復(fù)雜染色體重排采用改良高分辨G顯帶技術(shù)分析的效果,醫(yī)學遺傳學論文

復(fù)雜染色體重排采用改良高分辨G顯帶技術(shù)分析的效果,醫(yī)學遺傳學論文摘要：目的應(yīng)用染色體改進高分辨G顯帶技術(shù),對四例復(fù)雜染色體重排(CCRs)攜帶者進行細胞遺傳學分析,討論該技術(shù)對CCRs的臨床應(yīng)用價值。方式方法選取因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或不孕不育就診于廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心的4對夫婦,經(jīng)改進高分辨G顯帶技術(shù)制備外周血染色體,核型分析并與常規(guī)方式方法進行比擬。結(jié)果改進高分辨G顯帶染色體分辨率到達550條以上核型占比50%以上;核型分析提示4對夫婦中各有一方是CCRs攜帶者,牽涉3～4條染色體易位;易位染色體牽涉3號和12號染色體最多。結(jié)論改進高分辨G顯帶技術(shù)能更好的發(fā)現(xiàn)CCRs攜帶者的多個染色體易位,避免漏診。該技術(shù)成本較低、操作簡單,合適在基層單位推廣。本文關(guān)鍵詞語：高分辨;G顯帶;復(fù)雜染色體重排;染色體;Abstract：ObjectiveToinvestigatethecytogeneticanalysisof4patientswithcomplexchromosomalrearrangements(CCRs)byusingchromosomemodifiedhighresolutionGbandingtechnique,andexploretheclinicalvalueofthistechniqueinCCRs.MethodsThekaryotypeofperipheralbloodchromosomeswaspreparedfrom4couplesreferringforrecurrentabortionorinfertilityintheMedicalGeneticCenterofGuangdongWomenandChildrenHospital.ThekaryotypeofperipheralbloodwaspreparedbyimprovedhighresolutionGbandingtechniqueandcomparedwithconventionalmethods.ResultsTheresolutionofthemodifiedhighresolutionGbandingchromosomeswasover50%,andthekaryotypeanalysisshowedthatoneofeachcouplewasCCRscarriers,whichinvolved3or4chromosometranslocations.Themostinvolvingchromosomeswere3and12.ConclusionImprovedhighresolutionGbandingtechniquecanbetterdetectmultiplechromosometranslocationsandavoidmisseddiagnosisinCCRscarriers.Thetechnologyissimpleinoperationandlowcost,andissuitableforpromotioningrassrootsunits.Keyword：Highresolution;Gbanding;Complexchromosomalrearrangement;Chromosome;復(fù)雜染色體重排(complexchromosomalrearrangements,CCRs)是一種染色體構(gòu)造性異常,通常牽涉兩條或更多的染色體,且至少有3個或以上斷裂點,染色體重新排列組合并伴隨遺傳物質(zhì)的交換[1]。CCRs攜帶者臨床表現(xiàn)多樣,包括完全正常的表型、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不孕不育、智力低下、發(fā)育延遲緩慢、先天畸形等[2]。CCRs在表型正常的人群中少見,但在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不孕不育、不良生育史等患者中相對較多。CCRs的發(fā)生機制復(fù)雜,攜帶者或是新發(fā),或是家族性遺傳[3,4]。由于CCRs牽涉重排的染色體和斷點的數(shù)量增加,配子發(fā)生不平衡的百分比和子代受影響的風險越高[1,5]。攜帶者生育先天性多發(fā)畸形(multiplecongenitalabnormalities,MCA)患兒風險與牽涉的染色體、受累數(shù)目和斷裂點位置等有關(guān)[5]。所以對表型正常的CCRs攜帶者做出準確核型診斷,對孕前咨詢和胎兒染色體異常的風險評估非常重要。常規(guī)染色體G顯帶在分辨率低的情況下,識別CCRs存在困難,容易漏診。因而對該類患者進行針對性的細胞遺傳學診斷顯得非常關(guān)鍵。當前大多基層實驗室開展染色體檢測的分辨率在320條帶左右,對CCRs難以辨別。