微生物菌種選育課件

第二章菌種選育

第二章菌種選育1本章主要內(nèi)容第一節(jié)菌種的分離篩選第二節(jié)菌種選育第三節(jié)

生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯本章主要內(nèi)容第一節(jié)菌種的分離篩選2第一節(jié)菌種的分離篩選

一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。第一節(jié)菌種的分離篩選一、菌種的來源3二、分離思路

新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合。二、分離思路新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的4定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離篩選：采用選擇性培養(yǎng)基利用分離技術(shù)得到純種目的菌。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。三、新種5（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。（一）采樣1、采樣對象6從自然界篩選從自然界篩選72、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。8采取土壤樣品要考慮的幾個問題土質(zhì)肥，微生物含量高，特別肥沃的土壤中細(xì)菌多，放線菌少；在植物殘體枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌。離地面5~20cm處的土壤通氣良好、不受陽光直射，含菌量最高。采土季節(jié)以春秋兩季最好。采土方法：選擇適當(dāng)?shù)攸c、鏟除表土、取土樣數(shù)十克，盛入事先準(zhǔn)備的無菌防水紙袋中，其上記錄采土?xí)r間、地點、植被情況等。多點采土、混合分離，可以代表每一地塊上的微生物分布平均情況采取土壤樣品要考慮的幾個問題土質(zhì)肥，微生物含量高，特別肥沃的9（二）增殖培養(yǎng)含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)如果原有樣品中目的菌含量低，可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì)，培養(yǎng)使之以較其它微生物更快的速度生長繁殖，從而提高它們在樣品中的比例，便于分離。富集培養(yǎng)的一般方法：采用有利于目的菌種而不利于無關(guān)微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件，以達到使目的菌種在群體中比例上升的目的。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。一些有特定物質(zhì)產(chǎn)生能力的菌種，不容易富集，只有通過大量艱苦的工作篩選取得。（二）增殖培養(yǎng)含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)10某些細(xì)菌的富集條件

富集對象 接種菌樣 添加營養(yǎng)物(g) 特殊培養(yǎng)條件好氧氨基酸氧化菌 土壤 – 好氧，pH7.0好氧性芽孢桿菌 土壤，巴氏消毒 – 好氧，pH7.0氨基酸發(fā)酵性梭菌 土壤，巴氏消毒 – 厭氧，pH7.0耐堿解尿素芽孢菌 土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6厭氧八疊球菌 土壤 葡萄糖20 厭氧，pH2~3乳酸菌 植物體或牛奶 葡萄糖20 厭氧，pH6.5腸道細(xì)菌 土壤或污水 葡萄糖20，CaCO320 好氧或厭氧，pH7.0丙酸菌 干酪 乳酸鈉20 厭氧，pH7.0醋酸菌 果實或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0注：培養(yǎng)基成分為酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，加水1000ml。一般培養(yǎng)在30℃下。某些細(xì)菌的富集條件富集對象 接種菌樣 添加營養(yǎng)物(11（三）培養(yǎng)分離

盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。（三）培養(yǎng)分離盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生12稀釋分離法稀釋倒平板法平板涂布法注意：必須要做多個濃度的稀釋分離平板。稀釋分離法稀釋倒平板注意：必須要做多個濃度的稀釋分離平板13劃線分離法——平板劃線法劃線分離法——平板劃線法14（四）篩選1、初篩：從分離得到的大量微生物中，將目標(biāo)微生物篩選出來的過程。常用的初選方法：水解酶產(chǎn)生菌的篩選：將酶的作用底物加在培養(yǎng)基中，接種后適溫培養(yǎng)，根據(jù)菌苔周圍是否產(chǎn)生水解圈篩選出水解酶產(chǎn)生菌。一般采用平板篩選。拮抗菌的篩選—對峙培養(yǎng)：將病原指示菌與待測菌株相對接種在平板上適溫培養(yǎng)，根據(jù)病原菌的生長情況篩選出拮抗性菌株。分初篩、復(fù)篩。（四）篩選1、初篩：從分離得到的大量微生物中，將目標(biāo)15第二章微生物菌種選育課件162）搖瓶發(fā)酵篩選：將待測菌株進行液體振蕩培養(yǎng)，取發(fā)酵濾液進行活力測定。2）搖瓶發(fā)酵篩選：將待測菌株進行液體振蕩培養(yǎng)，取172、復(fù)篩：在初篩的基礎(chǔ)上，進一步鑒定有希望菌株的生產(chǎn)能力強弱的過程。復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)后，發(fā)酵液采用精確的分析方法進行測定。復(fù)篩過程中，要結(jié)合培養(yǎng)條件進行。培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)基pH值發(fā)酵溫度供氧量等。2、復(fù)篩：在初篩的基礎(chǔ)上，進一步鑒定有希望菌株的復(fù)篩采用搖18（五）菌種鑒定

經(jīng)典分類鑒定方法：形態(tài)特征、生理生化特征、血清學(xué)試驗等?，F(xiàn)代分類鑒定方法：遺傳特性、細(xì)胞化學(xué)組分、計算機數(shù)值分析。（五）菌種鑒定

經(jīng)典分類鑒定方法：形態(tài)特征、生理生化特征、19（五）毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。（五）毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒20

第二節(jié)菌種選育

菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)，其理論基礎(chǔ)是微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)等，而其研究目的是微生物產(chǎn)品的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和發(fā)展新品種為生產(chǎn)不斷地提供優(yōu)良菌種，從而促進生產(chǎn)發(fā)展。目前菌種選育常采用自然選育和誘變育種等方法，帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典育種的范疇。隨著微生物學(xué)、生化遺傳學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程等較為定向的育種方法。

