HBV-LP會(huì)議宣傳用課件

一種新的乙肝診斷血清免疫學(xué)指標(biāo)

－－－－乙肝病毒大蛋白

美國(guó)Ｕab大學(xué)一種新的乙肝診斷血清免疫學(xué)指標(biāo)

－－－－乙肝病毒大蛋白

1乙型肝炎流行現(xiàn)狀乙型肝炎是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。全球60億人口中，約1/2人口生活在HBV高流行區(qū)，約20億人證明有HBV感染，3～4億人為HBV慢性感染，其中25%～40%最終將死于肝硬化和肝癌。全球前10位疾病死因中乙肝占第7位，每年因乙肝死亡約75萬(wàn)例乙型肝炎流行現(xiàn)狀乙型肝炎是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。2中國(guó)乙型肝炎流行現(xiàn)狀(一)HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎增多(二)HBV變異株增加HBV的突變率較高，

中國(guó)乙型肝炎流行現(xiàn)狀3HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎臨床特點(diǎn)：(1)轉(zhuǎn)為肝硬化和肝癌比例較大；(2)與年齡相關(guān)：患者年齡較大；(3)疾病自發(fā)或持續(xù)減輕極少發(fā)生；(4)何時(shí)停藥難以確定；(5)治療后復(fù)發(fā)率高。HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎臨床特點(diǎn)：4HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性乙肝與HBeAg陽(yáng)性乙肝不同點(diǎn)：(1)慢性肝炎病情不減輕；(2)生化學(xué)和病毒學(xué)標(biāo)志反復(fù)升高；(3)可30～40年無(wú)癥狀；(4)約45歲左右發(fā)生肝硬化；(5)10年后約25%發(fā)生并發(fā)癥。HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性乙肝與HBeAg陽(yáng)性乙5HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性的慢性乙肝流行率升高原因：(1)持續(xù)免疫壓力導(dǎo)致突變株選擇；(2)長(zhǎng)期治療導(dǎo)致病毒變異；(3)前C和C啟動(dòng)子變異；(4)檢測(cè)方法的靈敏度提高。

HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性的慢性乙肝流行率升高6HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎臨床診斷現(xiàn)狀：(1)傳統(tǒng)“兩對(duì)半”指標(biāo)不能反映此類(lèi)患者HBV復(fù)制程度；(2)缺乏指導(dǎo)合理治療的指標(biāo)；(3)HBVDNA檢測(cè)不易于各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛開(kāi)展；(4)臨床上急需能夠反映HBV復(fù)制程度及指導(dǎo)治療的指標(biāo)。

HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎臨床診斷現(xiàn)7抗病毒治療效果監(jiān)測(cè)臨床上用于抗病毒治療的藥物干擾素核苷類(lèi)似物抗病毒治療效果監(jiān)測(cè)臨床上用于抗病毒治療的藥物8抗病毒治療效果監(jiān)測(cè)臨床上缺乏評(píng)估抗病毒治療效果的指標(biāo)。以HBVDNA陰轉(zhuǎn)作為治療的終點(diǎn)不恰當(dāng)，此時(shí)停藥病情易反復(fù)?？共《局委熜ЧO(jiān)測(cè)臨床上缺乏評(píng)估抗病毒治療效果的指標(biāo)。9乙肝病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的缺陷

抗病毒治療效果評(píng)價(jià)血清學(xué)指標(biāo)缺乏

臨床上評(píng)價(jià)抗乙肝病毒治療效果時(shí)存在一個(gè)很大的問(wèn)題，即其評(píng)價(jià)指標(biāo)主要是肝功能的改善與否、血清乙肝病毒DNA水平的變化以及肝組織的病理學(xué)改變等。誠(chéng)然，這些指標(biāo)對(duì)臨床醫(yī)生判斷患者病情而言非常重要和實(shí)用，也是臨床醫(yī)生選用抗乙肝病毒藥物時(shí)的依據(jù)，然而對(duì)于何時(shí)停用抗病毒藥物、停用抗病毒藥物后乙肝病毒是否會(huì)重新復(fù)制活躍導(dǎo)致乙肝復(fù)發(fā)則缺乏客觀而有效的指標(biāo)。

乙肝病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的缺陷抗病毒治療效果評(píng)價(jià)血清學(xué)指標(biāo)缺乏10乙型肝炎血清學(xué)診斷技術(shù)新突破

乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）前S區(qū)酶免定量試劑盒

-------直接定量檢測(cè)乙肝大蛋白-------不用分開(kāi)檢測(cè)前S1和前S2乙型肝炎血清學(xué)診斷技術(shù)新突破

乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）11HBV-LP診斷試劑新穎之處采用病毒樣顆粒制作針對(duì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)的高活性抗體同時(shí)檢測(cè)前S1和前S2進(jìn)行定量檢測(cè)，用于評(píng)估抗病毒治療效果和預(yù)后診斷HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎的唯一血清學(xué)指標(biāo)評(píng)估治療效果及判定治療終點(diǎn)唯一血清學(xué)指標(biāo)大蛋白完全消退意味患者預(yù)后良好HBV-LP診斷試劑新穎之處12乙肝病毒包膜蛋白研究進(jìn)展1995-2004年發(fā)現(xiàn)大蛋白前S區(qū)有復(fù)雜構(gòu)象結(jié)構(gòu)1996年發(fā)現(xiàn)大蛋白具有反式激活病毒復(fù)制的作用2002年發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肝細(xì)胞病變及凋亡的主要原因是大蛋白2004年實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建針對(duì)構(gòu)象型抗原的單克隆抗體2005年國(guó)內(nèi)公司成功研制乙肝表面抗原大蛋白酶聯(lián)免疫定量試劑盒乙肝病毒包膜蛋白研究進(jìn)展1995-2004年發(fā)現(xiàn)大蛋白前13HepatitisB——乙型肝炎HepatitisB——乙型肝炎14HBV模型HBV模型15HBV包膜蛋白HBV包膜蛋白16HBV的表面抗原的組成HBV的表面抗原的組成17HBV病毒結(jié)構(gòu)成分HBV病毒結(jié)構(gòu)成分18HBV-LP與病毒復(fù)制密切相關(guān)HBVDane管形球型血流中的分布L-HBs大蛋白存在存在不含僅病毒復(fù)制期存在M-HBs中蛋白存在存在1%含量非復(fù)制期少量存在S-HBs小蛋白存在存在存在存在根據(jù)檢測(cè)血液中大蛋白的有無(wú)，判斷病毒攜帶者體內(nèi)的HBV病毒是否在進(jìn)行復(fù)制。HBV-LP與病毒復(fù)制密切相關(guān)HBVDane管形球型19乙肝病毒包膜蛋白preS特性:暴露在病毒顆粒表面高免疫原性參與了病毒與細(xì)胞受體的相互作用誘導(dǎo)抗感染的保護(hù)性抗體的產(chǎn)生NeurathAR,KentSB,StrickN,ParkerK.Delineationofcontiguousdeterminantsessentialforbiologicalfunctionsofthepre-SsequenceofthehepatitisBvirusenvelopeprotein:itsantigenicity,immunogenicityandcell-receptorrecognition.AnnInstPasteurVirol.1988Jan-Mar;139(1):13-38.乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究乙肝病毒包膜蛋白preS特性:NeurathAR,K20PrangeR,StreeckRE.NoveltransmembranetopologyofthehepatitisBvirusenvelopeproteins.EMBOJ1995;14:247-256LambertC.etal.AssessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnavirallareenvelopeproteinsJ.GeneralVirology200485,1221-1225.乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究HBV病毒顆粒表面的PreS已經(jīng)被證實(shí)具有獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域和天然構(gòu)象很多研究致力于表達(dá)并觀測(cè)PreS的結(jié)構(gòu)，但是極少成功。其原因是單獨(dú)表達(dá)的PreS很容易被蛋白酶所降解。PrangeR,StreeckRE.Noveltr21(A)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上乙肝大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型。(B)病毒體包膜上的乙肝大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型。VolkerBruss,XuanyongLu1,ReinerThomssenandWolframH.Gerlich'.Post-translationalalterationsintransmembranetopologyofthehepatitisBviruslargeenvelopeprotein.TheEMBOJournalvol.13no.10pp.2273-2279,1994乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究(A)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上乙肝大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型。乙肝病22HBVL包膜蛋白（大蛋白）的結(jié)構(gòu)域和穿膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

