霍亂弧菌實驗室檢測課件整理

霍亂弧菌的實驗室檢測霍亂弧菌的實驗室檢測1目的:提高檢出率減少漏檢以及誤判的發(fā)生手段檢測人員是否有足夠的責任心?檢測試劑準備是否齊全且符合要求?是否嚴格按照檢測流程進行操作?目的:提高檢出率減少漏檢以及誤判的發(fā)2雪沉概述什么是霍亂?霍亂是由01群和0139群霍亂弧菌(V.cho/erae)引起的急性腸道傳染病,發(fā)病急、傳播速度快、波及范圍廣、危害嚴重的甲類傳染病。古典生物型01群稻葉型lna埃爾托生物型彥島型Hkc霍亂弧菌框亂病原菌0139群(Benga非o1群Ao2o200群腹瀉病原菌雪沉概述3病原體O1群,O139群霍亂弧菌發(fā)病特征:劇烈腹瀉、嘔吐、嚴重脫水時致酸中毒、循環(huán)衰竭而致死亡不治療或醫(yī)療很差的條件下病死率可達到20-50%(重癥病人達70100%)培養(yǎng)特性:營養(yǎng)要求不高,兼性厭氧,37℃生長,怕酸嗜堿,pH:7.4-9.6快速生檢驗依據(jù):WS289-2019《霍亂診斷標準》霍亂防治手冊(2019年第五版)病原體4亂的實驗室驗測一樣品的采集和運輸不同樣品的病原分離流程及技術要點>糞便水體>水產品,食品等一平板分離及可疑菌落挑取一菌落鑒定常用快速檢測方法膠體金檢測條熒光PCR檢測檢測工作中應關注的事項亂的實驗室驗測5樣品的采桌運物采集:病例:糞便、肛拭子、嘔吐物未使用抗生素之前健康”人:糞便、肛拭子其他傳播環(huán)節(jié)的標本:食物、水、環(huán)境類樣品監(jiān)測:水樣,水產品等運輸:般要求在3小時內室溫(20-25℃)條件下送達實驗室檢測C-B運輸培養(yǎng)基(pH8.4);(或文臘二氏保存液)堿性蛋白胨水(pH8.49.2):不是最佳的,尤其6小時內還不能進行培養(yǎng)時,盡量采用CB運輸培養(yǎng)基。樣品的采桌運物6分離流及技術要點糞便的采集與保存運送以采集病人自然排除的新鮮糞便為主,水樣便采取1~3mL,成形便采取指甲大小的糞量,亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內3~5cm處采取,采集后的樣品應盡快挑取接種于堿性蛋白胨水(PH8.6-9.2)同時劃線分離選擇性培養(yǎng)基(慶大/四號/TCBS平板),如不能在6小時內送達實驗室檢測的樣品,應插入Cary-Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基(或文臘二氏保存液)中送檢。標本與保存液比例約為1:5分離培養(yǎng)要點(兩管三板法):挑取糞便,直接接種于堿性蛋白胨水(第一管)中,同時劃線分離選擇性平板(慶大/四號/TCBS平板,第一板)。第一管堿性蛋白胨水在37℃增菌6-8小時,沾取菌膜下表層液體,劃線分離選擇性平板(慶大/四號/TCBS平板,第二板)0.1~0.2mi表層培養(yǎng)物,接種堿性蛋白陳水(第二管)。·同時吸取第二管堿性蛋白胨水增菌18小時后劃線分離選擇性平板(慶大/四號TCBS平板,第三板)分離流及技術要點7k水分流要點A水體的采集與保存運送水體的采集一般用無菌的500m水樣瓶采集相對靜止的表層水(深度為30cm以內)500ml,密封加蓋后于室溫(2025℃)3小時內送達實驗室檢測。·分離培養(yǎng)要點(十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法):取450m水樣,用1M氬氧化鈉調整至pH8.49.2。然后加10倍濃縮堿性胨水50ml。