第二節(jié)菌種選育

菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)，其理論基礎(chǔ)212.1自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變而進行菌種篩選的過程叫做自然選育。所謂自然突變就是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變。一般認(rèn)為引起自然突變有兩個原因：即多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。菌種的自然突變往往有兩種可能性:菌種衰退,生產(chǎn)性能下降;代謝更加旺盛,生產(chǎn)性能提高。2.1自然選育22所謂多因素低劑量的誘變效應(yīng)，是指自然突變實質(zhì)上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)。所謂多因素低劑量的誘變效應(yīng)，是指自然突變實質(zhì)上是由一些原因不23所謂互變異構(gòu)效應(yīng)是指四種堿基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鳥嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亞氨基式出現(xiàn)。平衡一般傾向于酮式和氨基式。堿基對發(fā)生自然突變的機率約為10－8一10－9。所謂互變異構(gòu)效應(yīng)是指四種堿基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶24PurinespyrimidinesAdenine(A)Guanine(G)Cytosine(C)Thymine(T)N9N1PurinespyrimidinesAdenine(A)G252.2誘變育種2.2.l誘變育種的基本原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。突變主要包括染色體畸變和基因突變二大類。

（1）染色體畸變是指染色體或DNA片斷的缺失、易位、逆位、重復(fù)等。（2）基因突變是指DNA分子結(jié)構(gòu)中的某一部位發(fā)生變化（又稱點突變）。2.2誘變育種26根據(jù)突變發(fā)生的原因又可分為自然突變和誘發(fā)突變。

誘發(fā)突變是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。誘變因素的種類很多，有物理的、化學(xué)的和生物的三大類，見表2－1。經(jīng)誘變處理后，微生物的遺傳物質(zhì)、DNA和RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起微生物的遺傳變異。第二章微生物菌種選育課件272.2.2誘變育種的一般步驟

1、出發(fā)菌株的選擇自然界直接分離到的野生型菌株經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株2.2.2誘變育種的一般步驟

1、出發(fā)菌株的選擇282、制備菌懸液待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和環(huán)境條件；盡可能選擇孢子或單倍體細(xì)胞作為誘變對象，避免表型延遲。表型延遲就是指某一突變在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在細(xì)胞表型上顯示出來，造成不純的菌落。3、誘變處理根據(jù)誘變劑用量對菌體致死率的曲線選擇合適的處理劑量。一般突變率隨誘變劑量的增大而增高，但達到一定劑量后，突變率會下降。2、制備菌懸液294、突變菌株的篩選（1）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選生物合成途徑的某一步發(fā)生了酶缺陷，合成反應(yīng)不能完成，末端產(chǎn)物不能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。（2）抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變菌株的篩選調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不能再和終產(chǎn)物結(jié)合或結(jié)合后不能作用于已突變的操縱基因，因此不再起反饋阻遏作用；編碼酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使變構(gòu)酶不再具有結(jié)合終產(chǎn)物的能力但仍具有催化活性，從而解除了反饋抑制?？狗答佂蛔冎暌话阃ㄟ^抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法篩選。營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株中也可獲得抗反饋突變株。4、突變菌株的篩選30（3）組成型突變株的篩選分批限量加入誘導(dǎo)物法，解除菌株對誘導(dǎo)物的依賴交替培養(yǎng)法（4）抗性突變株的篩選抗生素抗性突變抗噬菌體菌株的選育條件抗性突變敏感突變（3）組成型突變株的篩選312.2.3誘變育種工作中幾個應(yīng)注意的問題A選擇好出發(fā)菌株選好出發(fā)菌株對誘變效果有著極其重要的作用。有些微生物比較穩(wěn)定，其遺傳物質(zhì)耐誘變劑的作用強。如果用這種菌株于生產(chǎn)是很有益的，而用作出發(fā)菌株則不適宜。用作誘變的出發(fā)菌株必須對它的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面有相當(dāng)了解。挑選出發(fā)菌株的標(biāo)準(zhǔn)是產(chǎn)量高、對誘變劑的敏感性大、變異幅度廣，再確定誘變劑的使用及篩選條件。2.2.3誘變育種工作中幾個應(yīng)注意的問題32B復(fù)合誘變因素的使用在微生物誘變育種中，可利用各種物理、化學(xué)誘變因素來處理菌種。對野生型菌株單誘變因素有時也能取得好的效果，但對老菌種單一誘變因素重復(fù)使用突變的效果不高，這時可利用復(fù)合因素來擴大誘變幅度，提高誘變效果。B復(fù)合誘變因素的使用33C劑量選擇各種誘變因素有它們各自的誘變劑量單位，如紫外線劑量單位用焦耳，x一射線劑量單位是庫（侖）每千克，中子劑量單位是戈。

化學(xué)誘變因素一般是以溶液濃度來計算劑量單位的。對不同微生物使用的劑量是不同的，致死率取決于誘變劑量，而致死率和變異率之間有一定關(guān)系。因此可以用致死率作為選擇適宜劑量的依據(jù)。C劑量選擇34D變異菌株的篩選誘變育種工作的一個主要任務(wù)是獲得高產(chǎn)變異菌株。從經(jīng)誘變的大量個體中挑選優(yōu)良菌種不是一件容易的事。因為不同的菌種表現(xiàn)的變異形式是不同的，從一個菌種的變異規(guī)律去發(fā)現(xiàn)那些與產(chǎn)量有關(guān)的特性，并根據(jù)這些特性，分門別類地挑選一定數(shù)最的典型菌株進行發(fā)酵和鑒定，以確定各種類型與產(chǎn)量之間的關(guān)系。這樣，可大大提高篩選的工作效率。D變異菌株的篩選35E高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合

在誘變育種過程中高產(chǎn)菌株的獲得還必須有合適的篩選條件的配合。

誘變與篩選可以說是一個問題的兩個方面，必須用辯證的觀點來看待。總之，在誘變育種過程中要正確處理出發(fā)菌株，誘變因素和篩選條件三者的關(guān)系。E高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合362.2.4幾種常見的物理、化學(xué)誘變劑的使用方法1）物理誘變劑：紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；電離輻射特點：導(dǎo)致DNA斷裂缺失，造成不可回復(fù)的缺失突變。誘變效率高，但它可能影響鄰近基因的性能。紫外線是常用的誘變劑。2）化學(xué)誘變劑：堿基類似物（5-BU）、脫氨劑（羥胺、亞硝酸）、嵌入劑（吖啶類）等。特點：