本研究應(yīng)用改進的高分辨G顯帶技術(shù),對4例CCRs攜帶者進行細胞遺傳學分析并討論該技術(shù)對CCRs的臨床應(yīng)用價值。1、對象與方式方法1.1、研究對象選取因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或不孕不育就診于廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心的夫婦4對共8人,簽署知情同意書后抽取外周血行改進高分辨G顯帶染色體分析。病例1,30歲女性婚后2次早期胚胎停育。病例2,28歲女性,早期自然流產(chǎn)3次。病例3,33歲男性婚后多年不育,精液常規(guī)檢測正常。病例4,39歲男性,畸、弱精子癥,其妻早期自然流產(chǎn)1次。4對夫妻均否認近親結(jié)婚,除上述外其他既往病史無特殊。1.2、方式方法抽取2mL靜脈肝素抗凝血,接種于2瓶外周血培養(yǎng)基,置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。在終止培養(yǎng)前16h參加胸腺嘧啶核苷100L(終濃度到達0.3mg/mL),前6h參加脫氧胞苷(終濃度到達3g/mL)。收獲前參加50L高濃度(100mg/mL)的秋水仙素(終濃度為2g/mL)作用12min,經(jīng)常規(guī)低滲、預(yù)固定、固定、制片(4張/人)、吉姆薩染色,全自動染色體掃描儀選取、拍攝核型,按(人類細胞遺傳學國際命名體制ISCN(2021)〕分析和診斷染色體核型[6]。常規(guī)技術(shù)與改進高分辨G顯帶技術(shù)的方式方法比擬見表1。表1常規(guī)技術(shù)與改進高分辨G顯帶技術(shù)的方式方法比擬2、結(jié)果2.1、制備結(jié)果所有對象進行改進高分辨G顯帶技術(shù)均獲得成功,每例均可至少制片4張,每張玻片至少80個核型,分辨率在550條帶核型數(shù)占50%以上。分析4對夫婦外周染色體G顯帶核型結(jié)果如下:病例1核型為:46,XX,t(3;12;18)(18qter18q21.1::3p253qter;12pter12q22::3p253pter;18pter18q21.1::12q2212qter),其丈夫核型正常,見圖1。圖1病例1改進高分辨染色體核型Fig.1Modifiedhighresolutionchromosomekaryotypeofcase1病例2核型為:45,XX,t(3;12)(3pter3q21::12q24.112qter;12pter12q24.1::3q213qter),der(13;14)(q10;q10),其丈夫核型正常,見圖2。圖2病例2改進高分辨染色體核型Fig.2Modifiedhighresolutionchromosomekaryotypeofcase2病例3核型為:46,XY,der(1)(1pter1q43::3q253q26.2::12q24.112qter),der(3)(pterq25::q26.2qter),der(12)(12pter12q24.1::1q431qter),其妻子核型正常,見圖3。圖3病例3改進高分辨染色體核型Fig.3Modifiedhighresolutionchromosomekaryotypeofcase3病例4核型為:46,XY,der(5)(6qter6q23::5p15.15qter),der(6)(6pter6q22::7p217pter),der(7)(5pter5p15.1::6q236q22::7p217qter),其妻子核型正常,見圖4。2.2、4例CCRs攜帶者異常染色體特點分析結(jié)合改進高分辨G顯帶分析結(jié)果,比擬4例CCRs攜帶者細胞遺傳特點以及臨床資料,發(fā)現(xiàn)4對夫婦均存在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或不孕不育病史,并且華而不實一方染色體異常,另一方染色體正常。染色體異常一方,存在3～4個染色體斷裂點,牽涉3～4條染色體易位,華而不實以3號和12號染色體最多見,見表2。圖4病例4改進高分辨染色體核型Fig.4Modifiedhighresolutionchromosomekaryotypeofcase4表2四例CCRs攜帶者細胞遺傳特點以及臨床資料3、討論常規(guī)染色體制備方式方法于細胞培養(yǎng)68～72h,在收獲前直接加低濃度秋水仙素作用2h后直接低滲固定,制備的染色體條帶分辨率約為320條,對核型分析技術(shù)相對較低。由于操作簡單,為廣大細胞遺傳實驗室應(yīng)用。但該分辨率對染色體微小構(gòu)造異常、復(fù)雜重排容易漏診,導(dǎo)致CCRs牽涉的染色體數(shù)目和斷點容易發(fā)生錯誤。而高分辨技術(shù)始于1976年Yunis[7]的細胞周期同步化方式方法,后經(jīng)很多學者改進成經(jīng)典的高分辨技術(shù),但操作步驟繁瑣,收獲的染色體分辨率太高,在850條以上,對核型分析技術(shù)要求非常高,因而并不合適常規(guī)開展。本研究在常規(guī)技術(shù)基礎(chǔ)上改進高分辨技術(shù),操作上僅通過適時參加胸腺嘧啶核苷和脫氧胞苷,并調(diào)整秋水仙素濃度和作用時間,即可到達臨床診斷CCRs的目的。