基因表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)課件

酵母表達系統(tǒng)優(yōu)點1屬于真核生物,可進行翻譯后修飾,如糖基化2操作容易3經(jīng)濟4快速1酵母表達系統(tǒng)優(yōu)點1酵母細胞結構2酵母細胞結構2兩種酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母表達系統(tǒng)Saccharomycescerevisiae過去常用畢赤酵母

Pichiapastoris現(xiàn)在多用3兩種酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母表達系統(tǒng)畢赤酵母3Pichiapastoris表達系統(tǒng)

Pichiapastoris是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作為唯一的碳源.易操作,培養(yǎng)容易表達量高,可達培養(yǎng)液中10g/L可以有真核生物的翻譯后修飾,如糖基化避免了釀酒酵母的過糖基化問題4Pichiapastoris表達系統(tǒng)Pichiapa551.Pichiapastoris的表達載體胞內表達載體胞外表達載體P.pastoris沒有穩(wěn)定的附加體質粒，所以一般用整合型載體作為外源基因的表達載體

61.Pichiapastoris的表達載體胞內表達載體Alcoholoxidase,醇氧化酶,將甲醇氧化成甲醛通過高表達來補償酶活性不足,因此有強啟動子AOX1是主要的酶受甲醇嚴格控制啟動子用來驅動外源基因表達AOX2利用甲醇的能力低生長慢7Alcoholoxidase,醇氧化酶,將甲醇氧化成甲宿主His4突變，不能合成組氨酸，在His缺陷培養(yǎng)基上不能生長；質粒上有His4,可合成組氨酸，用His缺陷平板篩選轉化菌株。histidinoldehydrogenasegene(his4)8宿主His4突變，不能合成組氨酸，在His缺陷培養(yǎng)基上不能2.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR92.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR胞內表達載體,pAO815

10胞內表達載體,pAO81510胞外表達載體,pIC9K11胞外表達載體,pIC9K11pPIC9k,胞外表達載體12pPIC9k,胞外表達載體123.多拷貝產生，pIC9K,體內形成多拷貝因為未線性化的環(huán)狀質粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低未線性化的環(huán)狀質粒發(fā)生同源重組的幾率非常低133.多拷貝產生，pIC9K,體內形成多拷貝因為未線性化的pAO815

可體外構建多拷貝14pAO815

可體外構建BamHI：GGATCCCCTAGGBglII：AGATCTTCTAGA15BamHI：GGATCCBglII：AGATCT154.

宿主細胞PichiaStrain基因型GS115AOX1正常，Mul+KM71AOX1被破壞，MulS宿主的histidinoldehydrogenasegene(his4)突變可以在完全培養(yǎng)基YPD和含組氨酸的基礎培養(yǎng)基上生長在表達質粒轉入后才能在組氨酸缺陷培養(yǎng)基上生長本身的回復突變?yōu)?/108。164.宿主細胞PichiaStrain基因型GS115轉化后細胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，Mul+AOX1被破壞，MulS轉化后對甲醇的利用KM71無論在那里交換，只能是甲醇低利用，因為宿主沒有AOX1甲醇高利用SalI、StuI切甲醇低利用BglII切GS115取決于質粒在宿主細胞基因組上交換的位置是否破壞宿主的AOX117轉化后細胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，線性化位點質粒線性化后轉化宿主細胞線性化質粒發(fā)生同源重組的幾率提高18線性化位點質粒線性化后轉化宿主細胞線性化質粒發(fā)生同源重組的pAO815和pPIC9K在SalI、StuI單切,

在his4插入（單交換），不破壞宿主的AOX1，轉化GS115后產生：His+/Mut+單交換同源重組基因轉移法：是將外源基因定位導人受體細胞染色體上的方法，因為在該座位有與導人基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換原有基因片段。19pAO815和pPIC9K單交換同源重組基因轉移法：是將外pAO815和pPIC9K在BglII雙切：在5AOX1位點和3AOX1雙交換，替換掉了宿主的AOX1基因，轉化后GS115產生His+/Muts

BglIIHis45AOX13AOX1geneHis4AOX120pAO815和pPIC9K在BglII雙切：BglII2121技術路線選擇合適的內切酶位點將基因插入載體注:pAO815和pIC9K是穿梭載體,可在大腸桿菌中操作pAO815體外構建多拷貝轉化宿主細胞線性化質粒組氨酸缺陷平板篩選重組子22技術路線選擇合適的內切酶位點注:pAO815pAO815轉化G418篩選pIC9K多拷貝

PCR檢測轉化細胞中的基因插入誘導表達SDS檢測pAO815和pPIC9K23G418PCR檢測誘導表達pAO815和pPIC9K23酵母菌轉化PEG1000TransformationMethodforPichiaBufferA:1.0MSorbitol(山梨醇),10mMBicine（N-二羥乙基甘氨酸）,pH8.35(Sigma),3%(v/v)ethyleneglycol(乙二醇