堿基類似物：取代相應(yīng)堿基進入DNA鏈，具有很高的特異性，但回復(fù)突變率高，很少使用。

脫氨劑：堿基脫氨或脫氮，引起堿基對轉(zhuǎn)換，造成的遺傳損傷較多。應(yīng)用的范圍較廣，

嵌入劑：引起移碼突變?？梢栽斐缮x途徑完全中斷。2.2.4幾種常見的物理、化學(xué)誘變劑的使用方法1）物理誘37

5BU

酮式T

烯醇式CA：TBU(酮)：AT：AA：TG):BU(烯BU(酮)：AC：GA：TC：G5BU酮式T烯醇式CABUTAG)BUCAC38T：ＸT：AX：ＣＣ：UＣ：ＧAHNO2XG：CA：TT：ATTXＣＣAHNO2XGAT392.3雜交育種

發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種的選育主要采用誘變育種方法。但是，一個菌種長期使用誘變劑處理之后，其生活能力一般要逐漸下降，例如生長周期延長，孢子量減少，代謝減慢，產(chǎn)量增加緩慢，誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，有必要利用雜交育種方法。

雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)吻合（或接合）使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。2.3雜交育種401、雜交育種的目的在于：

1）通過雜交使不同菌株的遺傳物質(zhì)進行交換和重新組合，從而改變原有菌株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得雜種菌株（重組體）；2）可以通過雜交把不同菌株的優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中，克服長期用誘變劑處理造成的菌株生活力下降等缺陷；3）通過雜交，可以擴大變異范圍，改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)新的品種；

4）分析雜交結(jié)果，可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，促進遺傳學(xué)理論的發(fā)展。1、雜交育種的目的在于：41微生物雜交育種所使用的配對菌株稱為直接親本。由于多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世代，因此，直接親本菌株應(yīng)帶有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記。常用的遺傳標(biāo)記有顏色、營養(yǎng)要求和抗藥性等。

營養(yǎng)標(biāo)記菌株（即營養(yǎng)缺陷型菌株）是最常用的遺傳標(biāo)記之一。所謂營養(yǎng)缺陷型菌株是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生化突變體。由于基因突變，它失去了合成某種物質(zhì)（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基本培養(yǎng)基上不能生長，大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加一定種類的有機物質(zhì)后才能生長。2、遺傳標(biāo)記微生物雜交育種所使用的配對菌株稱為直接親本。由于422.4原生質(zhì)體融合技術(shù)所謂原生質(zhì)體融合就是把兩個親本的細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以瓦解，使菌體細(xì)胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹著的球狀體（稱原生質(zhì)體）。兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實現(xiàn)遺傳重組。在再生成細(xì)胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。2.4原生質(zhì)體融合技術(shù)432.4.1原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性從現(xiàn)有資料看，原生質(zhì)體融合技術(shù)有以下優(yōu)點（l）去除了細(xì)胞壁的障礙，親株基因組直接融合、交換，實現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng)。即使是相同接合型的真菌細(xì)胞也能發(fā)生原生質(zhì)體的相互融合，并可對原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染。

（2）原生質(zhì)體融合后兩親株的基因組之間有機會發(fā)生多次交換，產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的重組子。

參與融合的親株數(shù)并不限于一個，可以多至三個、四個，這足一般常規(guī)雜交所達不到的。（3）重組頻率特別高，因為有聚乙二醇作助融劑。2.4.1原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性44（4）可以和其他育種方法相結(jié)合，把由其它方法得到的優(yōu)良性狀通過原生質(zhì)體融合再組合到一個單株中。（5）可以用溫度、藥物、紫外線等處理、鈍化親株的一方或雙方，然后使之融合，再在再生菌落中篩選重組子。這樣往往可以提高篩選效率。由于以上優(yōu)點，利用原生質(zhì)體融合來培育工業(yè)新菌株已受到國內(nèi)外普遍重視。

（4）可以和其他育種方法相結(jié)合，把由其它方法得到的優(yōu)良性狀通452.4.2原生質(zhì)體融合技術(shù)一般步驟1、選擇親株選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株；親株帶上遺傳標(biāo)記；測定遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性。2、原生質(zhì)體制備一般采用酶解法除壁。根據(jù)微生物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)的不同，采用不同的酶，有時還要采取一些措施，如添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高細(xì)胞壁對酶解的敏感性；原生質(zhì)體對滲透壓極其敏感，低滲易引起細(xì)胞破裂。一般將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中維持它的穩(wěn)定。2.4.2原生質(zhì)體融合技術(shù)一般步驟1、選擇親株463、原生質(zhì)體融合兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實現(xiàn)遺傳重組。在再生細(xì)胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。4、原生質(zhì)體再生

原生質(zhì)體再生就是使原生質(zhì)體重新長出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；為獲得較高的再生率，在實驗過程中應(yīng)避免剪切力過大使原生質(zhì)體破裂；涂布時，原生質(zhì)體濃度不宜過高；菌齡、再生時的溫度、溶菌酶用量和溶壁時間等因素都會影響原生質(zhì)體的再生。3、原生質(zhì)體融合475、篩選優(yōu)良性狀融合重組子原生質(zhì)體融合后，來自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成的子代稱為融合重組子。融合重組子的檢出方法：直接法將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子。間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。篩選出來的融合重組子還需要對它們進行生理生化及生產(chǎn)性能的測定。5、篩選優(yōu)良性狀融合重組子48第三節(jié)生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第三節(jié)生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管49作為種子的準(zhǔn)則菌種細(xì)胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；生理性狀穩(wěn)定；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染；保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平作為種子的準(zhǔn)則503.1種子的制備過程種子制備的過程大致可分為：實驗室種子制備階段生產(chǎn)車間種子制備階段

