山牡荊種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018山牡荊種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了山牡荊[Vitex

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（Lour.）Wall.]種子超低溫保存過(guò)程中的術(shù)語(yǔ)和定義、保存種子的選擇、種子前處理、種子保存量種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于山牡荊種子的超低溫長(zhǎng)期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測(cè)定術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。山牡荊Vitex

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（Lour.）Wall.為馬鞭草科（Verbenaceae）牡荊屬（VitexLinn.）常綠喬木，別稱鶯歌公、山布荊。是一種珍貴用材和景觀綠化的多用途樹(shù)種，根及樹(shù)干心材均可入藥，瑤醫(yī)認(rèn)為，山牡荊具有清熱解毒、活血消腫、疏風(fēng)通絡(luò)等功效。收載于《XX自治區(qū)域藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2014）》。山牡荊果實(shí)Vitex

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（Lour.）Wall.fruits核果球形或倒卵形，幼時(shí)綠色，成熟后呈黑色，宿萼呈圓盤狀，頂端近截形。山牡荊種子Vitex

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（Lour.）Wall.seeds山牡荊的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為中間性種子。種子土黃色，倒卵形，質(zhì)堅(jiān)硬。表面具縱皺紋，胚乳白色。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過(guò)前處理的山牡荊種子置于液氮（-196℃）中保存。保存種子的選擇果實(shí)采收9月份開(kāi)始果實(shí)成熟，果皮由青綠色變成暗綠色時(shí)即可采收。果實(shí)成熟后極易脫落，應(yīng)立即采收種子，否則易被鳥類取食，去除果皮和果肉，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過(guò)30d）。種子前處理生活力檢測(cè)參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中的溴麝香草酚藍(lán)（BTB）法測(cè)定山牡荊種子生活力。待測(cè)種子在30℃~35℃溫水中浸種2h，隨后取吸脹種子20粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將含胚部分埋入凝膠中。將培養(yǎng)皿置于35℃溫箱中5h后觀察結(jié)果。生活力計(jì)算在光下用放大鏡對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡種胚周圍出現(xiàn)黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無(wú)活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的山牡荊種子生活力應(yīng)≥85%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹山牡荊種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為6000:1，室溫條件下干燥處理5~15h，在干燥過(guò)程中定期測(cè)定種子含水量，將種子含水量由18%~20%降至11%~14%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測(cè)定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量山牡荊種子保存量不少于400粒，以便后期的活力檢測(cè)使用。種子冷凍方式山牡荊種子超低溫保存的冷凍方式為玻璃化冷凍法，即將裝有種子的15mL凍存管（每管60粒種子）置于裝載液（LS）中并于25℃處理種子20min，再用玻璃化保護(hù)溶液（PVS2）冰浴處理種子30min，換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進(jìn)行超低溫保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出1個(gè)凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min，而后用洗滌液（DS）浸泡15min，并用純凈水洗滌3次。凍后種子生活力檢測(cè)取出30粒解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測(cè)方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測(cè)。當(dāng)種子生活力≥50%時(shí)視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下30粒解凍后的山牡荊種子，50℃溫水浸泡至冷卻后加0.5%高錳酸鉀溶液浸泡2h后，播種到帶有無(wú)菌濾紙的發(fā)芽盒中，溫度25℃～30℃，濕度70%～85%條件下培養(yǎng)。附錄[1]BTB的配制和保存方法精密稱取BTB0.1g，溶解于煮沸過(guò)的100mL純水中，然后用濾紙去殘?jiān)?。濾液若呈黃色，可加數(shù)滴氫氧化鈉溶液，使之變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)綠色，此液長(zhǎng)期貯存于棕色瓶中。1.5%BTB瓊脂凝膠：稱量0.1%BTB溶液40mL置于燒杯中，稱取0.5g瓊脂，將其剪碎后加入杯中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷卻即可趁熱倒入9cm培養(yǎng)皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。[2]裝載液（LS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖13.7g，稱量甘油11.9mL，溶于液體MS培養(yǎng)基中，調(diào)pH至5.8，并定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。[3]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亞砜13.6mL，稱取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。注意：配制時(shí)需戴手套，并在通風(fēng)廚內(nèi)操作。[4]洗滌液（DS）的配置及保存方法精密稱取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。參考文獻(xiàn)[1]XX自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.XX自治區(qū)域藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第一卷）[S].XX，廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2014，27-28[2]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志委員會(huì).中國(guó)植物志.第65（1）卷[M].科學(xué)出版社，1982：135[3]ChenShou-liang;MichaelG.Gilbert.Verbenaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.1994.17:1-49.[4]傅家瑞，宋松泉.頑拗性種子生物學(xué)[M].中國(guó)科學(xué)文化出