維生素的分類及生理功能課件

4.7維生素的測(cè)定

概述脂溶性維生素A、E的測(cè)定水溶性維生素B、C的測(cè)定4.7維生素的測(cè)定概述14.7.1概述（1）維生素的分類及生理功能（2）測(cè)定的目的和意義（3）維生素的測(cè)定方法4.7.1概述（1）維生素的分類及生理功能2

（1）維生素的分類及生理功能功能：

維生素是維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類小分子有機(jī)化合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多。目前已經(jīng)確認(rèn)的有30多種，其中有20種被認(rèn)為與維持人體健康和促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育是至關(guān)重要的。主要是通過作為輔酶的成分調(diào)節(jié)代謝過程，人體對(duì)它的需要量極少，但作用非常大。一般在體內(nèi)不能合成或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝??；長(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相關(guān)新陳代謝的紊亂，出現(xiàn)各種特有的癥狀。（1）維生素的分類及生理功能功能：3分類：按溶解性能可將它們分成兩大類：一類是能溶在脂肪或脂溶性溶劑中的，叫脂溶性維生素（如A、D、E、K等）；另一類是能溶解在水中的，叫水溶性維生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。分類：4（2）測(cè)定的目的和意義

可評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值；開發(fā)利用富含維生素的食品；多數(shù)維生素的性質(zhì)不穩(wěn)定，常常作為強(qiáng)化劑在食品工業(yè)的某些產(chǎn)品中使用?？梢匝芯渴称吩诓煌募庸ぁ?chǔ)存條件下的穩(wěn)定性，進(jìn)而指導(dǎo)人們制定合理的工藝條件，減少維生素的損失；起到監(jiān)督維生素強(qiáng)化食品的劑量，以防攝入過多的維生素而引起中毒。（2）測(cè)定的目的和意義可評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值；5

（3）維生素的測(cè)定方法微生物法：基于某種微生物生長(zhǎng)需要特定的維生素，方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、不需要特殊儀器，樣品不需經(jīng)特殊處理，但只能測(cè)定水溶性維生素。化學(xué)法：比色法、滴定法儀器法：色譜法、熒光法、酶法、免疫法等。特別是HPLC可用于大多數(shù)維生素的測(cè)定，并且在某些條件下可同時(shí)分析幾種維生素，但分析費(fèi)用較高。

應(yīng)根據(jù)不同的食品基質(zhì)和條件選擇不同的分析方法（3）維生素的測(cè)定方法6重點(diǎn)講解的方法：高效液相色譜法（HPLC法）同時(shí)測(cè)定脂溶性維生素A和維生素E比色法測(cè)定維生素AHPLC法測(cè)定胡蘿卜素滴定法和比色法測(cè)定維生素C熒光法測(cè)定B1、B2重點(diǎn)講解的方法：74.7.2維生素A、E的測(cè)定—HPLC法

（GB/T5009.82)以乳粉為樣品演示樣品的預(yù)處理和HPLC的使用VA的性質(zhì)：維生素A是β-紫羅酮環(huán)與一元醇所組成的一類化合物及其衍生物的總稱。通常所說的維生素A是指視黃醇或視黃醇醋酸酯。⑴因有許多不飽和鏈，故見光易分解；⑵在缺氧情況下，對(duì)熱較穩(wěn)定，對(duì)光特別敏感。測(cè)定速度要快。⑶不溶于水，溶于有機(jī)溶劑，對(duì)堿穩(wěn)定4.7.2維生素A、E的測(cè)定—HPLC法

8VE的性質(zhì)：又稱生育酚，目前已經(jīng)確認(rèn)的有8種異構(gòu)體，最常見的有α、β、γ、δ-生育酚。溶于脂溶性溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，酸性環(huán)境中比堿性環(huán)境中穩(wěn)定，無氧條件下，對(duì)熱、光及堿性環(huán)境中也相對(duì)穩(wěn)定。VE廣泛分布在各種糧食的胚和植物油中。VE的性質(zhì)：又稱生育酚，目前已經(jīng)確認(rèn)9測(cè)定原理：（1）液相色譜的原理：液相色譜是采用液體為流動(dòng)相的一種色譜法。高效液相色譜儀由高壓泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器、記錄和數(shù)據(jù)處理裝置等部分組成。高壓泵以恒定的流量，從貯液容器吸取作為流動(dòng)相的溶劑輸送到色譜柱，試樣由進(jìn)樣裝置導(dǎo)入，隨流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離。分離后的組分進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)，并用記錄儀繪出色譜圖，或與其他數(shù)據(jù)處理裝置相連，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理