3.1種子的制備過程種子制備的過程大致可分為：51一、實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基或斜面（靜置培養(yǎng)）培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法(通過搖瓶培養(yǎng)提供比較好的溶氧）。一、實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式52（一）孢子的制備1、細(xì)菌孢子的制備細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37?C。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時間一般為1~2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要5~10天。（一）孢子的制備1、細(xì)菌孢子的制備532、霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25~28?C。培養(yǎng)時間一般為4~14天。2、霉菌孢子的制備543、放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28?C。培養(yǎng)時間為5~14天。3、放線菌孢子的制備55（二）液體種子制備1、好氧培養(yǎng)：對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體（短菌絲），作為種子。試管→三角瓶→搖床→種子罐（二）液體種子制備1、好氧培養(yǎng)：562、厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）試管→三角瓶→卡式罐→種子罐2、厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）57二、生產(chǎn)車間種子制備實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。二、生產(chǎn)車間種子制備實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐581、種子罐的作用主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。1、種子罐的作用592、種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)。種子罐級數(shù)取決于：菌種生長特性（如菌種傳代后的穩(wěn)定性）、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；所采用發(fā)酵罐的容積另外還與發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量（種子液體積/培養(yǎng)液體積）以及種子罐與發(fā)酵罐的容積比等有關(guān)。2、種子罐級數(shù)的確定60細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐（27?C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級種子罐（27?C,10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子（二級發(fā)酵）。細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。61確定種子罐級數(shù)需注意的問題種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。

確定種子罐級數(shù)需注意的問題623.2種子質(zhì)量的控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間和冷藏時間3.2種子質(zhì)量的控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制631、培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。原材料質(zhì)量的波動，起它要作用的是其中無機離子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。1、培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因64水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，65措施培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時間供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機氮源措施662、培養(yǎng)條件（1）溫度溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37?C培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。2、培養(yǎng)條件（1）溫度67（2）濕度制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。從表中看出相對濕度在40%~45%時孢子數(shù)量最多，且孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。（2）濕度683、培養(yǎng)時間和冷藏時間（1）培養(yǎng)時間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。措施：孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。3、培養(yǎng)時間和冷藏時間（1）培養(yǎng)時間69（2）冷藏時間斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4?C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6?C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。（2）冷藏時間704、接種量接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進而影響菌體的生理狀況。4、接種量71二、影響種子質(zhì)量的因素及控制孢子的質(zhì)量培養(yǎng)基培養(yǎng)條件種齡接種量二、影響種子質(zhì)量的因素及控制孢子的質(zhì)量721、培養(yǎng)基營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基；營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。1、培養(yǎng)基732、培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量（3）pH

2、培養(yǎng)條件743、種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。Ru嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好。3、種齡754、接種量接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。通常接種量，細(xì)菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有時20~25%4、接種量76三、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。菌種穩(wěn)定性的檢查無雜菌檢查三、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所77四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1、形態(tài)單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1、形態(tài)782、生化指標(biāo)種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。2、生化指標(biāo)793、產(chǎn)物生成量在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。3、產(chǎn)物生成量804、酶活力種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。4、酶活力81五、種子異常分析菌種生長速度，過快或過慢菌絲結(jié)團菌絲粘壁五、種子異常分析菌種生長速度，過快或過慢82第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種保藏的意義菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種保藏的意義83二、菌種保藏的原理菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟，以便生產(chǎn)上能推廣使用。二、菌種保藏的原理84

菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：A斜面冰箱保藏法（酵母）斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法，用新鮮斜面接種后，置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長豐滿后，放在4℃冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月。B石蠟油封存法（酵母）向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蠟油作碳源的細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期約一年左右。三、菌種保藏的方法菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：三、菌種保藏的方85C沙土管保藏法（細(xì)菌，霉菌，防線菌）

這是國內(nèi)常采用的一種方法。適合于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物。它的制備方法是：

首先，將沙與土洗凈烘干過篩后，按沙與土的比例為l－2∶l混合均勻，分裝于小試管中，裝料高度約為1厘米左右，121°C間歇滅菌三次，滅菌試驗合格后烘干備用。一般沙用80目過篩，土用30－100目過篩。其次，將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或?qū)⑿泵骀咦庸蜗轮苯优c沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱內(nèi)保存。一般保存期為1年左右。

C沙土管保藏法（細(xì)菌，霉菌，防線菌）86D真空冷凍干燥保藏法（細(xì)菌，防線菌）

真空冷凍干燥保藏法是目前常用的較理想的一種方法。其基本原理是在較低的溫度下（－15℃），快速她將細(xì)胞凍結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。在這樣的環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發(fā)生變異。因此，菌種可以保存很長時間，一般5年左右。這種保藏方法雖然需要一定的設(shè)備，要求亦比較嚴(yán)格，但由于該方法保藏效果好，對各種微生物都適用。所以，國內(nèi)外都已較普遍地應(yīng)用。這種方法的基本操作過程是先將微生物制成懸浮液，再與保護劑混合，然后放在特制的安瓶管內(nèi)，用低溫酒精或干冰，使其迅速凍結(jié)，在低溫下用真空泵抽干，最后將安瓿管真空熔封，并低溫保藏。保護劑一般采用脫脂牛奶或血清。保護劑的作用可能是在冷凍干燥的脫水過程中代替結(jié)合水而穩(wěn)定細(xì)胞成分（細(xì)胞膜）的構(gòu)型，防此細(xì)胞膜因為凍結(jié)而破壞。保護劑還可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。D真空冷凍干燥保藏法（細(xì)菌，防線菌）真空冷凍干燥保藏法是87E液氮超低溫保藏法（細(xì)菌，真菌）