A.大蛋白的構(gòu)成組分，含preS1、preS2及S結(jié)構(gòu)

B.大蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)CarstenLambert,SylviaMannandReinhildPrange.Assessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnavirallargeenvelopeproteins.JournalofGeneralVirology(2004),85,1221–1225乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究HBVL包膜蛋白（大蛋白）的結(jié)構(gòu)域和穿膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Cars23

AA99－169形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這一序列橫跨前S1和前S2，是其主要免疫表位。乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究VolkerBrussEnvelopmentofthehepatitisBvirusnucleocapsidVirusResearch106(2004)199–20929September2004AA99－169AA99－169形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這一序24L蛋白i-pre-S形式的功能模式圖。黑點(diǎn)表示L蛋白pre-S結(jié)構(gòu)略去S和M蛋白分泌的病毒體表面的e-pre-S結(jié)構(gòu)很可能具有結(jié)合病毒受體的功能。目前的數(shù)據(jù)顯示L蛋白的i-pre-S結(jié)構(gòu)是一種蛋白矩陣，在病毒體的形成過(guò)程中負(fù)責(zé)與核殼體相接觸，包裝外膜。VOLKERBRUSS*ANDKERSTINVIELUF.FunctionsoftheInternalPre-SDomainoftheLargeSurfaceProteininHepatitisBVirusParticleMorphogenesis.JOURNALOFVIROLOGY,Nov.1995,p.6652–6657Vol.69,No.11L蛋白i-pre-S形式的功能模式圖。VOLKERBRUS25肝炎病毒物種特異性的感染取決于病毒進(jìn)入的水平，并由病毒L蛋白上的pre-S結(jié)構(gòu)決定。Arg103和Ser124之間的序列在不同的HBV之間是高度保守的。Arg103和Ser124之間的pre-S序列對(duì)于HBV的形成具有重要功能。ＡＡ１０３－１２４橫跨前Ｓ１和前Ｓ２之間乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究VOLKERBRUSS.AShortLinearSequenceinthePre-SDomainoftheLargeHepatitisBVirusEnvelopeProteinRequiredforVirionFormation.JOURNALOFVIROLOGY,Dec.1997,p.9350–9357Vol.71,No.12TAKASHIISHIKAWAANDDONGANEM.Thepre-SdomainofthelargeviralenvelopeproteindetermineshostrangeinavianhepatitisBviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.92,pp.6259-6263,July1995

肝炎病毒物種特異性的感染取決于病毒進(jìn)入的水平，并由病毒L蛋白26DeterminationoftheMinimalDistancebetweentheMatrixandTransmembraneDomainsoftheLargeHepatitisBVirusEnvelopeProteinJournalofVirology,June2005,p.7918-7921,Vol.79,No.120022-538XＡＡ１０３－１２４形成特殊的矩陣結(jié)構(gòu)跨膜區(qū)ＡＡ２５４－２７２，維持它們正常結(jié)構(gòu)的最短距離是２６個(gè)ＡＡ．乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究DeterminationoftheMinimalD27

Pre-S的反式激活作用乙肝病毒大分子表面抗原（大蛋白）是一種轉(zhuǎn)錄活化因子

ThehepatitisBviruslargesurfaceprotein(LHBs)isatranscriptionalactivator.

Virology.1996Nov1;225(1):235-9.

Pre-S的反式激活作用乙肝病毒大分子表面抗原

T28BrunsM,MiskaS,ChassotS,WillH.EnhancementofhepatitisBVirusinfectionbynoninfectionssubviralparticles.JVirol,1998;76;1462-8.乙肝鴨模型證實(shí)由大蛋白組裝成的亞病毒顆粒能夠反式激活病毒繼續(xù)復(fù)制這個(gè)研究具有臨床意義,對(duì)于大蛋白陽(yáng)性而DNA陰性患者容易停藥反跳具有參考意義.亞病毒顆粒上pre-S的反式激活作用BrunsM,MiskaS,ChassotS,Will29原文：UltrastructuralAnalysisofHepatitisBVirusinHepG2-TransfectedCellsWithSpecialEmphasisonSubviralFilamentMorphogenesis作者：PHILIPPEROINGEARDANDCAMILLESUREAU作者單位：LaboratoiredeBiologieCellulaire,EPCNRS117,Faculte′deMe′decinedeTours,2bisBoulevardTonnelle′,F-37032ToursCedexFrance.發(fā)表刊物：HEPATOLOGYVol.28,No.4,1998

在乙肝病毒感染的HepG2細(xì)胞中對(duì)亞病毒纖維體的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行的超微結(jié)構(gòu)分析大蛋白與肝細(xì)胞病變研究原文：UltrastructuralAnaly30大蛋白的過(guò)量表達(dá),管狀顆粒在細(xì)胞內(nèi)堆積,導(dǎo)致體外培養(yǎng)的細(xì)胞5天內(nèi)死亡大蛋白的過(guò)量表達(dá),管狀顆粒在細(xì)胞內(nèi)堆積,導(dǎo)致體外培養(yǎng)的細(xì)胞531Chisari等和Fernandes等已經(jīng)證實(shí)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中過(guò)量表達(dá)大的表面蛋白會(huì)使肝細(xì)胞凋亡并且產(chǎn)生慢性肝炎。然而，在他們模型中的這種損傷相對(duì)比較溫和，沒(méi)有小鼠死于肝功能衰竭.轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞帶有這種蛋白L的積累滯留，則會(huì)發(fā)展為細(xì)胞的損傷作用，它會(huì)誘導(dǎo)肝的再生，在這個(gè)模型中最終導(dǎo)致肝癌Chisari等和Fernandes等已經(jīng)證實(shí)，在轉(zhuǎn)基因小鼠32大蛋白導(dǎo)致肝細(xì)胞病變研究大蛋白是導(dǎo)致FCH中肝細(xì)胞損傷,纖維化的主要原因大蛋白導(dǎo)致肝細(xì)胞病變研究大蛋白是導(dǎo)致FCH中肝細(xì)胞損傷,纖維33FCH與肝細(xì)胞內(nèi)大蛋白過(guò)量表達(dá)蛋白L的滯留也被發(fā)現(xiàn)和一種獨(dú)特的綜合癥，即纖維淤膽性肝炎（FCH）相聯(lián)系，它的特征為肝細(xì)胞的空氣球化和有著顯著的膽汁阻塞，但是它一般只有很少的炎癥發(fā)生，它發(fā)生于免疫抑制的乙肝攜帶者。來(lái)自于發(fā)生了FCH的病人的肝臟樣品，通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中有著同樣的乙肝亞病毒包膜纖維體的積累。FCH與肝細(xì)胞內(nèi)大蛋白過(guò)量表達(dá)蛋白L的滯留也被發(fā)現(xiàn)和一種獨(dú)特342002年國(guó)際肝病雜志2002年國(guó)際肝病雜志35實(shí)驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)的乙肝大表面蛋白致使培養(yǎng)的肝細(xì)胞在一些天內(nèi)死亡。乙肝大的表面蛋白會(huì)致使體外培養(yǎng)的細(xì)胞的液泡化和細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果和FCH下的肝臟病理情況相當(dāng)?shù)叵嗨?，?shí)驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)的乙肝大表面蛋白致使培養(yǎng)的肝細(xì)胞在一些天內(nèi)死亡36國(guó)內(nèi)pre-S研究（部分）文獻(xiàn)一：EstablishmentandprelimineryuseofhepatitisBVirusPreS1/2antigenassay

