抗體工程制藥

關(guān)于抗體工程制藥第一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第一節(jié)概述第二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日一、基本概念1、抗體（antibody，Ab）指機(jī)體的免疫細(xì)胞被抗原激活后，由B淋巴細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于組織液及外分泌液中。

即能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。第三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig

）具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋白。因結(jié)構(gòu)不同可分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE5種。

免疫球蛋白是結(jié)構(gòu)及化學(xué)的概念，而抗體是生物學(xué)及功能的概念。

第四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3、抗原（antigen，Ag）一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)使之產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物(抗體)在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖幕咎匦杂袃煞N，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是反應(yīng)原性。

第五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日抗原的分類

完全抗原（completeantigen）

簡稱抗原。是一類既有免疫原性，又有反應(yīng)性性的物質(zhì)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒、細(xì)菌外毒素等都是完全抗原。不完全抗原

即半抗原，是只具有免疫反應(yīng)性，而無免疫原性的物質(zhì)。如：多糖、青霉素、磺胺劑和花粉等。半抗原與蛋白質(zhì)載體結(jié)合后，就獲得了免疫原性。第六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日4、抗原表位（epitope）指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。

又稱為抗原決定簇。第七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日抗體工程制藥

（antibodyengineeringpharmaceutics）是指利用基因工程、細(xì)胞工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物技術(shù)生產(chǎn)抗體藥物的過程。第八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日抗體藥物的應(yīng)用

治療腫瘤目前在臨床中使用的腫瘤治療藥物多數(shù)存在“敵我不分”的問題，即在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也破壞了人體正常細(xì)胞。“生物導(dǎo)彈”為解決這個(gè)難題提供了一個(gè)理想的思路。“生物導(dǎo)彈”，即將各種毒素、放射性同位素、化療藥物與識別腫瘤特異抗原或腫瘤相關(guān)抗原的抗體偶聯(lián)后，能夠特異殺傷腫瘤細(xì)胞的一類藥物。這種藥物經(jīng)由靜脈注入人體內(nèi)，藥效分子集中作用于腫瘤細(xì)胞，既增強(qiáng)療效又減少對機(jī)體的毒副作用。放射性同位素與抗體的偶聯(lián)物在體內(nèi)能將前者運(yùn)至藥靶部位，并通過其放射性活性殺傷靶細(xì)胞。第九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)器官移植排斥進(jìn)行器官移植時(shí)，可以采用某些抗體類藥物來逆轉(zhuǎn)器官移植引起的排斥反應(yīng)。如最早批準(zhǔn)（1986年）進(jìn)入美國市場的治療性抗體類藥物——抗CD3單抗即被用于腎、心臟、肝臟移植排斥的逆轉(zhuǎn)。

第十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日目前正在進(jìn)行開發(fā)和已經(jīng)投入市場的抗體藥物主要有以下幾種用途：

1．器官移植排斥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)；

2．腫瘤免疫診斷；

3．腫瘤免疫顯像；

4．腫瘤導(dǎo)向治療；

5．哮喘、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、急性心梗、膿毒癥、多發(fā)性硬化癥及其他自身免疫性疾?。?/p>

6．抗獨(dú)特型抗體作為分子瘤苗治療腫瘤；第十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日抗體工程的發(fā)展1937年用電泳法將血清分為白蛋白、甲種、乙種、丙種球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年，kohler和milstein首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體，得以規(guī)?；苽涮禺愋?、均質(zhì)性抗體。通過基因工程技術(shù)制備人-鼠嵌合抗體、人源化抗體等。第十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日抗體技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷的三個(gè)階段：第一代：抗血清多克隆抗體第二代：70年代中期，利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備的雜交瘤單克隆抗體（McAb）第三代：基因工程抗體。第十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日多克隆抗體