液氮超低溫保臧法足近幾年才發(fā)展起來的，此法國外已較普遍采用，是適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。其保存期最長。a原理用液氮能長期保存菌種。這是因為液氮的溫度可達一196℃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其新陳代謝作用停止的溫度（一130℃），所以此時菌種的代謝活動已停止，化學(xué)作用亦隨之消失。E液氮超低溫保藏法（細(xì)菌，真菌）88b操作方法及步驟（1）安瓿管要求由于液氮保存于超低溫狀態(tài)，所使用的安瓿管需能承受大的溫差而不致于破裂，一般用95料或GCl7的玻璃管，安瓿管選好后印上標(biāo)記，加棉塞后滅菌，烘干后備用。（2）菌種準(zhǔn)備及分裝

因為液氮法菌種要經(jīng)受超低溫的冷凍過程。所以也需要保護劑，常用的保護劑為10％甘油。用保護劑制備好菌液后，加入準(zhǔn)備好的安瓶管中，一般安瓿管的裝量為0.2－1mL。b操作方法及步驟89（3）凍結(jié)液氮法的關(guān)鍵是先把微生物從常溫過渡到低溫。這樣在細(xì)胞接觸低溫前，使細(xì)胞內(nèi)自由水通過膜滲出而不使其遇冷形成冰晶而傷害細(xì)胞。美國ATCC采用先將菌液降溫到0℃，再以每分鐘降低1℃的速度，一直降低到－38℃，然后才把裝有菌液的安瓿管放入液氮罐的氣相中。由于液氮要蒸發(fā)，這樣溫度就會上升，冰晶狀態(tài)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致菌種死亡。所以要常常注意液氮的殘存量，定期補加。（4）重新培養(yǎng)當(dāng)要使用或檢查所保存的菌種時，可將安瓿管從冰箱中取出，室溫或35－40℃水浴中迅速解凍，當(dāng)升溫至0℃時即可打開安瓿管，將菌種移到適宜的培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)。我國國內(nèi)目前已有部分單位采用液氮法保存菌種。（3）凍結(jié)液氮法的關(guān)鍵是先把微生物從常溫過渡到低溫。這樣在90四、菌種的衰退與復(fù)壯1、菌種衰退

菌種經(jīng)過長期人工培養(yǎng)或保藏，由于自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象。四、菌種的衰退與復(fù)壯1、菌種衰退91菌種退化的原因

基因突變；變異菌株性狀分離；誘變的單菌落是由—個以上孢子或細(xì)胞形成菌落由—個孢子或單個細(xì)胞形成，但它是多核細(xì)胞單核孢子發(fā)生突變時，雙鏈DNA上僅—條鏈上某個位點發(fā)生變化菌種退化的原因92連續(xù)傳代其它因素菌種保藏不當(dāng)生長條件不滿足（培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件）連續(xù)傳代93防止菌種退化的措施控制傳代次數(shù)選擇合適的培養(yǎng)條件選擇合適的保藏方法菌種穩(wěn)定性檢查分離復(fù)壯防止菌種退化的措施942、菌種復(fù)壯使衰退的菌種重新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性。復(fù)壯措施：對已衰退菌種配合一定培養(yǎng)條件進行單細(xì)胞分離純化淘汰衰退的個體選擇合適的培養(yǎng)基2、菌種復(fù)壯95思考題1、名詞解釋多因素低劑量的誘變效應(yīng)、互變異構(gòu)效應(yīng)、染色體畸變、基因突變、表型延遲、營養(yǎng)缺陷型、雜交育種、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生、菌種的擴培、接種量、菌種退化、菌種復(fù)壯2、采集土壤微生物樣品時應(yīng)該注意哪些問題？3、什么是增殖培養(yǎng)？為什么要進行增殖培養(yǎng)？4、土壤中分離純化微生物的方法有哪些？請簡述之。5、什么是微生物的初篩？請例舉兩種初篩方法，并簡述之。6、菌種保藏的原理是什么？常見的軍種保藏方法有哪些？7、菌種退化的原因有哪些？簡述防止菌種退化的措施。8、常見的菌種復(fù)壯措施有哪些？思考題1、名詞解釋96第二章菌種選育

第二章菌種選育97本章主要內(nèi)容第一節(jié)菌種的分離篩選第二節(jié)菌種選育第三節(jié)

生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯本章主要內(nèi)容第一節(jié)菌種的分離篩選98第一節(jié)菌種的分離篩選

一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。第一節(jié)菌種的分離篩選一、菌種的來源99二、分離思路

新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合。二、分離思路新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的100定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離篩選：采用選擇性培養(yǎng)基利用分離技術(shù)得到純種目的菌。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。三、新種101（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。（一）采樣1、采樣對象102從自然界篩選從自然界篩選1032、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。104采取土壤樣品要考慮的幾個問題土質(zhì)肥，微生物含量高，特別肥沃的土壤中細(xì)菌多，放線菌少；在植物殘體枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌。離地面5~20cm處的土壤通氣良好、不受陽光直射，含菌量最高。采土季節(jié)以春秋兩季最好。采土方法：選擇適當(dāng)?shù)攸c、鏟除表土、取土樣數(shù)十克，盛入事先準(zhǔn)備的無菌防水紙袋中，其上記錄采土?xí)r間、地點、植被情況等。多點采土、混合分離，可以代表每一地塊上的微生物分布平均情況采取土壤樣品要考慮的幾個問題土質(zhì)肥，微生物含量高，特別肥沃的105（二）增殖培養(yǎng)含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)如果原有樣品中目的菌含量低，可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì)，培養(yǎng)使之以較其它微生物更快的速度生長繁殖，從而提高它們在樣品中的比例，便于分離。富集培養(yǎng)的一般方法：采用有利于目的菌種而不利于無關(guān)微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件，以達到使目的菌種在群體中比例上升的目的。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。一些有特定物質(zhì)產(chǎn)生能力的菌種，不容易富集，只有通過大量艱苦的工作篩選取得。（二）增殖培養(yǎng)含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)106某些細(xì)菌的富集條件

