(xì)胞的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量以供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種所需成分。采用開放式培養(yǎng)時(shí)（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)），一般要把細(xì)胞置于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中。二氧化碳（CO2）CO2既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，又是細(xì)胞生長所必需的成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān)。34氣體環(huán)境和pH氧（O2）34pH值大多數(shù)細(xì)胞適于在pH7.2～7.4條件下生長，低于pH6.8或高于pH7.6對細(xì)胞有害，甚至造成細(xì)胞退化或死亡。細(xì)胞對堿性不如對酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對細(xì)胞生長有利。隨細(xì)胞數(shù)量的增多、代謝加強(qiáng)，釋放CO2增多，使pH降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的pH，多在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑。35pH值35THEENDTHEEND病毒培養(yǎng)技術(shù)

任務(wù)1病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)任務(wù)2病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)任務(wù)3病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)37病毒培養(yǎng)技術(shù)任務(wù)1病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)1任務(wù)1病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)動物的選擇

應(yīng)當(dāng)選擇SPF動物。選擇動物的條件下：①選用對病毒易感性高。②動物健康、體重、年齡盡可能一致，符合培養(yǎng)病毒要求。③遺傳特性相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性、準(zhǔn)確性和可比性。④外購動物要了解當(dāng)?shù)貏游锶航】担曫B(yǎng)及免疫接種情況，接前要經(jīng)過健康觀察，以免誤用帶有病原體動物。

38任務(wù)1病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)動物的選擇21.皮內(nèi)接種2.皮下接種3.肌肉接種4.靜脈接種5.腹腔接種動物接種途徑和方法391.皮內(nèi)接種動物接種途徑和方法3動物接種后的飼養(yǎng)管理與收獲病毒

1.接種病毒后的動物,每天觀察和檢查規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)，主要有精神、食欲、糞便、尿液、被毛狀態(tài)、活動情況和接種部位的局部反應(yīng)，每天測體溫1次，做好記錄。2.出現(xiàn)反應(yīng)癥候動物，按規(guī)定方法剖殺，采取含病毒高的組織臟器。40動物接種后的飼養(yǎng)管理與收獲病毒1.接任務(wù)2病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)能力目標(biāo)：能夠運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)完成對特定病毒的培養(yǎng)。工序過程：如何完成此項(xiàng)任務(wù)？選擇禽胚前孵育接種后孵育收獲病毒任務(wù)導(dǎo)入禽胚的特點(diǎn)41任務(wù)2病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)能力目標(biāo)各工序操作要點(diǎn)工序1禽胚的選擇

理想的禽胚是SPF雞胚，常以非免疫雞胚補(bǔ)充。工序2禽胚的接種前孵育孵化前消毒，溫度37.5～38.5℃，相對濕度50%～60%，定時(shí)翻蛋，保證通風(fēng)。孵化4～5d照蛋檢查，淘汰無精蛋和死胚，孵化至所培養(yǎng)病毒需要的日齡即可接種。

42各工序操作要點(diǎn)工序1禽胚的選擇6工序3禽胚的接種途徑各工序操作要點(diǎn)痘病毒和皰疹病毒，10～13日齡

流感、新城疫、傳支等，9～11日齡鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等，6～8日齡正粘病毒和副粘病毒，10～11日齡43工序3禽胚的接種途徑各工序操作要點(diǎn)痘病毒和皰疹病毒，10工序4禽胚的接種后孵育

接種后，蠟淚封孔，置37℃下孵化，每天照蛋2次以上，通過禽胚的病變初步確定病毒的存在及增殖情況，淘汰24h內(nèi)死胚。各工序操作要點(diǎn)病毒感染指征：死亡充血、出血或出現(xiàn)壞死灶畸形出現(xiàn)痘斑44工序4禽胚的接種后孵育接種后，蠟淚封工序5病毒的收獲

各工序操作要點(diǎn)絨毛尿囊膜接種尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種45工序5病毒的收獲各工序操作要點(diǎn)絨毛尿囊膜接種尿照蛋任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)46照蛋任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)10尿囊腔接種法獸用生物制品技術(shù)47尿囊腔接種法獸用生物制品技術(shù)11接種部位消毒任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)48接種部位消毒任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)12尿囊腔接種任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)49尿囊腔接種任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)13收獲尿囊液—每枚雞胚收獲尿囊液6～8ml任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)50收獲尿囊液—每枚雞胚收獲尿囊液6～8ml任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊影響禽胚培養(yǎng)病毒的因素㈠種蛋質(zhì)量1.病原微生物；2.母源抗體；3.抗生素㈡孵化技術(shù)1.溫度控制在37～39.5℃。有些病毒對溫度比較敏感，如雞胚接種傳染性支氣管炎病毒后，不應(yīng)超過37℃；2.濕度雞胚孵化濕度標(biāo)準(zhǔn)為53%～57%，水禽胚孵化濕度比雞胚高5%～10%；3.通風(fēng)禽胚發(fā)育是需氧量較大，加強(qiáng)通風(fēng)換氣；4.翻蛋及時(shí)翻動促進(jìn)發(fā)育等，但因地制宜。㈢接種技術(shù)通常雞胚發(fā)育到13～14日齡，鴨胚發(fā)育至15～16日齡，尿囊液含量最高，平均6～8ml，羊水1～2ml。51影響禽胚培養(yǎng)病毒的因素15任務(wù)3病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)子任務(wù)1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)常用的細(xì)胞上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)的方式原代培養(yǎng)：從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。