WorldJourneryofGastroenterology99年軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院３所文獻(xiàn)二ＥxpressionandpurificationofthecompletepreSregionofhepatitisBVirusWorldJournalofGastroenterology2005年中科院上海生化和細(xì)胞所國(guó)內(nèi)pre-S研究（部分）文獻(xiàn)一：37抗原表位目前生物科學(xué)領(lǐng)域，對(duì)天然表位的研究借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)表位已經(jīng)有比較深刻的認(rèn)識(shí)。表位的構(gòu)成方式至少有兩種：①由某些氨基酸殘基按一定順序連續(xù)排列組成的線(xiàn)狀序列，稱(chēng)為順序（sequential）表位或線(xiàn)性(linear)表位。順序表位是蛋白分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，比較穩(wěn)定，不受蛋白質(zhì)加熱變性和空間構(gòu)形改變的影響。②由分子內(nèi)不連續(xù)的2～3個(gè)氨基酸殘基折疊排列所形成的三維結(jié)構(gòu)構(gòu)成，稱(chēng)為構(gòu)象(conformational)表位；有時(shí)候，呈α螺旋式排列的連續(xù)肽鏈序列也可起到構(gòu)象表位的作用。抗原表位目前生物科學(xué)領(lǐng)域，對(duì)天然表位的研究借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的38多肽無(wú)法模擬構(gòu)象表位商品化的前S1定性檢測(cè)試劑上市，其單抗是用AA21-47化學(xué)合成的多肽而制作的。而應(yīng)用該多肽免疫制作的抗體在科研中就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，只能檢測(cè)到微弱的抗-pre-S1抗體的產(chǎn)生多肽無(wú)法模擬構(gòu)象表位39多肽無(wú)法模擬構(gòu)象表位Schodel等人曾以100ug的pre-S1(21-47)合成多肽免疫Balb/c小鼠，誘導(dǎo)生成的抗pre-s1抗體的滴度只有160，上海生化所改進(jìn)應(yīng)用pre-S1-BSA偶聯(lián)復(fù)合物免疫Balb/c小鼠，也只能檢測(cè)到微弱的抗Pre-S1的活力，

多肽無(wú)法模擬構(gòu)象表位Schodel等人曾以100ug的pre40

目前臨床使用乙肝前S1以及前S2試劑大部分研究主要集中在前S1區(qū)、前S2區(qū)。研究表明前S1區(qū)、前S2區(qū)蛋白及其抗體都與HBV-DNA、HBeAg、肝臟損害、乙肝的轉(zhuǎn)歸等都有極其密切的關(guān)系。臨床應(yīng)用：前S1試劑、前S2試劑診斷的結(jié)果與HBV-DNA、HBeAg三者之間有一定的關(guān)系，但符合率卻只有６0－８０%，甚至更低。目前臨床使用乙肝前S1以及前S2試劑大部分研究主41楊海林等完整病毒顆粒Dane顆粒標(biāo)志物PreS1蛋白藥盒的研制上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志1995vol.10:204-206楊海林等抗乙肝炎病毒表面抗原PreS1（20－47）多肽的制備、性質(zhì)和應(yīng)用。生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)1994vol26145-151使用針對(duì)化學(xué)合成多肽的單克隆抗體，無(wú)法定量監(jiān)測(cè)，無(wú)法用于療效觀察臨床應(yīng)用４－５年，靈敏度不理想，目前臨床使用乙肝前S1以及前S2試劑楊海林等完整病毒顆粒Dane顆粒標(biāo)志物PreS1蛋白藥盒的42乙肝大蛋白定量診斷試劑應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白晶體學(xué)的研究，研發(fā)出針對(duì)乙肝病毒前S區(qū)的構(gòu)象型單抗，大大提高了乙肝病毒感染者中前S區(qū)抗原即LP大蛋白的檢出率，臨床應(yīng)用表明大蛋白的檢出率與血液中病毒DNA的符合率高度符合（＞90%）。比原來(lái)的前S1試劑效果大大提高，可作為病毒復(fù)制的一個(gè)指標(biāo)。乙肝大蛋白定量診斷試劑應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白晶體學(xué)的研究，研發(fā)43乙肝大蛋白Ｐre-S抗原蛋白晶體結(jié)構(gòu)乙肝大蛋白Ｐre-S抗原蛋白晶體結(jié)構(gòu)44HBV-lp晶體結(jié)構(gòu)—空間模型HBV-lp晶體結(jié)構(gòu)—空間模型45針對(duì)大蛋白構(gòu)象表位單抗研制簡(jiǎn)要過(guò)程

（本方法是我們已經(jīng)申請(qǐng)的專(zhuān)利的一部分）獲得體外重組的PRE-S抗原獲得多抗，親和層析從強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本中獲得病毒樣顆粒病毒樣顆粒制作抗體針對(duì)大蛋白構(gòu)象表位單抗研制簡(jiǎn)要過(guò)程