(polyclonalantibody,pAb)天然抗原分子中常含有多種抗原決定簇，以該物質(zhì)刺激機(jī)體，體內(nèi)多個(gè)B淋巴細(xì)胞被激活，產(chǎn)生的抗體實(shí)際上含有針對多種不同抗原表位的抗體，是多克隆抗體；1、抗血清第十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。多克隆抗體的產(chǎn)生過程當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成漿細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。第十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日獲得多抗的途徑：動(dòng)物免疫血清恢復(fù)期患者血清免疫接種人群血清第十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日動(dòng)物抗血清的優(yōu)缺點(diǎn)從動(dòng)物血清提取抗體主要克服了人血漿來源有限造成的制約。然而，動(dòng)物來源產(chǎn)品均存在潛在的危險(xiǎn)，如過敏和傳播感染性病原體等。多抗體異性不高，易發(fā)生交叉反應(yīng)。第十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日

解決單抗特異性不高的理想方法是針對單一表位的特異性抗體-單克隆抗體。第十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2、單克隆抗體（monoclonalantibody，mAb

）

第十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日如果能選出一個(gè)漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體（mAb）。單克隆抗體的概念第二十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日問題：漿細(xì)胞在體外壽命短，難以培養(yǎng)和擴(kuò)增，怎么辦？第二十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日解決辦法

1975年，kohler和milstein將以下兩種細(xì)胞融合：B細(xì)胞：能產(chǎn)生抗體，但壽命短骨髓瘤細(xì)胞：壽命長雜交瘤細(xì)胞第二十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日mAb制備過程第二十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日每個(gè)雜交瘤細(xì)胞由一個(gè)B細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合，僅合成和分泌抗單一抗原表位的特異性抗體，即單克隆抗體。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)單一，特異性強(qiáng)，交叉反應(yīng)少。第二十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日問題從動(dòng)物脾臟B細(xì)胞獲得的單克隆抗體（即鼠源性抗體）對人具有較強(qiáng)的免疫原性，會產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA)。對單克隆抗體進(jìn)行改造，產(chǎn)生了基因工程抗體。第二十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3、基因工程抗體

（geneticallyengineeredantibodies，gAb）是通過基因工程技術(shù)獲得抗體，即通過PCR技術(shù)獲得抗體基因，與載體重組后，引入表達(dá)系統(tǒng)后，表達(dá)產(chǎn)生的抗體。優(yōu)點(diǎn)：即保持了單抗的均一性、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，又能克服其作為鼠源性抗體的不足。第二十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日簡言之，基因工程抗體就是將人源抗體的編碼基因克隆到真核或原核表達(dá)系統(tǒng)中，體外表達(dá)人源化抗體其根本出發(fā)點(diǎn)是解決抗體的鼠源性問題。

第二十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第二節(jié)

抗體分子的結(jié)構(gòu)和功能第二十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日二、抗體的結(jié)構(gòu)第二十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（一）基本結(jié)構(gòu)第三十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日1.輕鏈（lightchain，L鏈）由214個(gè)氨基酸殘基組成，相對分子量25kD，同一抗體分子上2條L鏈總是相同。第三十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2.重鏈（heavychain，H鏈）由450~570個(gè)氨基酸組成，相對分子量約50~70kD。每條H鏈含有4～5個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵所組成的環(huán)肽，為球形。第三十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3.可變區(qū)（V區(qū)）和恒定區(qū)（C區(qū)）V區(qū)：近N-端輕鏈的1/2區(qū)段、重鏈的1/4或1/5區(qū)段的氨基酸組成及排列順序多變，分為VL和VH。C區(qū)：近C-端輕鏈的1/2區(qū)段、重鏈的3/4或4/5區(qū)段的氨基酸組成較恒定,分為CH1、CH2、CH3。

第三十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日可變區(qū)是指此區(qū)域內(nèi)的氨基酸序列在不同的抗體中不同。恒定區(qū)是指此區(qū)域內(nèi)的氨基酸序列在不同的抗體中相同。第三十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日4.超變區(qū)（HVR區(qū)）和骨架區(qū)（FR）HVR：可變區(qū)中，某些特定位置的氨基酸殘基顯示更大的變異性。它們共同組成抗原結(jié)合部位，該部位在空間結(jié)構(gòu)上可與抗原決定簇形成精密的互補(bǔ)。也稱為互補(bǔ)決定區(qū)（complementary-determiningregion，CDR），分別稱為CDR1，CDR2，CDR3。