次代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞培養(yǎng)物輕微消化后，再洗下分裝至含新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將培養(yǎng)細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

52任務(wù)3病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)子任務(wù)1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)16細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。即：利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使活體動物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至2～4個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液的培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長、增殖的一種方法。廣義上:還包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。53細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture)培養(yǎng)常用的細(xì)胞上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的染色體和繁殖特性，可分為：⑴原代細(xì)胞

直接利用新鮮動物組織經(jīng)胰蛋白酶消化、分散，獲得單個(gè)細(xì)胞，如雞胚成纖維細(xì)胞，此細(xì)胞對病毒的檢測最為敏感，但制備和應(yīng)用不方便。

⑵二倍體細(xì)胞（細(xì)胞株）

由原代細(xì)胞或次代細(xì)胞選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標(biāo)記的細(xì)胞，如豬腎細(xì)胞株（PK-15）和乳倉鼠腎細(xì)胞株（BHK-21）等。適用于病毒性生物制品的制備，常用于疫苗生產(chǎn)，安全可靠。

⑶傳代細(xì)胞（非二倍體細(xì)胞系、異倍體細(xì)胞）

指不再保持原來細(xì)胞的二倍體細(xì)胞數(shù)，在體外可以無限傳代的細(xì)胞，如人子宮癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）和鼠腎腺癌細(xì)胞（RAG細(xì)胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生產(chǎn)，多用于病毒的分離鑒定。

54培養(yǎng)常用的細(xì)胞上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞181.培養(yǎng)液：生長液、維持液，Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等營養(yǎng)液

。2.細(xì)胞接種量:適宜。3.pH：一般為7.0～7.4因細(xì)胞種類不同而略有差異。4.溫度：一般為37～38℃。5.氣體：氧氣和二氧化碳。6.無菌條件：培養(yǎng)的全過程都要求嚴(yán)格的無菌條件。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件551.培養(yǎng)液：生長液、維持液，Eagle氏液、RPM各種組織是靠細(xì)胞間質(zhì)黏合而成的，要獲得分散的細(xì)胞，必須破壞細(xì)胞間質(zhì)。分散細(xì)胞的方法的三種：⑴機(jī)械分散法：適用于細(xì)胞間連接較松的組織，如禽胚組織。

⑵酶消化法：此法適用于原代細(xì)胞的制備及細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。

⑶螯合劑分散法：一般只用于單層細(xì)胞的分散。

56各種組織是靠細(xì)胞間質(zhì)黏合而成的，要獲

1.單層細(xì)胞培養(yǎng)法

用胰酶將剪碎的組織或傳代細(xì)胞分散成2～6個(gè)成團(tuán)的細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，讓細(xì)胞貼壁生長，靜置培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶生長培養(yǎng)。

2.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法（攪拌培養(yǎng)）

通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細(xì)胞始終分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法。

3.微載體培養(yǎng)通過攪拌懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，使微小細(xì)胞在載體表面繁殖成單層的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，兼有單層和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法571.單層細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)方法21犢牛肝臟單層細(xì)胞58犢牛肝臟單層細(xì)胞22雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理9-11日齡的雞胚59雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理9-11日齡的雞胚23雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理9日齡雞胚11日齡雞胚60雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理9日齡雞胚11日齡雞胚24雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理61雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理25雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理62雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)—雞胚的處理26子任務(wù)2病毒培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的選擇選擇相應(yīng)易感動物的組織細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)病毒條件⒈血清：促進(jìn)細(xì)胞生長和貼壁的成分。

⒉溫度：多數(shù)為37℃。⒊pH值：pH在7.6～7.8

⒋接毒量與接毒方法：一般按維持液的1～10%接入。

63子任務(wù)2病毒培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的選擇27病毒增值指標(biāo)與收獲

多數(shù)病毒在敏感細(xì)胞增殖可引起細(xì)胞代謝等方面的變化，發(fā)生形態(tài)改變，即細(xì)胞病變（CPE）。通常用CPE作為判定病毒毒力的指標(biāo)，即計(jì)算病毒的TCID50。CPE顯微鏡下主要表現(xiàn)為：①細(xì)胞圓縮②細(xì)胞融合形成合胞體③輕微病變

有些病毒在細(xì)胞上增殖并不產(chǎn)生CPE，可檢查包涵體和血凝性作為病毒增殖的指標(biāo)。64病毒增值指標(biāo)與收獲多數(shù)病毒在敏感細(xì)胞增檢測病毒正常細(xì)胞病變細(xì)胞65檢測病毒正常細(xì)胞病變細(xì)胞29復(fù)習(xí)思考題1.解釋概念：原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞傳代細(xì)胞單層細(xì)胞培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)微載體培養(yǎng)2.用動物培養(yǎng)病毒時(shí)，如何選擇動物？3.用禽胚培養(yǎng)病毒的接種方法有哪些？如何收獲病毒？4.細(xì)胞培養(yǎng)法有哪