富集對象 接種菌樣 添加營養(yǎng)物(g) 特殊培養(yǎng)條件好氧氨基酸氧化菌 土壤 – 好氧，pH7.0好氧性芽孢桿菌 土壤，巴氏消毒 – 好氧，pH7.0氨基酸發(fā)酵性梭菌 土壤，巴氏消毒 – 厭氧，pH7.0耐堿解尿素芽孢菌 土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6厭氧八疊球菌 土壤 葡萄糖20 厭氧，pH2~3乳酸菌 植物體或牛奶 葡萄糖20 厭氧，pH6.5腸道細(xì)菌 土壤或污水 葡萄糖20，CaCO320 好氧或厭氧，pH7.0丙酸菌 干酪 乳酸鈉20 厭氧，pH7.0醋酸菌 果實或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0注：培養(yǎng)基成分為酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，加水1000ml。一般培養(yǎng)在30℃下。某些細(xì)菌的富集條件富集對象 接種菌樣 添加營養(yǎng)物(107（三）培養(yǎng)分離

盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。（三）培養(yǎng)分離盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生108稀釋分離法稀釋倒平板法平板涂布法注意：必須要做多個濃度的稀釋分離平板。稀釋分離法稀釋倒平板注意：必須要做多個濃度的稀釋分離平板109劃線分離法——平板劃線法劃線分離法——平板劃線法110（四）篩選1、初篩：從分離得到的大量微生物中，將目標(biāo)微生物篩選出來的過程。常用的初選方法：水解酶產(chǎn)生菌的篩選：將酶的作用底物加在培養(yǎng)基中，接種后適溫培養(yǎng)，根據(jù)菌苔周圍是否產(chǎn)生水解圈篩選出水解酶產(chǎn)生菌。一般采用平板篩選。拮抗菌的篩選—對峙培養(yǎng)：將病原指示菌與待測菌株相對接種在平板上適溫培養(yǎng)，根據(jù)病原菌的生長情況篩選出拮抗性菌株。分初篩、復(fù)篩。（四）篩選1、初篩：從分離得到的大量微生物中，將目標(biāo)111第二章微生物菌種選育課件1122）搖瓶發(fā)酵篩選：將待測菌株進行液體振蕩培養(yǎng)，取發(fā)酵濾液進行活力測定。2）搖瓶發(fā)酵篩選：將待測菌株進行液體振蕩培養(yǎng)，取1132、復(fù)篩：在初篩的基礎(chǔ)上，進一步鑒定有希望菌株的生產(chǎn)能力強弱的過程。復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)后，發(fā)酵液采用精確的分析方法進行測定。復(fù)篩過程中，要結(jié)合培養(yǎng)條件進行。培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)基pH值發(fā)酵溫度供氧量等。2、復(fù)篩：在初篩的基礎(chǔ)上，進一步鑒定有希望菌株的復(fù)篩采用搖114（五）菌種鑒定

經(jīng)典分類鑒定方法：形態(tài)特征、生理生化特征、血清學(xué)試驗等?，F(xiàn)代分類鑒定方法：遺傳特性、細(xì)胞化學(xué)組分、計算機數(shù)值分析。（五）菌種鑒定

經(jīng)典分類鑒定方法：形態(tài)特征、生理生化特征、115（五）毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。（五）毒性試驗自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒116

第二節(jié)菌種選育

菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)，其理論基礎(chǔ)是微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)等，而其研究目的是微生物產(chǎn)品的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和發(fā)展新品種為生產(chǎn)不斷地提供優(yōu)良菌種，從而促進生產(chǎn)發(fā)展。目前菌種選育常采用自然選育和誘變育種等方法，帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典育種的范疇。隨著微生物學(xué)、生化遺傳學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程等較為定向的育種方法。

第二節(jié)菌種選育

菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)，其理論基礎(chǔ)1172.1自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變而進行菌種篩選的過程叫做自然選育。所謂自然突變就是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變。一般認(rèn)為引起自然突變有兩個原因：即多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。菌種的自然突變往往有兩種可能性:菌種衰退,生產(chǎn)性能下降;代謝更加旺盛,生產(chǎn)性能提高。2.1自然選育118所謂多因素低劑量的誘變效應(yīng)，是指自然突變實質(zhì)上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)。所謂多因素低劑量的誘變效應(yīng)，是指自然突變實質(zhì)上是由一些原因不119所謂互變異構(gòu)效應(yīng)是指四種堿基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鳥嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亞氨基式出現(xiàn)。平衡一般傾向于酮式和氨基式。堿基對發(fā)生自然突變的機率約為10－8一10－9。所謂互變異構(gòu)效應(yīng)是指四種堿基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶120PurinespyrimidinesAdenine(A)Guanine(G)Cytosine(C)Thymine(T)N9N1PurinespyrimidinesAdenine(A)G1212.2誘變育種2.2.l誘變育種的基本原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。突變主要包括染色體畸變和基因突變二大類。

（1）染色體畸變是指染色體或DNA片斷的缺失、易位、逆位、重復(fù)等。（2）基因突變是指DNA分子結(jié)構(gòu)中的某一部位發(fā)生變化（又稱點突變）。2.2誘變育種122根據(jù)突變發(fā)生的原因又可分為自然突變和誘發(fā)突變。

誘發(fā)突變是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。誘變因素的種類很多，有物理的、化學(xué)的和生物的三大類，見表2－1。經(jīng)誘變處理后，微生物的遺傳物質(zhì)、DNA和RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起微生物的遺傳變異。第二章微生物菌種選育課件1232.2.2誘變育種的一般步驟