再加入1%亞碲酸鉀0.25~0.5m和1000單位/m青霉素lml37℃培養(yǎng)過夜,取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基(慶大/四號/TCBS平板)分離培養(yǎng),同時吸0.1~0.2m表層培養(yǎng)物轉種于堿性胨水管中作二次增菌,37℃培養(yǎng)6~&h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基(慶大/四號/TCBS平板)。k水分流要點A8k水產品分流況要點口水產品的采集與保存運送通常選取活的或者新鮮的水生動物為采集對象,有時也應考慮冰凍的水生動物,有條件的采樣點可將水生動物整體采回實驗室再進行相關處置涂抹采集:使用無菌棉簽涂抹5只以上水水生動物表面、腮部及泄殖腔,直接接種到20ml堿性蛋白胨水作為增菌液處理。整體或局部采集在實驗室應以無菌操作將其解剖,取鰓部和腸內容物25克剪碎后,置滅菌均質杯或均質袋中,加入225mL倍體積的堿性蛋白胨水增菌;但小貝殼類動物,則用錘子將外殼擊碎,整體放入100m三角瓶中,加入5-10倍的堿性蛋白陳水增菌;甲殼類動物除含肉質部分外,其余部分(包括鰓、腸、足、表層外殼等整體放入100ml三角瓶中,加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌分離培養(yǎng)(兩管兩板法):接種后的堿性蛋白胨水37℃培養(yǎng)過夜,取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基(慶大/四號/TCBS平板).同時吸0.1~0.2m表層培養(yǎng)物轉種于陳水管中作二次增菌,37℃培種于選擇性培養(yǎng)k水產品分流況要點口9圖9-71霍亂弧菌在堿性蛋白胨水培養(yǎng)基(pH2)中生長,液體呈均勻混濁,有菌膜(6~8h)左側為陰性對照。圖9-71霍亂弧菌在堿性蛋白胨水培養(yǎng)基10霍亂弧菌實驗室檢測課件整理11霍亂弧菌實驗室檢測課件整理12霍亂弧菌實驗室檢測課件整理13霍亂弧菌實驗室檢測課件整理14霍亂弧菌實驗室檢測課件整理15霍亂弧菌實驗室檢測課件整理16霍亂弧菌實驗室檢測課件整理17霍亂弧菌實驗室檢測課件整理18霍亂弧菌實驗室檢測課件整理19霍亂弧菌實驗室檢測課件整理20霍亂弧菌實驗室檢測課件整理21霍亂弧菌實驗室檢測課件整理22霍亂弧菌的實驗室檢測霍亂弧菌的實驗室檢測23目的:提高檢出率減少漏檢以及誤判的發(fā)生手段檢測人員是否有足夠的責任心?檢測試劑準備是否齊全且符合要求?是否嚴格按照檢測流程進行操作?目的:提高檢出率減少漏檢以及誤判的發(fā)24雪沉概述什么是霍亂?霍亂是由01群和0139群霍亂弧菌(V.cho/erae)引起的急性腸道傳染病,發(fā)病急、傳播速度快、波及范圍廣、危害嚴重的甲類傳染病。古典生物型01群稻葉型lna埃爾托生物型彥島型Hkc霍亂弧菌框亂病原菌0139群(Benga非o1群Ao2o200群腹瀉病原菌雪沉概述25病原體O1群,O139群霍亂弧菌發(fā)病特征:劇烈腹瀉、嘔吐、嚴重脫水時致酸中毒、循環(huán)衰竭而致死亡不治療或醫(yī)療很差的條件下病死率可達到20-50%(重癥病人達70100%)培養(yǎng)特性:營養(yǎng)要求不高,兼性厭氧,37℃生長,怕酸嗜堿,pH:7.4-9.6快速生檢驗依據(jù):WS289-2019《霍亂診斷標準》霍亂防治手冊(2019年第五版)病原體26亂的實驗室驗測一樣品的采集和運輸不同樣品的病原分離流程及技術要點>糞便水體>水產品,食品等一平板分離及可疑菌落挑取一菌落鑒定常用快速檢測方法膠體金檢測條熒光PCR檢測檢測工作中應關注的事項亂的實驗室驗測27樣品的采桌運物采集:病例:糞便、肛拭子、嘔吐物未使用抗生素之前健康”人:糞便、肛拭子其他傳播環(huán)節(jié)的標本:食物、水、環(huán)境類樣品監(jiān)測:水樣,水產品等運輸:般要求在3小時內室溫(20-25℃)條件下送達實驗室檢測C-B運輸培養(yǎng)基(pH8.4);(或文臘二氏保存液)堿性蛋白胨水(pH8.49.2):不是最佳的,尤其6小時內還不能進行培養(yǎng)時,盡量采用CB運輸培養(yǎng)基。