FR：可變區(qū)中氨基酸殘基變化小的部分，維持空間結(jié)構(gòu)。第三十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日5.鉸鏈區(qū)（hingeregion）CH1和CH2之間的區(qū)域。含大量脯氨酸，具有彈性，易發(fā)生伸展及一定程度扭曲，有利于與抗原表位間的互補(bǔ)性結(jié)合。

第三十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）功能區(qū)1.抗體的功能區(qū)由一條多肽鏈折疊而成的球形結(jié)構(gòu)域稱為功能區(qū)。每個(gè)功能區(qū)約由110個(gè)氨基酸組成，具有不同生物學(xué)功能。

第三十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2.各功能區(qū)的功能VH和VL共同構(gòu)成抗原特異性結(jié)合部位。補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)借助CH2通過胎盤屏障第三十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（三）水解片段Ig分子中有些部位在一定條件下，容易被蛋白酶水解為各種片段。常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。Ig酶解的片段獲得，大大促進(jìn)了Ig分子結(jié)構(gòu)和功能的研究，同時(shí)也為各種基因工程抗體的構(gòu)建打下了基礎(chǔ)。如DNA操作和抗體改型技術(shù)的發(fā)展，使得人們可根據(jù)抗體水解片段的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，產(chǎn)生更多有功能的Ig改型分子片段

第三十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日1.木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶水解Ig分子可產(chǎn)生2個(gè)抗原結(jié)合片段（fragmentofantigen-binding，F(xiàn)ab）、一個(gè)可結(jié)晶片段（fragmentcrystalizable，F(xiàn)c）。Fc片段相當(dāng)于兩條重鏈的CH2和CH3功能區(qū)，由二硫鍵連接，可形成結(jié)晶，其無抗原結(jié)合活性，但具有固定補(bǔ)體、結(jié)合Fc受體等功能。Fab片段包括完整的輕鏈和部分重鏈（VH和CH1），能與一個(gè)抗原特異性結(jié)合，具有單價(jià)抗體活性?？赏ㄟ^基因工程獲得Fab片段。第四十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2.胃蛋白酶水解Ig分子可產(chǎn)生1個(gè)F（ab’）2、若干個(gè)裂解的小分子片段（pFc’）。

F（ab’）2含有兩條L鏈和略大于Fab段的H鏈，由二硫鍵連接，具有雙價(jià)抗體活性。第四十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日四、抗體的功能（一）V區(qū)的功能識別并結(jié)合抗原（二）C區(qū)的功能激活補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)免疫細(xì)胞活性穿過胎盤和粘膜第四十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第三節(jié)單克隆抗體的制備第四十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日主要分為以下幾個(gè)步驟：抗原的制備動(dòng)物的免疫抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)與篩選大量制備單克隆抗體第四十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日一、單克隆抗體技術(shù)的基本原理B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進(jìn)行無限分裂;而瘤細(xì)胞雖然可以在體外進(jìn)行無限傳代，但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細(xì)胞融合后得到的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性。

第四十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日兩類細(xì)胞融合物中存在以下細(xì)胞：未融合的單核親本細(xì)胞（脾、瘤細(xì)胞）同型融合多核細(xì)胞（脾-脾、瘤-瘤融合細(xì)胞）異型融合雙核細(xì)胞（脾-瘤融合細(xì)胞）第四十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日雜交瘤細(xì)胞的篩選使用HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基蝶呤、T為胸腺嘧啶核苷）培養(yǎng)基。

第四十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日HAT篩選雜交瘤細(xì)胞的原理哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，DNA前體物的合成有兩種不同的途徑：

從頭合成途徑：可被氨基蝶呤阻斷

補(bǔ)救合成途徑：需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶（TK)存在。骨髓瘤細(xì)胞株：從頭合成途徑被A阻斷；是HGPRT缺陷（HGPRT-)和TK缺陷（TK-),不能利用培養(yǎng)基中的H和T完成DNA的合成而死亡。第四十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日二、抗原和免疫（一）抗原的制備1.提取純化天然抗原運(yùn)用蛋白質(zhì)等分離純化技術(shù)分離蛋白質(zhì)分子作為抗原。對于含量低的蛋白分離純化成本高，目前已少用。第四十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2.用基因工程技術(shù)制備重組蛋白抗原可獲得足夠數(shù)量蛋白抗原。原核系統(tǒng)只能提供連續(xù)氨基酸表位的抗原。真核及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)可解決抗原構(gòu)象表位，但產(chǎn)量低，成本過高。第五十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3.合成多肽半抗原根據(jù)抗原蛋白的氨基酸序列，經(jīng)人工合成抗原表位的多肽片段，即多肽半抗原。該方法效率高、成本低，已成為抗原制備的主要來源。