實驗中過量的胸腺嘧啶核苷能可逆的抑制DNA合成,使大量細胞靜止在G1/S期,再參加脫氧胞苷使細胞同步化進入分裂中期,進而收獲大量足夠染色體分裂相。秋水仙素能毀壞細胞分裂周期中出現(xiàn)的紡錘體,使細胞終止在分裂中期,同時能收縮染色體。如秋水仙素作用時間太長,可造成染色體過短。本研究在常規(guī)技術(shù)上,采用增加秋水仙濃度并縮短作用時間的方式方法,即獲得大量長度適中的染色體分裂相;在參考胸腺嘧啶核苷雙阻斷同步化高分辨技術(shù)的基礎(chǔ)上,改進為單阻斷且不需離心去除阻斷劑直接釋放進入細胞中期,簡便實驗操作,且收獲到的染色體分裂相達550條帶占50%以上,而又不至于過高的分辨率,可知足臨床上檢測CCRs的要求。CCRs通常牽涉2條以上的染色體斷裂,導(dǎo)致染色體片段交換[8],迄今報告病例約為300多例[5,8,9,10]。3條或者以上的染色體復(fù)雜重排,理論上在減數(shù)分裂中至少會構(gòu)成32種配子,華而不實只要1種平衡易位配子,1種正常配子,其他均為部分單體或部分三體等非平衡型配子,此類配子受精后不能正常發(fā)育,結(jié)局多為自然流產(chǎn)[11]。CCRs的發(fā)生機制尚未完全說明。染色體在各種內(nèi)外因素的作用下遭到毀壞,導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂,斷裂的染色體在DNA修復(fù)功能的作用下發(fā)生非同源末端連接,進而構(gòu)成了染色體的重排,假如牽涉到3條或以上的染色體,則構(gòu)成了CCRs[12]。約70%的CCRs攜帶者表型正常,20%～25%有先天畸形和精神障礙,5%～10%在參與性產(chǎn)前診斷中被檢測到[13]。70%～75%的CCRs為新發(fā),30%為家族性遺傳,新發(fā)的CCRs攜帶者中表型正常和異常的比例大致一樣[14]。Kausch等[15]根據(jù)CCRs的構(gòu)造,將其分為三型:Ⅰ型為三相重排CCRs,即3條染色體上的3個片段發(fā)生斷裂、易位、重組,構(gòu)成3條衍生染色體,一般斷裂點為3個;Ⅱ型為特殊CCRs,包括一系列的復(fù)雜重組(易位、倒位、插入、復(fù)制、缺失),牽涉的斷裂點一般比衍生染色體的數(shù)目多,在減數(shù)分裂時增加額外的復(fù)雜性;Ⅲ型為雙重互相易位CCRs,包括2對或以上的染色體之間的互相易位,通過減數(shù)分裂單獨分離,產(chǎn)生正常和衍生染色體。Ⅰ型CCRs最常見,約占30%[16],且隨著斷裂位點和牽涉染色體數(shù)目的增加,CCRs攜帶者生育異常后代的幾率越大[17]。本研究中病例1屬于Ⅰ型,牽涉3條染色體3個斷裂點,患者有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史,其兩次胚胎停育可能是減數(shù)分裂后產(chǎn)生不平衡配子,導(dǎo)致胚胎染色體異常引起流產(chǎn)。病例2屬于Ⅲ型,牽涉4條染色體4個斷裂點,為羅氏易位合并平衡易位,患者生育正常染色體后代的理論概率為(1/61/18)。病例3為Ⅱ型,牽涉3條染色體4個斷裂點,患者不孕很可能是正常配子幾率太低。病例4屬于Ⅱ型,牽涉3條染色體4個斷裂點,患者畸、弱精子癥,據(jù)報道常染色體構(gòu)造畸變可影響精子的構(gòu)成和質(zhì)量[18],其妻流產(chǎn)過一次且之后一直未再孕,可能與此有關(guān)。Vermeulen等[19]報道約30%的CCRs有7q21.1斷裂點,Zhang等[20]報道2、3、4、7、11等染色體容易構(gòu)成CCRs,本研究中4個病例中有3例含有3號和12號染色體的CCRs,占75%,揣測12號染色體也許含有CCRs熱門區(qū)域。隨著分子遺傳技術(shù)飛速發(fā)展,熒光原位雜交、染色體微陣列分析、二代測序(next-generationsequencing,NGS)等促進了染色體斷裂點的特征描繪敘述和精到準確劃分[5],可發(fā)現(xiàn)更多的染色體微小易位,促進遺傳物質(zhì)重排的診斷[21]。當前NGS對CCRs的具體研究已證明是有成效的[22],因而對CCRs的研究也成為熱門。同時也明確提出傳統(tǒng)的細胞遺傳核型分析還是不可缺少的技術(shù)[9,23],進而對傳統(tǒng)細胞遺傳的高分辨技術(shù)提出了更高層次的質(zhì)量要求。本研究改進高分辨G顯帶技術(shù)成本低、方便操作、容易把握,尤其合適基層單位開展,及時發(fā)現(xiàn)CCRs攜帶者,避免過度檢查和治療。以下為參考文獻[1]MadanK.Balancedcomplexchromosomerearrangements:reproductiveaspects.Areview[J].AmJMedGenetA,2020,158A(4):947-963.[2]NguyenMH,MorelF,PennamenP,etal.Balancedcomplexchromosomerearrangementinmaleinfertility:casereportandliteraturereview[J].Andrologia,2021,47(2):178-185.