色譜圖：某一波長(zhǎng)下各個(gè)不同時(shí)刻的吸光度值描點(diǎn)作圖。測(cè)定原理：10（2）高效液相色譜檢測(cè)樣品中的維生素A、E的原理：樣品中的維生素E及維生素A經(jīng)皂化提取處理后，將其從不皂化部分提取至有機(jī)溶劑中。用高效液相色譜法C18反相柱將維生E和維生素A分離，經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，并用內(nèi)標(biāo)法定量維生素的分類及生理功能課件11(3）什么是內(nèi)標(biāo)法？

取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分，按依次增加或減少的已知階段量，各自分別加入各單體所規(guī)定的定量?jī)?nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，調(diào)制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取此標(biāo)準(zhǔn)液的一定量注入色譜柱，根據(jù)色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高的比例為縱坐標(biāo)，取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量之比或標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

然后按單體中所規(guī)定的方法調(diào)制試樣液，調(diào)制試樣液時(shí)，預(yù)先加入與調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)溶液等量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，然后按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的同樣條件下得出色譜圖，求出被測(cè)成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高之比，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線來求出被測(cè)成分的含量。(3）什么是內(nèi)標(biāo)法？12

內(nèi)標(biāo)物的選取原則：能與被測(cè)成分完全分離，但其保留時(shí)間又盡可能接近被測(cè)成分的穩(wěn)定的物質(zhì)。維生素的分類及生理功能課件13

試劑（1）無水乙醚：不含有過氧化物。（2）無水乙醇：不得含有醛類物質(zhì)。（3）無水硫酸鈉。（4）甲醇：重蒸后使用。（5）重蒸水：水中加少量高錳酸鉀，臨用前蒸餾。（6）抗壞血酸溶液（100g／L）：臨用前進(jìn)行配制。（7）氫氧化鉀溶液（50g／100g）：取50g氫氧化鉀,溶于50g水中，混勻

14

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（1）維生素A標(biāo)準(zhǔn)液：視黃醇（純度85％）或視黃醇乙酸酯（純度90％）經(jīng)皂化處理后使用。用脫醛乙醇溶解維生素A標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為lmg/mL。臨用前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。（2）維生素E標(biāo)準(zhǔn)液：a-生育酚（純度95％），γ-生育酚（純純95％），δ-生育酚（純度95％）。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為lmg/mL,臨用前用紫外分光光度法分別標(biāo)定此三種維生素E的準(zhǔn)確濃度。（3）內(nèi)標(biāo)溶液：稱取苯并芘（純度98％），用脫醛乙醇配制成10ug/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制15儀器和設(shè)備（1）高效液相色譜儀帶紫外分光檢測(cè)器。（2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。（3）高速離心機(jī)（帶小塑料離心管）（4）高純氮?dú)?。?）紫外分光光度計(jì)。維生素的分類及生理功能課件16

樣品處理：

皂化→提取→洗滌→濃縮→

定容

樣品處理：17（1）皂化：稱取適量樣品于三角瓶中，加30mL無水乙醇，振搖使樣品分散。加入5mL100g/L抗壞血酸溶液和2.0mL苯并芘內(nèi)標(biāo)液，混勻，加10mL氫氧化鉀溶液，沸水回流30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷卻。

思考：皂化時(shí)加入Vc的作用是什么？（1）皂化：18

（2）提取：

將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50mL水分2-3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL無水乙醚分2次洗皂化瓶及殘?jiān)?，乙醚液并入分液漏斗中。輕輕振搖2min，靜置分層，棄去水層。維生素的分類及生理功能課件19(3)洗滌：每次用約50mL水將乙醚液洗至中性，需洗4~5次(3)洗滌：20（4）濃縮：

將乙醚提取液經(jīng)無水硫酸鈉（約5g）濾入150mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，用約15mL乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次，并入蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，醚剩下約2mL時(shí)，取下蒸發(fā)瓶。維生素的分類及生理功能課件21（5）定容：

用氮?dú)獯蹈梢颐?，隨即加入2mL乙醇，充分混合，溶解提取物。5000r/min離心5min，上清液供色譜分析用。（5）定容：22液相色譜推薦條件：分析柱：C18反相柱5μm，4.6mm×25Cm；流動(dòng)相：甲醇：水=98：2，混勻，臨用前脫氣；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：300nm;進(jìn)樣量：20μL；流速：1.70mL/min。