（本方法是我們已經(jīng)申請(qǐng)46大蛋白試劑臨床研究1、HBVDNA陽(yáng)性標(biāo)本中HBV－LP的陽(yáng)性符合率考核單位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）例（次）數(shù)例（次）數(shù)比例（％）北京地壇醫(yī)院126825494.78北京地壇醫(yī)院2（治療系列）115214998.03解放軍傳染病研究所17013579.41遼寧沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院14313493.71浙江省湖州中心醫(yī)院（治療系列）213312896.24合計(jì)84878392.33注：1阿德福韋抗病毒治療患者43例，共檢出HBVDNA陽(yáng)性152次；2拉米夫定抗病毒治療患者51例，共檢出HBVDNA陽(yáng)性133次。大蛋白試劑臨床研究1、HBVDNA陽(yáng)性標(biāo)本中HBV－LP的472、不同HBVDNA拷貝數(shù)中HBV－LP陽(yáng)性率以及OD值比較大蛋白試劑臨床研究組別HBVDNA大蛋白試劑結(jié)果HBVDNA拷貝數(shù)例數(shù)陽(yáng)性例數(shù)陽(yáng)性率（％）大蛋白OD1＜104(陰性)842321.380.266±0.0442104432967.440.416±0.0813105634673.020.504±0.2054106242187.500.898±0.1805107171694.121.275±0.31961082323100.001.428±0.238注：解放軍傳染病研究所，HBVDNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值與HBV－LPOD值的相關(guān)系數(shù)r=0.9452、不同HBVDNA拷貝數(shù)中HBV－LP陽(yáng)性率以及OD值比48大蛋白試劑臨床研究組別HBVDNA大蛋白試劑結(jié)果HBVDNA拷貝數(shù)例(次)數(shù)陽(yáng)性例(次)數(shù)陽(yáng)性率（％）陽(yáng)性含量均值（ng）1103544888.8917.602104383797.3724.693105585696.5530.444106656396.9255.465＞106808010086.61合計(jì)/29528195.25/注：北京地壇醫(yī)院與沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院匯總，其中北京地壇醫(yī)院為阿德福韋抗病毒治療患者標(biāo)本。HBVDNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值與HBV－LP含量（ng）的相關(guān)系數(shù)3、不同HBVDNA拷貝數(shù)中HBV－LP陽(yáng)性率以及含量比較r=0.935大蛋白試劑臨床研究組別HBVDNA大蛋白試劑結(jié)果HBVDN49大蛋白試劑臨床研究大蛋白試劑臨床研究504、HBV－LP試劑與乙肝前S1試劑比較大蛋白試劑臨床研究考核單位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）乙肝前S1（＋）例數(shù)例數(shù)比例（％）例數(shù)比例（％）北京地壇醫(yī)院26825494.7817665.67解放軍傳染病研究所17013579.419757.06合計(jì)43838988.8127362.334、HBV－LP試劑與乙肝前S1試劑比較大蛋白試劑臨床研究考51大蛋白試劑臨床研究考核單位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）HBeAg（＋）北京地壇醫(yī)院沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院例數(shù)例數(shù)比例（％）例數(shù)比例（％）39136894.1217745.275、HBVDNA、HBeAg與HBV－LP三者在乙肝患者中的比較大蛋白試劑臨床研究考核單位HBVDNA（＋）HBV－L525、HBVDNA、HBeAg與HBV－LP三者在乙肝患者中的比較大蛋白試劑臨床研究HBVDNA（＋）HBeAg(＋)HBeAg(—)合計(jì)177#214*391HBV－LP（＋）172（97.18%）196（91.59%）368（94.12%）注：#其中北京地壇醫(yī)院109份；沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院68份*其中北京地壇醫(yī)院159份；沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院55份5、HBVDNA、HBeAg與HBV－LP三者在乙肝患者中536、不同HBV模式的患者中HBV－LP與HBVDNA的比較大蛋白試劑臨床研究HBVM

模式例數(shù)HBVDNA（＋）例數(shù)陽(yáng)性率(%)HBV－LP（＋）例數(shù)陽(yáng)性率(%)HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)21820292.6720694.50HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)20716780.6815876.33HBsAg(+)HBeAg(+)231982.611878.26HBsAg(+)HBcAb(+)371335.141643.24合計(jì)48540182.6839882.066、不同HBV模式的患者中HBV－LP與HBVDNA的比較54大蛋白試劑臨床研究7、HBV－LP試劑盒抗干擾能力的考評(píng)考核單位干擾血清HBV－LP結(jié)果所患疾病例數(shù)陽(yáng)性例數(shù)陽(yáng)性率（％）北京地壇醫(yī)院甲肝800丙肝800戊肝800兩種肝炎混合感染*600沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院丙肝2000合計(jì)/5000注：*含甲肝乙肝混合感染、丙肝乙肝混合感染以及戊肝乙肝混合感染各2份大蛋白試劑臨床研究7、HBV－LP試劑盒抗干擾能力的考評(píng)考核558、HBV－LP試劑盒的特異性考評(píng)大蛋白試劑臨床研究考核單位考評(píng)標(biāo)本HBV－LP結(jié)果標(biāo)本來(lái)源例數(shù)陽(yáng)性例數(shù)陰性例數(shù)特異性（％）河北省血液中心正常獻(xiàn)血員21183211599.86解放軍傳染病研究所體檢健康者1000100100北京地壇醫(yī)院體檢健康者57057100合計(jì)/22753227299.878、HBV－LP試劑盒的特異性考評(píng)大蛋白試劑臨床研究考核單位56大蛋白試劑臨床研究9、HBV－LP用于抗病毒治療的監(jiān)測(cè)北京地壇醫(yī)院進(jìn)行了阿德福韋治療患者的過(guò)程監(jiān)測(cè)浙江湖州中心醫(yī)院進(jìn)行了拉米夫定治療患者的過(guò)程監(jiān)測(cè)北京大學(xué)生物系進(jìn)行了干擾素治療患者的過(guò)程監(jiān)測(cè)大蛋白試劑臨床研究9、HBV－LP用于抗病毒治療的監(jiān)測(cè)北京地57北京地壇醫(yī)院阿德福韋治療監(jiān)測(cè)北京地壇醫(yī)院阿德福韋治療監(jiān)測(cè)58地壇阿德福韋治療系列血清地壇阿德福韋治療系列血清59典型病例典型病例60典型分析典型分析61藥物治療無(wú)效病例藥物治療無(wú)效病例62治療現(xiàn)有效果后反跳治療現(xiàn)有效果后反跳63治療先有效后反跳治療先有效后反跳64治療先有效后反跳治療先有效后反跳65治療先有效后反跳治療先有效后反跳66浙江湖州中心醫(yī)院拉米夫定治療監(jiān)測(cè)抗病毒治療過(guò)程中HBVDNA陰轉(zhuǎn)不能做為治療終點(diǎn)的指標(biāo)，HBVDNA陰轉(zhuǎn)之后患者的病情會(huì)出現(xiàn)反跳。

HBV－LP可以做為評(píng)估抗病毒治療效果的指標(biāo)，HBV－LP的完全消退提示抗病毒治療較為徹底，此時(shí)選擇停止用藥可以避免患者病情的反跳。浙江湖州中心醫(yī)院拉米夫定治療監(jiān)測(cè)抗病毒治療過(guò)程中HBVDN67HBV-LP完全消退，３年內(nèi)不反彈HBV-LP完全消退，３年內(nèi)不反彈68ＨＢＶ－ＬＰ完全消退，１８?jìng)€(gè)月內(nèi)不反彈ＨＢＶ－ＬＰ完全消退，１８?jìng)€(gè)月內(nèi)不反彈69ＨＢＶ－ＬＰ高，治療無(wú)效ＨＢＶ－ＬＰ高，治療無(wú)效70ＨＢＶ－ＬＰ高，治療無(wú)效ＨＢＶ－ＬＰ高，治療無(wú)效71ＨＢＶ－ＬＰ與疾病反彈ＨＢＶ－ＬＰ與疾病反彈72ＨＢＶ－ＬＰ與疾病反彈ＨＢＶ－ＬＰ與疾病反彈73浙江湖州中心醫(yī)院拉米夫定治療監(jiān)測(cè)