半抗原：只有反應(yīng)原性而無免疫原性的物質(zhì)。其可與抗體或致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，但不能單獨(dú)誘發(fā)免疫應(yīng)答。第五十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日小分子半抗原抗生素（青霉素等）、農(nóng)藥、重金屬等屬于小分子半抗原。多肽半抗原及小分子半抗原與載體偶聯(lián)載體如牛血清清蛋白（BSA)等。第五十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）動(dòng)物及免疫免疫接種的目的是使B細(xì)胞在特異性抗原刺激下分化、增殖、分泌特異性抗體。1.動(dòng)物的選擇一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫。常用的骨髓瘤品系來自Balb/c小鼠和Lou大鼠，免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)品系。Balb/c小鼠第五十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2.免疫方法有體內(nèi)、體外和脾內(nèi)免疫法。體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多。第五十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日體外免疫

體外免疫是指在一定條件下，在體外將正常脾細(xì)胞與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。

第五十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日體外免疫方法分離小鼠脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)液中，加適量滋養(yǎng)細(xì)胞與抗原，37度5％CO2培養(yǎng)3天。體外免疫方案免疫效果不如其它方案，僅用于抗原量極少，抗原免疫原性弱的抗原。用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況。第五十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日脾內(nèi)免疫

小鼠麻醉后，打開腹腔，沿脾臟長軸方向緩慢注入可溶性抗原，免疫后3～4d即可取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。

目前最常用的是體內(nèi)免疫法。第五十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3.乳化為增強(qiáng)免疫原性，常加入佐劑（弗氏佐劑）。初次免疫時(shí)，抗原需要與一定量弗氏完全佐劑混合，經(jīng)乳化后應(yīng)用。加強(qiáng)免疫時(shí)，可以用不完全佐劑，或不用佐劑。第五十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日弗氏完全佐劑

由油劑（石蠟油或植物油）、乳化劑（羊毛脂或吐溫（Tween）80）滅活的分枝桿菌（卡介苗）組成。

有比較強(qiáng)烈的刺激免疫系統(tǒng)，被免疫系統(tǒng)認(rèn)為是外界物質(zhì)的作用。能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答。

第五十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日弗氏不完全佐劑

只有石蠟油和羊毛脂，缺少滅活的結(jié)核菌的弗氏佐劑。

弗氏完全佐劑用于初次免疫刺激。弗氏不完全佐劑用于加強(qiáng)免疫。第六十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日乳化用佐劑將抗原包裹使之形成油包水乳劑。乳化方法有：乳缽研磨、機(jī)械攪拌等。第六十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日4.體內(nèi)免疫途徑皮下、腹腔和靜脈注射等（抗原量多）。皮下、皮內(nèi)和足掌等多點(diǎn)注射（抗原量少）。體內(nèi)免疫后藥物吸收進(jìn)入血液。第六十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日5.免疫程序初次免疫（Ag100-500ug加弗氏完全佐劑注射）第二次免疫（劑量同上，加弗氏不完全佐劑注射）加強(qiáng)免疫（融合前免疫）無菌取脾，制備脾細(xì)胞第三次免疫（劑量同上，加弗氏不完全佐劑注射）4周后4周后5-7天采血，檢測抗體效價(jià)，2周后3天后第六十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日三、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的選擇細(xì)胞融合（cellfusion）是2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過程。免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞

+骨髓瘤細(xì)胞=雜交瘤細(xì)胞。所需要的細(xì)胞：免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、飼養(yǎng)細(xì)胞。第六十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（一）細(xì)胞的準(zhǔn)備1.