)BufferB:40%(w/v)Polyethyleneglycol1000(Sigma),0.2MBicine,pH8.35BufferC:0.15MNaCl,10mMBicine,pH8.35Filtersterilizeandstoreat-20°C.24酵母菌轉化PEG1000TransformationM制備感受態(tài)細胞1.劃線接種酵母菌，YPD平板，30°Cfortwodays.2.挑菌落于10mlYPD30°C搖過夜.3.轉培養(yǎng)到100mlYPD，startingOD600of0.1andgrowat30°CtoanOD600of0.5to0.8.4.3000xg收集細胞，用50mlofBufferA洗細胞，室溫.5.細胞懸浮在4mlofBufferA中，分裝成0.2ml于滅菌的管中，每管加11μlDMSO（-70度），混勻，液氮快速冷凍，-70°C保存。25制備感受態(tài)細胞1.劃線接種酵母菌，YPD平板，30°C保持感受態(tài)細胞在冰凍狀態(tài)作轉化！Cellcompetencedecreasesveryrapidlyafterthecellsthawevenwhenheldonice.

ItiscriticaltoaddDNAtofrozencellsamples.

Toperformmultipletransformations,itisrecommendedtoprocessthemingroupsofsixatatime.26保持感受態(tài)細胞在冰凍狀態(tài)作轉化！CellcompetencTransformation1.10-50μgDNA（20μl液體中），直接加到still-frozentubeofcompetentcells（40μgofdenaturedandsonicatedsalmonspermDNA）；2.37°C水浴5分鐘，中間混勻兩次；3.加1.5mlofBufferB，徹底混勻；4.30°C水浴1hour；5.2000xg離心10，RT，去上清，細胞懸浮在1.5mlBufferC中；6.離心后將細胞懸浮在0.2mlBufferC中；7.將細胞涂布在選擇培養(yǎng)平板（MD）上，30°Cfor3to4days.27Transformation1.10-50μgDNA儲存液10XYNB(13.4%YeastNitrogenBasewithAmmoniumSulfatewithoutaminoacids)，抽濾；500XB(0.02%Biotin)，抽濾；10XD(20%Dextrose葡萄糖)，抽濾；10XM(5%Methanol)，抽濾；10XGY(10%Glycerol)，高壓；1Mpotassiumphosphatebuffer,pH6.0，高壓。28儲存液10XYNB(13.4%YeastNitrogYPD培養(yǎng)基YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1liter)1%yeastextract2%peptone900mlofwaterAutoclavefor20minutesonliquidcycle.2%dextrose(glucose)，（20%儲存液，抽濾滅菌）。Note:Add20gofagarifmakingYPDplates。29YPD培養(yǎng)基YeastExtractPeptoneDeMinimalDextrose

MD平板成分：1.34%YNB（yeastnitrogenbase，酵母培養(yǎng)基）4x10-5%biotin2%dextrose配制方法：1.800ml水，（平板加15gagar），滅菌20；2.冷卻到60°C，加100mlof10XYNB，2mlof500Xbiotin，100mlof10Xdextrose；3.倒平板。30MinimalDextrose

MD平板成分：1.34%

BMGY：BufferedGlycerol-complexMedium

BMMY：BufferedMethanol-complexMedium(1liter)

成分：1%yeastextract2%peptone100mMpotassiumphosphate,pH6.01.34%YNB4x10-5%biotin

1%glycerol（BMGY）or0.5%methanol（BMMY）31

BMGY：BufferedGlycerol-comp323233333434畢赤酵母具有高等真核表達系統(tǒng)的許多優(yōu)點：1.蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。2.操作時與E.coli及釀酒酵母同樣簡單。它比桿狀病毒或哺乳動物組織培養(yǎng)等其它真核表達系統(tǒng)更快捷、簡單、廉價，且表達水平更高。3.同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優(yōu)點，且它的外源蛋白表達水平是后者的十倍以至百倍。

這些使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達系統(tǒng)。

35畢赤酵母具有高等真核表達系統(tǒng)的許多優(yōu)點：35畢赤酵母系統(tǒng)的注意事項嚴格無菌操作，防止污染；可以鏡檢溫度≤30C;轉化PCR檢測5.誘導時間36畢赤酵母系統(tǒng)的注意事項嚴格無菌操作，防止污染；可以鏡檢36酵母蛋白糖基化釀酒酵母與畢赤酵母大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露糖型；然而畢赤酵母中蛋白翻譯后所增加的寡糖鏈長度（平均每個支鏈8-14個甘露糖殘基）比釀酒酵母中的（50-150個甘露糖殘基）短得多，但比人的大；釀酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖連接頭，而畢赤酵母則沒有。一般認為α-1,3聚糖接頭與蛋白的超抗原性有關，使得這些蛋白不適于治療應用。37酵母蛋白糖基化釀酒酵母與畢赤酵母大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露蛋白質糖基化蛋白質的糖基化是真核生物的一種常見的翻譯后修飾方式；糖基化影響蛋白折疊、定位、轉運、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。38蛋白質糖基化蛋白質的糖基化是真核生物的一種常見的翻譯后修飾方1、N-linkedglycosylationasugarattachtotheaminogroupofanasparagine（天冬氨酰）.