拉米夫定抗治療過(guò)程中HBVDNA的消減晚于HBVDNA的消減，由于抗病毒治療過(guò)程中肝內(nèi)HBVDNA的消減晚于血液中HBVDNA的消減，試驗(yàn)結(jié)果顯示在治療過(guò)程中HBV－LP的消減可能與肝內(nèi)HBVDNA的消減存在良好相關(guān)關(guān)系。浙江湖州中心醫(yī)院拉米夫定治療監(jiān)測(cè)74晚于ＤＮＡ消退，與ＡＬＴ同步晚于ＤＮＡ消退，與ＡＬＴ同步75浙江湖州中心醫(yī)院拉米夫定治療監(jiān)測(cè)HBV－LP可以作為一個(gè)評(píng)估抗病毒治療效果以及判定治療終點(diǎn)的指標(biāo)，能夠合理的指導(dǎo)患者的用藥，避免過(guò)早停藥導(dǎo)致的病情反復(fù)。浙江湖州中心醫(yī)院拉米夫定治療監(jiān)測(cè)76北大生物系干擾素治療監(jiān)測(cè)應(yīng)答明顯組反跳組應(yīng)答不明顯組北大生物系干擾素治療監(jiān)測(cè)應(yīng)答明顯組反跳組應(yīng)答不明顯組77sAg+S2LP+DNA+eAg+乙肝病毒成分直接檢測(cè)集合sAg+S2LP+DNA+eAg+乙肝病毒成分直接檢測(cè)集78大蛋白涵蓋HBeAg,并稍晚于血液中DNA的消退乙肝大蛋白以及乙肝標(biāo)志物消減曲線(xiàn)HBeAgHBVDNA大蛋白HBsAg大蛋白涵蓋HBeAg,并稍晚于血液中DNA的消退乙肝大蛋白以79乙肝大蛋白試劑已經(jīng)申請(qǐng)專(zhuān)利乙肝大蛋白試劑已經(jīng)申請(qǐng)專(zhuān)利80乙肝大蛋白臨床檢測(cè)意義1、病毒感染者體內(nèi)病毒復(fù)制的確切血清學(xué)指標(biāo)．2、持續(xù)陽(yáng)性者（特別是小三陽(yáng)）預(yù)后觀察3、臨床肝炎治療合理用藥指導(dǎo)，避免過(guò)度用藥．4、抗病毒治療的效果觀察,停藥時(shí)間判斷.5、體檢加查本指標(biāo)可以判斷個(gè)體是否有感染性．乙肝大蛋白臨床檢測(cè)意義1、病毒感染者體內(nèi)病毒復(fù)制的確切血清學(xué)81乙肝大蛋白臨床檢測(cè)意義我國(guó)衛(wèi)生資源分配不一，尚有很多醫(yī)院不具備HBV-DNAPCR的實(shí)驗(yàn)水平。而免疫測(cè)定技術(shù)因其有效、直接、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，已經(jīng)在臨床診斷應(yīng)用上占主導(dǎo)地位，在我國(guó)大中小型醫(yī)院普遍應(yīng)用，本試劑的誕生有利于中小型醫(yī)院也掌握血液內(nèi)病毒復(fù)制指標(biāo)的檢測(cè)方式。進(jìn)而提高臨床大夫的診斷和治療水平。并對(duì)臨床小三陽(yáng)治療有輔助診斷的意義。乙肝大蛋白臨床檢測(cè)意義我國(guó)衛(wèi)生資源分配不一，尚82乙肝大蛋白臨床檢測(cè)意義1、填補(bǔ)傳統(tǒng)兩對(duì)半試劑的空白2、彌補(bǔ)HBVDNA檢測(cè)的不足3、診斷HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎唯一血清學(xué)指標(biāo)4、抗病毒治療終點(diǎn)判定的唯一血清學(xué)指標(biāo)乙肝大蛋白臨床檢測(cè)意義1、填補(bǔ)傳統(tǒng)兩對(duì)半試劑的空白83演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！84一種新的乙肝診斷血清免疫學(xué)指標(biāo)

－－－－乙肝病毒大蛋白

美國(guó)Ｕab大學(xué)一種新的乙肝診斷血清免疫學(xué)指標(biāo)

－－－－乙肝病毒大蛋白

85乙型肝炎流行現(xiàn)狀乙型肝炎是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。全球60億人口中，約1/2人口生活在HBV高流行區(qū)，約20億人證明有HBV感染，3～4億人為HBV慢性感染，其中25%～40%最終將死于肝硬化和肝癌。全球前10位疾病死因中乙肝占第7位，每年因乙肝死亡約75萬(wàn)例乙型肝炎流行現(xiàn)狀乙型肝炎是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。86中國(guó)乙型肝炎流行現(xiàn)狀(一)HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎增多(二)HBV變異株增加HBV的突變率較高，

中國(guó)乙型肝炎流行現(xiàn)狀87HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎臨床特點(diǎn)：(1)轉(zhuǎn)為肝硬化和肝癌比例較大；(2)與年齡相關(guān)：患者年齡較大；(3)疾病自發(fā)或持續(xù)減輕極少發(fā)生；(4)何時(shí)停藥難以確定；(5)治療后復(fù)發(fā)率高。HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎臨床特點(diǎn)：88HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性乙肝與HBeAg陽(yáng)性乙肝不同點(diǎn)：(1)慢性肝炎病情不減輕；(2)生化學(xué)和病毒學(xué)標(biāo)志反復(fù)升高；(3)可30～40年無(wú)癥狀；(4)約45歲左右發(fā)生肝硬化；(5)10年后約25%發(fā)生并發(fā)癥。HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性乙肝與HBeAg陽(yáng)性乙89HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性的慢性乙肝流行率升高原因：(1)持續(xù)免疫壓力導(dǎo)致突變株選擇；(2)長(zhǎng)期治療導(dǎo)致病毒變異；(3)前C和C啟動(dòng)子變異；(4)檢測(cè)方法的靈敏度提高。

HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性的慢性乙肝流行率升高90HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎臨床診斷現(xiàn)狀：(1)傳統(tǒng)“兩對(duì)半”指標(biāo)不能反映此類(lèi)患者HBV復(fù)制程度；(2)缺乏指導(dǎo)合理治療的指標(biāo)；(3)HBVDNA檢測(cè)不易于各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛開(kāi)展；(4)臨床上急需能夠反映HBV復(fù)制程度及指導(dǎo)治療的指標(biāo)。

HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎臨床診斷現(xiàn)91抗病毒治療效果監(jiān)測(cè)臨床上用于抗病毒治療的藥物干擾素核苷類(lèi)似物抗病毒治療效果監(jiān)測(cè)臨床上用于抗病毒治療的藥物92抗病毒治療效果監(jiān)測(cè)臨床上缺乏評(píng)估抗病毒治療效果的指標(biāo)。以HBVDNA陰轉(zhuǎn)作為治療的終點(diǎn)不恰當(dāng)，此時(shí)停藥病情易反復(fù)。抗病毒治療效果監(jiān)測(cè)臨床上缺乏評(píng)估抗病毒治療效果的指標(biāo)。93乙肝病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的缺陷