[3]AlesiV,OrlandoV,GenoveseS,etal.Interstitial10q21.1q23.31duplicationduetomeioticrecombinationofapaternalbalancedcomplexrearrangement:cytogeneticandmolecularcharacterization[J].CytogenetGenomeRes,2021,151(4):179-185.[4]dePagterMS,vanRoosmalenMJ,BaasAF,etal.Chromothripsisinhealthyindividualsaffectsmultipleproteincodinggenesandcanresultinseverecongenitalabnormalitiesinoffspring[J].AmJHumGenet,2021,96(4):651-656.[5]PellestorF,AnahoryT,LefortG,etal.Complexchromosomalrearrangements:originandmeioticbehavior[J].HumReprodUpdate,2018,17(4):476-494.[6]吳菁,尹愛華,傅文婷,等.改良同步化法制備外周血染色體500條G顯帶技術(shù)的臨床應(yīng)用研究[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2020,30(3):377-378.[7]YunisJJ.Highresolutionofhumanchromosomes[J].Science,1976,191(4233):1268-1270.[8]PootM,HaafT.Mechanismsoforigin,phenotypiceffectsanddiagnosticimplicationsofcomplexchromosomerearrangements[J].MolSyndromol,2021,6(3):110-134.[9]AristidouC,TheodosiouA,KetoniA,etal.Crypticbreakpointidentifiedbywhole-genomemate-pairsequencinginararepaternallyinheritedcomplexchromosomalrearrangement[J].MolCytogenet,2021,11:34.[10]廖亞平,王春景,梁猛,等.平衡復(fù)雜染色體重排攜帶者的遺傳與生育情況分析[J].遺傳,2021,39(5):396-412.[11]ZhangT,SunY,ChenZ,etal.Traditionalandmolecularchromosomalabnormalityanalysisofproductsofconceptioninspontaneousandrecurrentmiscarriage[J].BJOG,2021,125(4):414-420.[12]TsaiAG,LieberMR.Mechanismsofchromosomalrearrangementinthehumangenome[J].BMCGenomics,2018,11Suppl1:S1.[13]DeGregoriM,CicconeR,MaginiP,etal.Crypticdeletionsareacommonfindinginbalancedreciprocalandcomplexchromosomerearrangements:astudyof59patients[J].JMedGenet,2007,44(12):750-762.[14]PatsalisPC.Complexchromosomalrearrangements[J].GenetCouns,2007,18(1):57-69.[15]KauschK,HaafT,K?hlerJ,etal.Complexchromosomalrearrangementinawomanwithmultiplemiscarriages[J].AmJMedGenet,1988,31(2):415-420.[16]KousseffBG,PapenhausenP,EssigYP,etal.Complexchromosomerearrangementwithankyloblepharonfiliformeadnatum[J].JMedGenet,1993,30(2):167-170.[17]GiardinoD,CortiC,BallaratiL,etal.Prenataldiagnosisofadenovocomplexchromosomerearrangement(CCR)mediatedbysixbreakpoints,andareviewof20prenatallyascertainedCCRs[J].PrenatDiagn,2006,26(6):565-570.[18]MartinRH.Cytogeneticdeterminantsofmalefertility[J].HumReprodUpdate,2008,14(4):379-390.[19]VermeulenS,MentenB,VanRoyN,etal.Molecularcytoge