免疫脾細(xì)胞指處于免疫狀態(tài)脾臟中的B淋巴母細(xì)胞。取加強(qiáng)免疫以后3天的脾臟制備B淋巴母細(xì)胞。此時(shí)，脾臟體積是正常鼠脾臟體積的2倍，B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合成功率較高。第六十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日免疫脾細(xì)胞制備操作步驟小鼠最后一次加強(qiáng)免疫3天后，摘除眼球取血斷頸處死，浸泡于75%酒精消毒無菌剪刀分離脾臟脾臟用RPMI培養(yǎng)液洗滌一次，制成細(xì)胞懸液曬網(wǎng)過濾，細(xì)胞計(jì)數(shù)離心，棄上清培養(yǎng)液重懸，冰水浴中備用第六十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日2.骨髓瘤細(xì)胞融合前兩周開始復(fù)蘇。培養(yǎng)基RPMI1640、DMEM均可作為其培養(yǎng)基，小牛血清的濃度一般在10~20%,1:10傳代稀釋?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)高于95%，以保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期。第六十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3.飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）加入的目的在于促進(jìn)細(xì)胞生長繁殖。能滿足雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性，能釋放某些生長刺激因子。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。第六十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備操作步驟（融合前2-3天制備）Balb/c小鼠斷頸處死，浸泡于75%酒精消毒無菌剪刀剪開腹腔，暴露腹膜無菌注射器注入腹腔培養(yǎng)液8-12ml反復(fù)沖洗，吸出沖洗液離心，棄上清培養(yǎng)液重懸，加入96孔板，37度，CO2孵箱培養(yǎng)備用第六十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合取適量脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞（3:1~5:1）進(jìn)行混合，在聚乙二醇作用下誘導(dǎo)融合，2min左右。PEG濃度越高，促融率越大，但毒性也越大。常用濃度40~50%，分子量4kD。常用方法有轉(zhuǎn)動(dòng)法和離心法。第七十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日細(xì)胞融合流程圖將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在離心管中混合培養(yǎng)液洗1次，離心，棄上清吸盡殘留液體，37℃水浴，加入細(xì)胞融合劑加入不完全培養(yǎng)液，終止融合劑的作用離心，棄上清用含20％小牛血清RPMI1640（含HAT）融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，孵箱培養(yǎng)第七十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（三）HAT選擇雜交瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中，次日即可觀察到骨髓瘤細(xì)胞相繼死亡。融合后3-4天可在鏡下觀察到細(xì)胞克隆的形成。第七十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日四、篩選陽性克隆及克隆化篩選陽性克?。╯creening）：即篩選能分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞。方法：是用抗原分別檢測雜交瘤細(xì)胞中分泌的抗體，常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)、放射免疫測定（radioimmunoassay，RIA）等。第七十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日ELISA法的原理其基本方法是將已知的抗體或抗原吸附在固相載體表面。加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過反應(yīng)也結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。第七十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日ELISA實(shí)驗(yàn)流程示圖

第七十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平。例如：用酶免疫測定法測定口蹄疫抗體，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。第七十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日操作程序①加抗體包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干②加待檢抗原→37℃30分鐘，洗滌三次、拋干③加酶標(biāo)抗體→37℃30分鐘，洗滌三次、拋干④加底物液→37℃15分鐘，加終止液⑤用ELISA檢測儀測定OD值。

第七十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日酶標(biāo)板

酶標(biāo)板(ELISAPLATE):在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)中,作為載體的固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面對抗原、抗體或抗原抗體復(fù)合物的吸附也起著重要作用。酶標(biāo)板根據(jù)其孔數(shù)可以分為48孔，96孔。一般常用的為96孔。

酶標(biāo)儀即酶聯(lián)免疫檢測儀,是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的專用儀器.其工作原理基本上都是一致的,其核心都是一個(gè)比色計(jì),即用比色法來分析抗原或抗體的含量.