樣品的采桌運物28分離流及技術要點糞便的采集與保存運送以采集病人自然排除的新鮮糞便為主,水樣便采取1~3mL,成形便采取指甲大小的糞量,亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內3~5cm處采取,采集后的樣品應盡快挑取接種于堿性蛋白胨水(PH8.6-9.2)同時劃線分離選擇性培養(yǎng)基(慶大/四號/TCBS平板),如不能在6小時內送達實驗室檢測的樣品,應插入Cary-Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基(或文臘二氏保存液)中送檢。標本與保存液比例約為1:5分離培養(yǎng)要點(兩管三板法):挑取糞便,直接接種于堿性蛋白胨水(第一管)中,同時劃線分離選擇性平板(慶大/四號/TCBS平板,第一板)。第一管堿性蛋白胨水在37℃增菌6-8小時,沾取菌膜下表層液體,劃線分離選擇性平板(慶大/四號/TCBS平板,第二板)0.1~0.2mi表層培養(yǎng)物,接種堿性蛋白陳水(第二管)?！ね瑫r吸取第二管堿性蛋白胨水增菌18小時后劃線分離選擇性平板(慶大/四號TCBS平板,第三板)分離流及技術要點29k水分流要點A水體的采集與保存運送水體的采集一般用無菌的500m水樣瓶采集相對靜止的表層水(深度為30cm以內)500ml,密封加蓋后于室溫(2025℃)3小時內送達實驗室檢測?！し蛛x培養(yǎng)要點(十倍濃縮堿胨水增菌培養(yǎng)法):取450m水樣,用1M氬氧化鈉調整至pH8.49.2。然后加10倍濃縮堿性胨水50ml。再加入1%亞碲酸鉀0.25~0.5m和1000單位/m青霉素lml37℃培養(yǎng)過夜,取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基(慶大/四號/TCBS平板)分離培養(yǎng),同時吸0.1~0.2m表層培養(yǎng)物轉種于堿性胨水管中作二次增菌,37℃培養(yǎng)6~&h再劃線接種于選擇性培養(yǎng)基(慶大/四號/TCBS平板)。k水分流要點A30k水產品分流況要點口水產品的采集與保存運送通常選取活的或者新鮮的水生動物為采集對象,有時也應考慮冰凍的水生動物,有條件的采樣點可將水生動物整體采回實驗室再進行相關處置涂抹采集:使用無菌棉簽涂抹5只以上水水生動物表面、腮部及泄殖腔,直接接種到20ml堿性蛋白胨水作為增菌液處理。整體或局部采集在實驗室應以無菌操作將其解剖,取鰓部和腸內容物25克剪碎后,置滅菌均質杯或均質袋中,加入225mL倍體積的堿性蛋白胨水增菌;但小貝殼類動物,則用錘子將外殼擊碎,整體放入100m三角瓶中,加入5-10倍的堿性蛋白陳水增菌;甲殼類動物除含肉質部分外,其余部分(包括鰓、腸、足、表層外殼等整體放入100ml三角瓶中,加入5-10倍的堿性蛋白胨水增菌分離培養(yǎng)(兩管兩板法):接種后的堿性蛋白胨水37℃培養(yǎng)過夜,取菌膜下表層培養(yǎng)物接種選擇性培養(yǎng)基(慶大/四號/TCBS平板).同時吸0.1~0.2m表層培養(yǎng)物轉種于陳水管中作二次增菌,37℃培種于選擇性培養(yǎng)k水產品分流況要點口31圖9-71霍亂弧菌在堿性蛋白胨水培養(yǎng)基(pH2)中生長,液體呈均勻混濁,有菌膜(6~8h)左側為陰性對照。