抗病毒治療效果評(píng)價(jià)血清學(xué)指標(biāo)缺乏

臨床上評(píng)價(jià)抗乙肝病毒治療效果時(shí)存在一個(gè)很大的問(wèn)題，即其評(píng)價(jià)指標(biāo)主要是肝功能的改善與否、血清乙肝病毒DNA水平的變化以及肝組織的病理學(xué)改變等。誠(chéng)然，這些指標(biāo)對(duì)臨床醫(yī)生判斷患者病情而言非常重要和實(shí)用，也是臨床醫(yī)生選用抗乙肝病毒藥物時(shí)的依據(jù)，然而對(duì)于何時(shí)停用抗病毒藥物、停用抗病毒藥物后乙肝病毒是否會(huì)重新復(fù)制活躍導(dǎo)致乙肝復(fù)發(fā)則缺乏客觀而有效的指標(biāo)。

乙肝病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的缺陷抗病毒治療效果評(píng)價(jià)血清學(xué)指標(biāo)缺乏94乙型肝炎血清學(xué)診斷技術(shù)新突破

乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）前S區(qū)酶免定量試劑盒

-------直接定量檢測(cè)乙肝大蛋白-------不用分開(kāi)檢測(cè)前S1和前S2乙型肝炎血清學(xué)診斷技術(shù)新突破

乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）95HBV-LP診斷試劑新穎之處采用病毒樣顆粒制作針對(duì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)的高活性抗體同時(shí)檢測(cè)前S1和前S2進(jìn)行定量檢測(cè)，用于評(píng)估抗病毒治療效果和預(yù)后診斷HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎的唯一血清學(xué)指標(biāo)評(píng)估治療效果及判定治療終點(diǎn)唯一血清學(xué)指標(biāo)大蛋白完全消退意味患者預(yù)后良好HBV-LP診斷試劑新穎之處96乙肝病毒包膜蛋白研究進(jìn)展1995-2004年發(fā)現(xiàn)大蛋白前S區(qū)有復(fù)雜構(gòu)象結(jié)構(gòu)1996年發(fā)現(xiàn)大蛋白具有反式激活病毒復(fù)制的作用2002年發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肝細(xì)胞病變及凋亡的主要原因是大蛋白2004年實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建針對(duì)構(gòu)象型抗原的單克隆抗體2005年國(guó)內(nèi)公司成功研制乙肝表面抗原大蛋白酶聯(lián)免疫定量試劑盒乙肝病毒包膜蛋白研究進(jìn)展1995-2004年發(fā)現(xiàn)大蛋白前97HepatitisB——乙型肝炎HepatitisB——乙型肝炎98HBV模型HBV模型99HBV包膜蛋白HBV包膜蛋白100HBV的表面抗原的組成HBV的表面抗原的組成101HBV病毒結(jié)構(gòu)成分HBV病毒結(jié)構(gòu)成分102HBV-LP與病毒復(fù)制密切相關(guān)HBVDane管形球型血流中的分布L-HBs大蛋白存在存在不含僅病毒復(fù)制期存在M-HBs中蛋白存在存在1%含量非復(fù)制期少量存在S-HBs小蛋白存在存在存在存在根據(jù)檢測(cè)血液中大蛋白的有無(wú)，判斷病毒攜帶者體內(nèi)的HBV病毒是否在進(jìn)行復(fù)制。HBV-LP與病毒復(fù)制密切相關(guān)HBVDane管形球型103乙肝病毒包膜蛋白preS特性:暴露在病毒顆粒表面高免疫原性參與了病毒與細(xì)胞受體的相互作用誘導(dǎo)抗感染的保護(hù)性抗體的產(chǎn)生NeurathAR,KentSB,StrickN,ParkerK.Delineationofcontiguousdeterminantsessentialforbiologicalfunctionsofthepre-SsequenceofthehepatitisBvirusenvelopeprotein:itsantigenicity,immunogenicityandcell-receptorrecognition.AnnInstPasteurVirol.1988Jan-Mar;139(1):13-38.乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究乙肝病毒包膜蛋白preS特性:NeurathAR,K104PrangeR,StreeckRE.NoveltransmembranetopologyofthehepatitisBvirusenvelopeproteins.EMBOJ1995;14:247-256LambertC.etal.AssessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnavirallareenvelopeproteinsJ.GeneralVirology200485,1221-1225.乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究HBV病毒顆粒表面的PreS已經(jīng)被證實(shí)具有獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域和天然構(gòu)象很多研究致力于表達(dá)并觀測(cè)PreS的結(jié)構(gòu)，但是極少成功。其原因是單獨(dú)表達(dá)的PreS很容易被蛋白酶所降解。PrangeR,StreeckRE.Noveltr105(A)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上乙肝大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型。(B)病毒體包膜上的乙肝大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型。VolkerBruss,XuanyongLu1,ReinerThomssenandWolframH.Gerlich'.Post-translationalalterationsintransmembranetopologyofthehepatitisBviruslargeenvelopeprotein.TheEMBOJournalvol.13no.10pp.2273-2279,1994乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究(A)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上乙肝大蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型。乙肝病106HBVL包膜蛋白（大蛋白）的結(jié)構(gòu)域和穿膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

A.大蛋白的構(gòu)成組分，含preS1、preS2及S結(jié)構(gòu)

B.大蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)CarstenLambert,SylviaMannandReinhildPrange.Assessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnavirallargeenvelopeproteins.JournalofGeneralVirology(2004),85,1221–1225乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究HBVL包膜蛋白（大蛋白）的結(jié)構(gòu)域和穿膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Cars107

AA99－169形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這一序列橫跨前S1和前S2，是其主要免疫表位。乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究VolkerBrussEnvelopmentofthehepatitisBvirusnucleocapsidVirusResearch106(2004)199–20929September2004AA99－169AA99－169形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這一序108L蛋白i-pre-S形式的功能模式圖。黑點(diǎn)表示L蛋白pre-S結(jié)構(gòu)略去S和M蛋白分泌的病毒體表面的e-pre-S結(jié)構(gòu)很可能具有結(jié)合病毒受體的功能。目前的數(shù)據(jù)顯示L蛋白的i-pre-S結(jié)構(gòu)是一種蛋白矩陣，在病毒體的形成過(guò)程中負(fù)責(zé)與核殼體相接觸，包裝外膜。VOLKERBRUSS*ANDKERSTINVIELUF.FunctionsoftheInternalPre-SDomainoftheLargeSurfaceProteininHepatitisBVirusParticleMorphogenesis.JOURNALOFVIROLOGY,Nov.1995,p.6652–6657Vol.69,No.11L蛋白i-pre-S形式的功能模式圖。VOLKERBRUS109肝炎病毒物種特異性的感染取決于病毒進(jìn)入的水平，并由病毒L蛋白上的pre-S結(jié)構(gòu)決定。Arg103和Ser124之間的序列在不同的HBV之間是高度保守的。Arg103和Ser124之間的pre-S序列對(duì)于HBV的形成具有重要功能。ＡＡ１０３－１２４橫跨前Ｓ１和前Ｓ２之間乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究VOLKERBRUSS.AShortLinearSequenceinthePre-SDomainoftheLargeHepatitisBVirusEnvelopeProteinRequiredforVirionFormation.JOURNALOFVIROLOGY,Dec.1997,p.9350–9357Vol.71,No.12TAKASHIISHIKAWAANDDONGANEM.Thepre-SdomainofthelargeviralenvelopeproteindetermineshostrangeinavianhepatitisBviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.92,pp.6259-6263,July1995