sequencemotifAsn-Xaa-Ser/Thr39392、O-linkedglycosylation,InO-glycosylation,asugarisattachedtothehydroxylgroupofaserineorthreonineresidue.

nosequencemotifdefined402、O-linkedglycosylation,InO3、C-Mannosylation（甘露糖化）sugarislinkedtotheproteinthroughacarbon-carbonbond.413、C-Mannosylation（甘露糖化）414、GPIanchorattachments.Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchoredproteins.糖基磷脂酰肌醇錨bindingtotheplasmamembrane424、GPIanchorattachments.Gly酵母表達系統(tǒng)優(yōu)點1屬于真核生物,可進行翻譯后修飾,如糖基化2操作容易3經(jīng)濟4快速43酵母表達系統(tǒng)優(yōu)點1酵母細胞結構44酵母細胞結構2兩種酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母表達系統(tǒng)Saccharomycescerevisiae過去常用畢赤酵母

Pichiapastoris現(xiàn)在多用45兩種酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母表達系統(tǒng)畢赤酵母3Pichiapastoris表達系統(tǒng)

Pichiapastoris是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作為唯一的碳源.易操作,培養(yǎng)容易表達量高,可達培養(yǎng)液中10g/L可以有真核生物的翻譯后修飾,如糖基化避免了釀酒酵母的過糖基化問題46Pichiapastoris表達系統(tǒng)Pichiapa4751.Pichiapastoris的表達載體胞內表達載體胞外表達載體P.pastoris沒有穩(wěn)定的附加體質粒，所以一般用整合型載體作為外源基因的表達載體

481.Pichiapastoris的表達載體胞內表達載體Alcoholoxidase,醇氧化酶,將甲醇氧化成甲醛通過高表達來補償酶活性不足,因此有強啟動子AOX1是主要的酶受甲醇嚴格控制啟動子用來驅動外源基因表達AOX2利用甲醇的能力低生長慢49Alcoholoxidase,醇氧化酶,將甲醇氧化成甲宿主His4突變，不能合成組氨酸，在His缺陷培養(yǎng)基上不能生長；質粒上有His4,可合成組氨酸，用His缺陷平板篩選轉化菌株。histidinoldehydrogenasegene(his4)50宿主His4突變，不能合成組氨酸，在His缺陷培養(yǎng)基上不能2.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR512.CONSTRUCTIONOFTHEVECTOR胞內表達載體,pAO815

52胞內表達載體,pAO81510胞外表達載體,pIC9K53胞外表達載體,pIC9K11pPIC9k,胞外表達載體54pPIC9k,胞外表達載體123.多拷貝產生，pIC9K,體內形成多拷貝因為未線性化的環(huán)狀質粒之間發(fā)生同源重組的幾率非常低未線性化的環(huán)狀質粒發(fā)生同源重組的幾率非常低553.多拷貝產生，pIC9K,體內形成多拷貝因為未線性化的pAO815

可體外構建多拷貝56pAO815

可體外構建BamHI：GGATCCCCTAGGBglII：AGATCTTCTAGA57BamHI：GGATCCBglII：AGATCT154.

宿主細胞PichiaStrain基因型GS115AOX1正常，Mul+KM71AOX1被破壞，MulS宿主的histidinoldehydrogenasegene(his4)突變可以在完全培養(yǎng)基YPD和含組氨酸的基礎培養(yǎng)基上生長在表達質粒轉入后才能在組氨酸缺陷培養(yǎng)基上生長本身的回復突變?yōu)?/108。584.宿主細胞PichiaStrain基因型GS115轉化后細胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，Mul+AOX1被破壞，MulS轉化后對甲醇的利用KM71無論在那里交換，只能是甲醇低利用，因為宿主沒有AOX1甲醇高利用SalI、StuI切甲醇低利用BglII切GS115取決于質粒在宿主細胞基因組上交換的位置是否破壞宿主的AOX159轉化后細胞的甲醇利用能力GS115KM71AOX1正常，線性化位點質粒線性化后轉化宿主細胞線性化質粒發(fā)生同源重組的幾率提高60線性化位點質粒線性化后轉化宿主細胞線性化質粒發(fā)生同源重組的pAO815和pPIC9K在SalI、StuI單切,