酶標(biāo)儀第七十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（二）雜交瘤細(xì)胞的克?。╟loning）是指將陽性孔中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞分離出來。方法：克隆化的原則：對于檢測陽性的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)盡早克隆化。

有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板，每孔一個(gè)細(xì)胞。第七十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日（三）雜交瘤細(xì)胞的凍存及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞是很有必要的。細(xì)胞凍存液：50%小牛血清，40%不完全培養(yǎng)液和10%DMSO。方法：室溫降到0℃，再降到-70℃，轉(zhuǎn)入液氮中。第八十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日六、單克隆抗體的大量制備體內(nèi)培養(yǎng)法

利用活體動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，將雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠或大鼠的腹腔內(nèi)生長并分泌單抗。

方法是：腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7~10天后抽取腹水，離心，得上清液。第八十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日降植烷

降植烷是一種免疫抑制劑。所以，提前一周注射降植烷、液體石蠟等免疫抑制劑，總的來說是為了提高單克隆抗體產(chǎn)生的效率。第八十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日體外培養(yǎng)法

體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中獲得抗體。該方法獲得的抗體產(chǎn)量較體內(nèi)培養(yǎng)法低。第八十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日七、單克隆抗體的純化澄清和沉淀處理：離心沉淀，過濾，蛋白沉淀。分離純化：層析技術(shù)。第八十四頁，共一百零四頁，2022年，8月28日第四節(jié)基因工程抗體第八十五頁，共一百零四頁，2022年，8月28日單克隆抗體的缺點(diǎn)絕大多數(shù)來源于小鼠或大鼠。人體使用鼠抗體會產(chǎn)生人抗鼠抗體，產(chǎn)生超敏反應(yīng)。解決辦法制備人源性抗體，但人-人雜交瘤技術(shù)未實(shí)現(xiàn)突破。第八十六頁，共一百零四頁，2022年，8月28日基因工程抗體制備抗體基因，與載體連接后導(dǎo)入受體細(xì)胞，表達(dá)抗體。第八十七頁，共一百零四頁，2022年，8月28日基因工程抗體包括抗體抗體片段抗體偶聯(lián)物抗體融合蛋白等第八十八頁，共一百零四頁，2022年，8月28日一、Fab與FvFab抗體片段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵形式連接而成。第八十九頁，共一百零四頁，2022年，8月28日Fv抗體片段由一個(gè)VH和一個(gè)VL組成。通過非共價(jià)鍵結(jié)合組成，是抗體中具有完整抗原結(jié)合活性的最小功能片段。分子片段小，免疫原性弱，對實(shí)體瘤的穿透性強(qiáng)。Fv可作為靶向載體藥物、毒素等結(jié)合，用于腫瘤的治療。第九十頁，共一百零四頁，2022年，8月28日二硫鍵穩(wěn)定的Fv（disulfide-stablized，dsFv）由一個(gè)VH和一個(gè)VL組成。是在VH和一個(gè)VL

的適當(dāng)位置各引入一個(gè)半胱氨酸，形成dsFv

。二硫鍵遠(yuǎn)離CDRs互補(bǔ)決定區(qū)，不會影響與抗原的結(jié)合。第九十一頁，共一百零四頁，2022年，8月28日二、單鏈抗體（SinglechainFv

，ScFv）是利用DNA重組技術(shù)將抗體的一條VH和VL基因，通過一條短肽鏈(一般為15個(gè)氨基酸)連接后表達(dá)出來的抗體片段。第九十二頁，共一百零四頁，2022年，8月28日單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)是:只含有V區(qū)，不含F(xiàn)c段，不與非靶細(xì)胞結(jié)合，可作為藥物的導(dǎo)向載體。分子小，容易進(jìn)入組織(包括腫瘤),因而可用于腫瘤的診斷和治療;因其為單鏈,易于進(jìn)行分子改造,如與毒素等拼接成為免疫毒素,可以直接殺傷靶細(xì)胞;可由大腸桿菌等發(fā)酵,進(jìn)行大批量生產(chǎn)，優(yōu)于完整抗體。第九十三頁，共一百零四頁，2022年，8月28日3.單鏈抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用

構(gòu)建和生產(chǎn)免疫毒素（immunotoxin）免疫毒素：抗體與毒素的偶聯(lián)物可將毒素定位于靶細(xì)胞，對靶細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷。是將單鏈抗體基因C末端與毒素基因相連，經(jīng)表達(dá)后獲得scFv與毒素的融合蛋白。常用的毒素有綠膿桿菌外毒素PE、蓖麻毒素、白喉毒素等。將抗表皮生長因子的單鏈抗體EGF與PE40偶聯(lián)，獲得的重組毒