肝炎病毒物種特異性的感染取決于病毒進(jìn)入的水平，并由病毒L蛋白110DeterminationoftheMinimalDistancebetweentheMatrixandTransmembraneDomainsoftheLargeHepatitisBVirusEnvelopeProteinJournalofVirology,June2005,p.7918-7921,Vol.79,No.120022-538XＡＡ１０３－１２４形成特殊的矩陣結(jié)構(gòu)跨膜區(qū)ＡＡ２５４－２７２，維持它們正常結(jié)構(gòu)的最短距離是２６個(gè)ＡＡ．乙肝病毒大蛋白和Pre-S區(qū)的研究DeterminationoftheMinimalD111

Pre-S的反式激活作用乙肝病毒大分子表面抗原（大蛋白）是一種轉(zhuǎn)錄活化因子

ThehepatitisBviruslargesurfaceprotein(LHBs)isatranscriptionalactivator.

Virology.1996Nov1;225(1):235-9.

Pre-S的反式激活作用乙肝病毒大分子表面抗原

T112BrunsM,MiskaS,ChassotS,WillH.EnhancementofhepatitisBVirusinfectionbynoninfectionssubviralparticles.JVirol,1998;76;1462-8.乙肝鴨模型證實(shí)由大蛋白組裝成的亞病毒顆粒能夠反式激活病毒繼續(xù)復(fù)制這個(gè)研究具有臨床意義,對(duì)于大蛋白陽(yáng)性而DNA陰性患者容易停藥反跳具有參考意義.亞病毒顆粒上pre-S的反式激活作用BrunsM,MiskaS,ChassotS,Will113原文：UltrastructuralAnalysisofHepatitisBVirusinHepG2-TransfectedCellsWithSpecialEmphasisonSubviralFilamentMorphogenesis作者：PHILIPPEROINGEARDANDCAMILLESUREAU作者單位：LaboratoiredeBiologieCellulaire,EPCNRS117,Faculte′deMe′decinedeTours,2bisBoulevardTonnelle′,F-37032ToursCedexFrance.發(fā)表刊物：HEPATOLOGYVol.28,No.4,1998

在乙肝病毒感染的HepG2細(xì)胞中對(duì)亞病毒纖維體的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行的超微結(jié)構(gòu)分析大蛋白與肝細(xì)胞病變研究原文：UltrastructuralAnaly114大蛋白的過(guò)量表達(dá),管狀顆粒在細(xì)胞內(nèi)堆積,導(dǎo)致體外培養(yǎng)的細(xì)胞5天內(nèi)死亡大蛋白的過(guò)量表達(dá),管狀顆粒在細(xì)胞內(nèi)堆積,導(dǎo)致體外培養(yǎng)的細(xì)胞5115Chisari等和Fernandes等已經(jīng)證實(shí)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中過(guò)量表達(dá)大的表面蛋白會(huì)使肝細(xì)胞凋亡并且產(chǎn)生慢性肝炎。然而，在他們模型中的這種損傷相對(duì)比較溫和，沒(méi)有小鼠死于肝功能衰竭.轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞帶有這種蛋白L的積累滯留，則會(huì)發(fā)展為細(xì)胞的損傷作用，它會(huì)誘導(dǎo)肝的再生，在這個(gè)模型中最終導(dǎo)致肝癌Chisari等和Fernandes等已經(jīng)證實(shí)，在轉(zhuǎn)基因小鼠116大蛋白導(dǎo)致肝細(xì)胞病變研究大蛋白是導(dǎo)致FCH中肝細(xì)胞損傷,纖維化的主要原因大蛋白導(dǎo)致肝細(xì)胞病變研究大蛋白是導(dǎo)致FCH中肝細(xì)胞損傷,纖維117FCH與肝細(xì)胞內(nèi)大蛋白過(guò)量表達(dá)蛋白L的滯留也被發(fā)現(xiàn)和一種獨(dú)特的綜合癥，即纖維淤膽性肝炎（FCH）相聯(lián)系，它的特征為肝細(xì)胞的空氣球化和有著顯著的膽汁阻塞，但是它一般只有很少的炎癥發(fā)生，它發(fā)生于免疫抑制的乙肝攜帶者。來(lái)自于發(fā)生了FCH的病人的肝臟樣品，通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中有著同樣的乙肝亞病毒包膜纖維體的積累。FCH與肝細(xì)胞內(nèi)大蛋白過(guò)量表達(dá)蛋白L的滯留也被發(fā)現(xiàn)和一種獨(dú)特1182002年國(guó)際肝病雜志2002年國(guó)際肝病雜志119實(shí)驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)的乙肝大表面蛋白致使培養(yǎng)的肝細(xì)胞在一些天內(nèi)死亡。乙肝大的表面蛋白會(huì)致使體外培養(yǎng)的細(xì)胞的液泡化和細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果和FCH下的肝臟病理情況相當(dāng)?shù)叵嗨疲瑢?shí)驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)的乙肝大表面蛋白致使培養(yǎng)的肝細(xì)胞在一些天內(nèi)死亡120國(guó)內(nèi)pre-S研究（部分）文獻(xiàn)一：EstablishmentandprelimineryuseofhepatitisBVirusPreS1/2antigenassay

WorldJourneryofGastroenterology99年軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院３所文獻(xiàn)二ＥxpressionandpurificationofthecompletepreSregionofhepatitisBVirusWorldJournalofGastroenterology2005年中科院上海生化和細(xì)胞所國(guó)內(nèi)pre-S研究（部分）文獻(xiàn)一：121抗原表位目前生物科學(xué)領(lǐng)域，對(duì)天然表位的研究借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)表位已經(jīng)有比較深刻的認(rèn)識(shí)。表位的構(gòu)成方式至少有兩種：①由某些氨基酸殘基按一定順序連續(xù)排列組成的線(xiàn)狀序列，稱(chēng)為順序（sequential）表位或線(xiàn)性(linear)表位。順序表位是蛋白分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，比較穩(wěn)定，不受蛋白質(zhì)加熱變性和空間構(gòu)形改變的影響。②由分子內(nèi)不連續(xù)的2～3個(gè)氨基酸殘基折疊排列所形成的三維結(jié)構(gòu)構(gòu)成，稱(chēng)為構(gòu)象(conformational)表位；有時(shí)候，呈α螺旋式排列的連續(xù)肽鏈序列也可起到構(gòu)象表位的作用?？乖砦荒壳吧锟茖W(xué)領(lǐng)域，對(duì)天然表位的研究借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的122多肽無(wú)法模擬構(gòu)象表位商品化的前S1定性檢測(cè)試劑上市，其單抗是用AA21-47化學(xué)合成的多肽而制作的。而應(yīng)用該多肽免疫制作的抗體在科研中就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，只能檢測(cè)到微弱的抗-pre-S1抗體的產(chǎn)生多肽無(wú)法模擬構(gòu)象表位123多肽無(wú)法模擬構(gòu)象表位Schodel等人曾以100ug的pre-S1(21-47)合成多肽免疫Balb/c小鼠，誘導(dǎo)生成的抗pre-s1抗體的滴度只有160，上海生化所改進(jìn)應(yīng)用pre-S1-BSA偶聯(lián)復(fù)合物免疫Balb/c小鼠，也只能檢測(cè)到微弱的抗Pre-S1的活力，