1、出發(fā)菌株的選擇自然界直接分離到的野生型菌株經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株2.2.2誘變育種的一般步驟

1、出發(fā)菌株的選擇1242、制備菌懸液待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和環(huán)境條件；盡可能選擇孢子或單倍體細(xì)胞作為誘變對象，避免表型延遲。表型延遲就是指某一突變在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在細(xì)胞表型上顯示出來，造成不純的菌落。3、誘變處理根據(jù)誘變劑用量對菌體致死率的曲線選擇合適的處理劑量。一般突變率隨誘變劑量的增大而增高，但達到一定劑量后，突變率會下降。2、制備菌懸液1254、突變菌株的篩選（1）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選生物合成途徑的某一步發(fā)生了酶缺陷，合成反應(yīng)不能完成，末端產(chǎn)物不能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。（2）抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變菌株的篩選調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不能再和終產(chǎn)物結(jié)合或結(jié)合后不能作用于已突變的操縱基因，因此不再起反饋阻遏作用；編碼酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使變構(gòu)酶不再具有結(jié)合終產(chǎn)物的能力但仍具有催化活性，從而解除了反饋抑制?？狗答佂蛔冎暌话阃ㄟ^抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法篩選。營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株中也可獲得抗反饋突變株。4、突變菌株的篩選126（3）組成型突變株的篩選分批限量加入誘導(dǎo)物法，解除菌株對誘導(dǎo)物的依賴交替培養(yǎng)法（4）抗性突變株的篩選抗生素抗性突變抗噬菌體菌株的選育條件抗性突變敏感突變（3）組成型突變株的篩選1272.2.3誘變育種工作中幾個應(yīng)注意的問題A選擇好出發(fā)菌株選好出發(fā)菌株對誘變效果有著極其重要的作用。有些微生物比較穩(wěn)定，其遺傳物質(zhì)耐誘變劑的作用強。如果用這種菌株于生產(chǎn)是很有益的，而用作出發(fā)菌株則不適宜。用作誘變的出發(fā)菌株必須對它的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面有相當(dāng)了解。挑選出發(fā)菌株的標(biāo)準(zhǔn)是產(chǎn)量高、對誘變劑的敏感性大、變異幅度廣，再確定誘變劑的使用及篩選條件。2.2.3誘變育種工作中幾個應(yīng)注意的問題128B復(fù)合誘變因素的使用在微生物誘變育種中，可利用各種物理、化學(xué)誘變因素來處理菌種。對野生型菌株單誘變因素有時也能取得好的效果，但對老菌種單一誘變因素重復(fù)使用突變的效果不高，這時可利用復(fù)合因素來擴大誘變幅度，提高誘變效果。B復(fù)合誘變因素的使用129C劑量選擇各種誘變因素有它們各自的誘變劑量單位，如紫外線劑量單位用焦耳，x一射線劑量單位是庫（侖）每千克，中子劑量單位是戈。

化學(xué)誘變因素一般是以溶液濃度來計算劑量單位的。對不同微生物使用的劑量是不同的，致死率取決于誘變劑量，而致死率和變異率之間有一定關(guān)系。因此可以用致死率作為選擇適宜劑量的依據(jù)。C劑量選擇130D變異菌株的篩選誘變育種工作的一個主要任務(wù)是獲得高產(chǎn)變異菌株。從經(jīng)誘變的大量個體中挑選優(yōu)良菌種不是一件容易的事。因為不同的菌種表現(xiàn)的變異形式是不同的，從一個菌種的變異規(guī)律去發(fā)現(xiàn)那些與產(chǎn)量有關(guān)的特性，并根據(jù)這些特性，分門別類地挑選一定數(shù)最的典型菌株進行發(fā)酵和鑒定，以確定各種類型與產(chǎn)量之間的關(guān)系。這樣，可大大提高篩選的工作效率。D變異菌株的篩選131E高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合

在誘變育種過程中高產(chǎn)菌株的獲得還必須有合適的篩選條件的配合。

誘變與篩選可以說是一個問題的兩個方面，必須用辯證的觀點來看待?？傊谡T變育種過程中要正確處理出發(fā)菌株，誘變因素和篩選條件三者的關(guān)系。E高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合1322.2.4幾種常見的物理、化學(xué)誘變劑的使用方法1）物理誘變劑：紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；電離輻射特點：導(dǎo)致DNA斷裂缺失，造成不可回復(fù)的缺失突變。誘變效率高，但它可能影響鄰近基因的性能。紫外線是常用的誘變劑。2）化學(xué)誘變劑：堿基類似物（5-BU）、脫氨劑（羥胺、亞硝酸）、嵌入劑（吖啶類）等。特點：

堿基類似物：取代相應(yīng)堿基進入DNA鏈，具有很高的特異性，但回復(fù)突變率高，很少使用。

脫氨劑：堿基脫氨或脫氮，引起堿基對轉(zhuǎn)換，造成的遺傳損傷較多。應(yīng)用的范圍較廣，

嵌入劑：引起移碼突變?？梢栽斐缮x途徑完全中斷。2.2.4幾種常見的物理、化學(xué)誘變劑的使用方法1）物理誘133

5BU

酮式T

烯醇式CA：TBU(酮)：AT：AA：TG):BU(烯BU(酮)：AC：GA：TC：G5BU酮式T烯醇式CABUTAG)BUCAC134T：ＸT：AX：ＣＣ：UＣ：ＧAHNO2XG：CA：TT：ATTXＣＣAHNO2XGAT1352.3雜交育種

發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種的選育主要采用誘變育種方法。但是，一個菌種長期使用誘變劑處理之后，其生活能力一般要逐漸下降，例如生長周期延長，孢子量減少，代謝減慢，產(chǎn)量增加緩慢，誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，有必要利用雜交育種方法。

雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)吻合（或接合）使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。2.3雜交育種1361、雜交育種的目的在于：