在his4插入（單交換），不破壞宿主的AOX1，轉化GS115后產生：His+/Mut+單交換同源重組基因轉移法：是將外源基因定位導人受體細胞染色體上的方法，因為在該座位有與導人基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換原有基因片段。61pAO815和pPIC9K單交換同源重組基因轉移法：是將外pAO815和pPIC9K在BglII雙切：在5AOX1位點和3AOX1雙交換，替換掉了宿主的AOX1基因，轉化后GS115產生His+/Muts

BglIIHis45AOX13AOX1geneHis4AOX162pAO815和pPIC9K在BglII雙切：BglII6321技術路線選擇合適的內切酶位點將基因插入載體注:pAO815和pIC9K是穿梭載體,可在大腸桿菌中操作pAO815體外構建多拷貝轉化宿主細胞線性化質粒組氨酸缺陷平板篩選重組子64技術路線選擇合適的內切酶位點注:pAO815pAO815轉化G418篩選pIC9K多拷貝

PCR檢測轉化細胞中的基因插入誘導表達SDS檢測pAO815和pPIC9K65G418PCR檢測誘導表達pAO815和pPIC9K23酵母菌轉化PEG1000TransformationMethodforPichiaBufferA:1.0MSorbitol(山梨醇),10mMBicine（N-二羥乙基甘氨酸）,pH8.35(Sigma),3%(v/v)ethyleneglycol(乙二醇

)BufferB:40%(w/v)Polyethyleneglycol1000(Sigma),0.2MBicine,pH8.35BufferC:0.15MNaCl,10mMBicine,pH8.35Filtersterilizeandstoreat-20°C.66酵母菌轉化PEG1000TransformationM制備感受態(tài)細胞1.劃線接種酵母菌，YPD平板，30°Cfortwodays.2.挑菌落于10mlYPD30°C搖過夜.3.轉培養(yǎng)到100mlYPD，startingOD600of0.1andgrowat30°CtoanOD600of0.5to0.8.4.3000xg收集細胞，用50mlofBufferA洗細胞，室溫.5.細胞懸浮在4mlofBufferA中，分裝成0.2ml于滅菌的管中，每管加11μlDMSO（-70度），混勻，液氮快速冷凍，-70°C保存。67制備感受態(tài)細胞1.劃線接種酵母菌，YPD平板，30°C保持感受態(tài)細胞在冰凍狀態(tài)作轉化！Cellcompetencedecreasesveryrapidlyafterthecellsthawevenwhenheldonice.

ItiscriticaltoaddDNAtofrozencellsamples.

Toperformmultipletransformations,itisrecommendedtoprocessthemingroupsofsixatatime.68保持感受態(tài)細胞在冰凍狀態(tài)作轉化！CellcompetencTransformation1.10-50μgDNA（20μl液體中），直接加到still-frozentubeofcompetentcells（40μgofdenaturedandsonicatedsalmonspermDNA）；2.37°C水浴5分鐘，中間混勻兩次；3.加1.5mlofBufferB，徹底混勻；4.30°C水浴1hour；5.2000xg離心10，RT，去上清，細胞懸浮在1.5mlBufferC中；6.離心后將細胞懸浮在0.2mlBufferC中；7.將細胞涂布在選擇培養(yǎng)平板（MD）上，30°Cfor3to4days.69Transformation1.10-50μgDNA儲存液10XYNB(13.4%YeastNitrogenBasewithAmmoniumSulfatewithoutaminoacids)，抽濾；500XB(0.02%Biotin)，抽濾；10XD(20%Dextrose葡萄糖)，抽濾；10XM(5%Methanol)，抽濾；10XGY(10%Glycerol)，高壓；1Mpotassiumphosphatebuffer,pH6.0，高壓。70儲存液10XYNB(13.4%YeastNitrogYPD培養(yǎng)基YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1liter)1%yeastextract2%peptone900mlofwaterAutoclavefor20minutesonliquidcycle.2%dextrose(glucose)，（20%儲存液，抽濾滅菌）。Note:Add20gofagarifmakingYPDplates。71YPD培養(yǎng)基YeastExtractPeptoneDeMinimalDextrose

MD平板成分：1.34%YNB（yeastnitrogenbase，酵母培養(yǎng)基）4x10-5%biotin2%dextrose配制方法：1.800ml水，（平板加15gagar），滅菌20；2.冷卻到60°C，加100mlof10XYNB，2mlof500Xbiotin，100mlof10Xdextrose；3.倒平板。72MinimalDextrose

MD平板成分：1.34%

BMGY：BufferedGlycerol-complexMedium

BMMY：BufferedMethanol-complexMedium(1liter)

成分：1%yeastextract2%peptone100mMpotassiumphosphate,pH6.01.34%YNB4x10-5%biotin

1%glycerol（BMGY）or0.5%methanol（BMMY）73

BMGY：BufferedGlycerol-comp743275337634畢赤酵