多肽無(wú)法模擬構(gòu)象表位Schodel等人曾以100ug的pre124

目前臨床使用乙肝前S1以及前S2試劑大部分研究主要集中在前S1區(qū)、前S2區(qū)。研究表明前S1區(qū)、前S2區(qū)蛋白及其抗體都與HBV-DNA、HBeAg、肝臟損害、乙肝的轉(zhuǎn)歸等都有極其密切的關(guān)系。臨床應(yīng)用：前S1試劑、前S2試劑診斷的結(jié)果與HBV-DNA、HBeAg三者之間有一定的關(guān)系，但符合率卻只有６0－８０%，甚至更低。目前臨床使用乙肝前S1以及前S2試劑大部分研究主125楊海林等完整病毒顆粒Dane顆粒標(biāo)志物PreS1蛋白藥盒的研制上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志1995vol.10:204-206楊海林等抗乙肝炎病毒表面抗原PreS1（20－47）多肽的制備、性質(zhì)和應(yīng)用。生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)1994vol26145-151使用針對(duì)化學(xué)合成多肽的單克隆抗體，無(wú)法定量監(jiān)測(cè)，無(wú)法用于療效觀察臨床應(yīng)用４－５年，靈敏度不理想，目前臨床使用乙肝前S1以及前S2試劑楊海林等完整病毒顆粒Dane顆粒標(biāo)志物PreS1蛋白藥盒的126乙肝大蛋白定量診斷試劑應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白晶體學(xué)的研究，研發(fā)出針對(duì)乙肝病毒前S區(qū)的構(gòu)象型單抗，大大提高了乙肝病毒感染者中前S區(qū)抗原即LP大蛋白的檢出率，臨床應(yīng)用表明大蛋白的檢出率與血液中病毒DNA的符合率高度符合（＞90%）。比原來(lái)的前S1試劑效果大大提高，可作為病毒復(fù)制的一個(gè)指標(biāo)。乙肝大蛋白定量診斷試劑應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白晶體學(xué)的研究，研發(fā)127乙肝大蛋白Ｐre-S抗原蛋白晶體結(jié)構(gòu)乙肝大蛋白Ｐre-S抗原蛋白晶體結(jié)構(gòu)128HBV-lp晶體結(jié)構(gòu)—空間模型HBV-lp晶體結(jié)構(gòu)—空間模型129針對(duì)大蛋白構(gòu)象表位單抗研制簡(jiǎn)要過(guò)程

（本方法是我們已經(jīng)申請(qǐng)的專(zhuān)利的一部分）獲得體外重組的PRE-S抗原獲得多抗，親和層析從強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本中獲得病毒樣顆粒病毒樣顆粒制作抗體針對(duì)大蛋白構(gòu)象表位單抗研制簡(jiǎn)要過(guò)程

（本方法是我們已經(jīng)申請(qǐng)130大蛋白試劑臨床研究1、HBVDNA陽(yáng)性標(biāo)本中HBV－LP的陽(yáng)性符合率考核單位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）例（次）數(shù)例（次）數(shù)比例（％）北京地壇醫(yī)院126825494.78北京地壇醫(yī)院2（治療系列）115214998.03解放軍傳染病研究所17013579.41遼寧沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院14313493.71浙江省湖州中心醫(yī)院（治療系列）213312896.24合計(jì)84878392.33注：1阿德福韋抗病毒治療患者43例，共檢出HBVDNA陽(yáng)性152次；2拉米夫定抗病毒治療患者51例，共檢出HBVDNA陽(yáng)性133次。大蛋白試劑臨床研究1、HBVDNA陽(yáng)性標(biāo)本中HBV－LP的1312、不同HBVDNA拷貝數(shù)中HBV－LP陽(yáng)性率以及OD值比較大蛋白試劑臨床研究組別HBVDNA大蛋白試劑結(jié)果HBVDNA拷貝數(shù)例數(shù)陽(yáng)性例數(shù)陽(yáng)性率（％）大蛋白OD1＜104(陰性)842321.380.266±0.0442104432967.440.416±0.0813105634673.020.504±0.2054106242187.500.898±0.1805107171694.121.275±0.31961082323100.001.428±0.238注：解放軍傳染病研究所，HBVDNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值與HBV－LPOD值的相關(guān)系數(shù)r=0.9452、不同HBVDNA拷貝數(shù)中HBV－LP陽(yáng)性率以及OD值比132大蛋白試劑臨床研究組別HBVDNA大蛋白試劑結(jié)果HBVDNA拷貝數(shù)例(次)數(shù)陽(yáng)性例(次)數(shù)陽(yáng)性率（％）陽(yáng)性含量均值（ng）1103544888.8917.602104383797.3724.693105585696.5530.444106656396.9255.465＞106808010086.61合計(jì)/29528195.25/注：北京地壇醫(yī)院與沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院匯總，其中北京地壇醫(yī)院為阿德福韋抗病毒治療患者標(biāo)本。HBVDNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值與HBV－LP含量（ng）的相關(guān)系數(shù)3、不同HBVDNA拷貝數(shù)中HBV－LP陽(yáng)性率以及含量比較r=0.935大蛋白試劑臨床研究組別HBVDNA大蛋白試劑結(jié)果HBVDN133大蛋白試劑臨床研究大蛋白試劑臨床研究1344、HBV－LP試劑與乙肝前S1試劑比較大蛋白試劑臨床研究考核單位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）乙肝前S1（＋）例數(shù)例數(shù)比例（％）例數(shù)比例（％）北京地壇醫(yī)院26825494.7817665.67解放軍傳染病研究所17013579.419757.06合計(jì)43838988.8127362.334、HBV－LP試劑與乙肝前S1試劑比較大蛋白試劑臨床研究考135大蛋白試劑臨床研究考核單位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）HBeAg（＋）北京地壇醫(yī)院沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院例數(shù)例數(shù)比例（％）例數(shù)比例（％）39136894.1217745.275、HBVDNA、HBeAg與HBV－LP三者在乙肝患者中的比較大蛋白試劑臨床研究考核單位HBVDNA（＋）HBV－L1365、HBVDNA、HBeAg與HBV－LP三者在乙肝患者中的比較大蛋白試劑臨床研究HBVDNA（＋）HBeAg(＋)HBeAg(—)合計(jì)177#214*391HBV－LP（＋）172（97.18%）196（91.59%）368（94.12%）注：#其中北京地壇醫(yī)院109份；沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院68份*其中北京地壇醫(yī)院159份；沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院55份5、HBVDNA、HBeAg與HBV－LP三者在乙肝患者中1376、不同HBV模式的患者中HBV