1）通過雜交使不同菌株的遺傳物質(zhì)進行交換和重新組合，從而改變原有菌株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得雜種菌株（重組體）；2）可以通過雜交把不同菌株的優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中，克服長期用誘變劑處理造成的菌株生活力下降等缺陷；3）通過雜交，可以擴大變異范圍，改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)新的品種；

4）分析雜交結(jié)果，可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，促進遺傳學(xué)理論的發(fā)展。1、雜交育種的目的在于：137微生物雜交育種所使用的配對菌株稱為直接親本。由于多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世代，因此，直接親本菌株應(yīng)帶有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記。常用的遺傳標(biāo)記有顏色、營養(yǎng)要求和抗藥性等。

營養(yǎng)標(biāo)記菌株（即營養(yǎng)缺陷型菌株）是最常用的遺傳標(biāo)記之一。所謂營養(yǎng)缺陷型菌株是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生化突變體。由于基因突變，它失去了合成某種物質(zhì)（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基本培養(yǎng)基上不能生長，大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加一定種類的有機物質(zhì)后才能生長。2、遺傳標(biāo)記微生物雜交育種所使用的配對菌株稱為直接親本。由于1382.4原生質(zhì)體融合技術(shù)所謂原生質(zhì)體融合就是把兩個親本的細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以瓦解，使菌體細(xì)胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹著的球狀體（稱原生質(zhì)體）。兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實現(xiàn)遺傳重組。在再生成細(xì)胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。2.4原生質(zhì)體融合技術(shù)1392.4.1原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性從現(xiàn)有資料看，原生質(zhì)體融合技術(shù)有以下優(yōu)點（l）去除了細(xì)胞壁的障礙，親株基因組直接融合、交換，實現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng)。即使是相同接合型的真菌細(xì)胞也能發(fā)生原生質(zhì)體的相互融合，并可對原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染。

（2）原生質(zhì)體融合后兩親株的基因組之間有機會發(fā)生多次交換，產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的重組子。

參與融合的親株數(shù)并不限于一個，可以多至三個、四個，這足一般常規(guī)雜交所達不到的。（3）重組頻率特別高，因為有聚乙二醇作助融劑。2.4.1原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性140（4）可以和其他育種方法相結(jié)合，把由其它方法得到的優(yōu)良性狀通過原生質(zhì)體融合再組合到一個單株中。（5）可以用溫度、藥物、紫外線等處理、鈍化親株的一方或雙方，然后使之融合，再在再生菌落中篩選重組子。這樣往往可以提高篩選效率。由于以上優(yōu)點，利用原生質(zhì)體融合來培育工業(yè)新菌株已受到國內(nèi)外普遍重視。

（4）可以和其他育種方法相結(jié)合，把由其它方法得到的優(yōu)良性狀通1412.4.2原生質(zhì)體融合技術(shù)一般步驟1、選擇親株選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株；親株帶上遺傳標(biāo)記；測定遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性。2、原生質(zhì)體制備一般采用酶解法除壁。根據(jù)微生物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)的不同，采用不同的酶，有時還要采取一些措施，如添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高細(xì)胞壁對酶解的敏感性；原生質(zhì)體對滲透壓極其敏感，低滲易引起細(xì)胞破裂。一般將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中維持它的穩(wěn)定。2.4.2原生質(zhì)體融合技術(shù)一般步驟1、選擇親株1423、原生質(zhì)體融合兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實現(xiàn)遺傳重組。在再生細(xì)胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。4、原生質(zhì)體再生

原生質(zhì)體再生就是使原生質(zhì)體重新長出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；為獲得較高的再生率，在實驗過程中應(yīng)避免剪切力過大使原生質(zhì)體破裂；涂布時，原生質(zhì)體濃度不宜過高；菌齡、再生時的溫度、溶菌酶用量和溶壁時間等因素都會影響原生質(zhì)體的再生。3、原生質(zhì)體融合1435、篩選優(yōu)良性狀融合重組子原生質(zhì)體融合后，來自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成的子代稱為融合重組子。融合重組子的檢出方法：直接法將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子。間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。篩選出來的融合重組子還需要對它們進行生理生化及生產(chǎn)性能的測定。5、篩選優(yōu)良性狀融合重組子144第三節(jié)生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第三節(jié)生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管145作為種子的準(zhǔn)則菌種細(xì)胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；生理性狀穩(wěn)定；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染；保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平作為種子的準(zhǔn)則1463.1種子的制備過程種子制備的過程大致可分為：實驗室種子制備階段生產(chǎn)車間種子制備階段

3.1種子的制備過程種子制備的過程大致可分為：147一、實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基或斜面（靜置培養(yǎng)）培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法(通過搖瓶培養(yǎng)提供比較好的溶氧）。一、實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式148（一）孢子的制備1、細(xì)菌孢子的制備細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37?C。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時間一般為1~2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要5~10天。（一）孢子的制備1、細(xì)菌孢子的制備1492、霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25~28?C。培養(yǎng)時間一般為4~14天。2、霉菌孢子的制備1503、放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28?C。培養(yǎng)時間為5~14天。3、放線菌孢子的制備151（二）液體種子制備1、好氧培養(yǎng)：對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體（短菌絲），作為種子。試管→三角瓶→搖床→種子罐（二）液體種子制備1、好氧培養(yǎng)：1522、厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）試管→三角瓶→卡式罐→種子罐2、厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）153二、生產(chǎn)車間種子制備實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。二、生產(chǎn)車間種子制備實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐1541、種子罐的作用主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。1、種子罐的作用1552、種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)。種子罐級數(shù)取決于：菌種生長特性（如菌種傳代后的穩(wěn)定性）、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；所采用發(fā)酵罐的容積另外還與發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量（種子液體積/培養(yǎng)液體積）以及種子罐與發(fā)酵罐的容積比等有關(guān)。2、種子罐級數(shù)的確定156細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐（27?C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級種子罐（27?C,1