維生素的分類及生理功能課件23標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（1）維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：取上述配制的維生素A、E的標(biāo)準(zhǔn)溶液按一定的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，在下表要求的條件下測(cè)定其吸光度，根據(jù)其吸光系數(shù)計(jì)算其準(zhǔn)確濃度。標(biāo)準(zhǔn)比吸光系數(shù)E(1%,cm)測(cè)定波長(zhǎng)（nm）視黃醇1835325γ-生育酚71294δ-生育酚92.8298a-生育酚91.2298標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)比吸光系數(shù)E(1%,cm)測(cè)定波長(zhǎng)24標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計(jì)算：

p---某維生素濃度，mg/mL；A---維生素的平均紫外吸光值；E---某種維生素l％比吸光系數(shù);F---稀釋倍數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計(jì)算：25（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:

本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量。把高、低兩個(gè)濃度的維生素A、γ-生育酚、a-生育酚、δ-生育酚及內(nèi)標(biāo)苯并芘液混合，（其內(nèi)標(biāo)苯并芘的濃度值相同）將二種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見色譜圖。以維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，維生素的濃度(ug/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。維生素的分類及生理功能課件26維生素的分類及生理功能課件27樣品分析：取樣品處理液20μl，用標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣的條件進(jìn)行色譜分析，繪制色譜圖。定性：根據(jù)保留時(shí)間定性定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，以此比值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測(cè)維生素的含量。維生素的分類及生理功能課件28計(jì)算：式中：X---某種維生素的含量，mg/100g；P---由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的某種維生素含量，μg/mL；V---樣品濃縮后定容體積，ml；m--樣品質(zhì)量，g。計(jì)算：29說明及討論

（1）維生素極易被光破壞，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在微弱光線下進(jìn)行，或使用棕色玻璃儀器。（2）乙醚為溶劑的萃取體系，易發(fā)生乳化現(xiàn)象。在提取、洗滌操作中，不要用力過猛，若發(fā)生乳化，可加幾滴乙醇破乳。（3）本法是國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，適用于各種食物和飼料中維生素A和維生素E的同時(shí)測(cè)定。（4）本法不能將β-生育酚γ-生育酚分開，所以γ-生育酚的色譜峰中含有β-生育酚。

說明及討論30IU（國際單位）與質(zhì)量的換算1IUVa=0.33μg1IUβ-胡蘿卜素=0.6μg1UgVd=40IU1IUVd=0.025μg1IU維生素D=0.025ug維生素D31IUVe=1mgVe(DL-a-生育酚醋酸酯)1mgDL-a-生育酚=1.1IUVe1mgD-a-生育酚=1.49IUVe1mgD-a-生育酚醋酸酯=1.36IUVeIU（國際單位）與質(zhì)量的換算1IUVa=0.33μg31

4.7.3維生素A的測(cè)定（三氯化銻比色法）

原理：VA+三氯化銻→藍(lán)色物質(zhì)，于620nm測(cè)吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。

試劑：無水Na2SO4、乙酸酐：吸水乙醚：抽提乙醇、KOH：皂化反應(yīng)三氯甲烷：溶劑三氯化銻-三氯甲烷：反應(yīng)試劑酚酞：用于鑒別洗滌液中有無堿4.7.3維生素A的測(cè)定（三氯化銻比色法）32步驟：（1）預(yù)處理：皂化、提取、洗滌、濃縮（2）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：用VA標(biāo)準(zhǔn)液繪制，用CHCl3調(diào)零。注意在移入光路前，迅速加入三氯化銻，6秒內(nèi)測(cè)定(3)樣品測(cè)定：用樣品溶液代替標(biāo)準(zhǔn)液溶液。

維生素的分類及生理功能課件33說明(1)萃取時(shí),不要用力過猛，避免發(fā)生乳化。（2）氯仿中必須無水，因三氯化銻遇水會(huì)出現(xiàn)沉淀，干擾比色測(cè)定。（3）由于三氯化銻與VA所產(chǎn)生的蘭色物質(zhì)不穩(wěn)定，注意在移入光路前，迅速加入三氯化銻，6秒內(nèi)測(cè)定。（4）三氯化銻腐蝕性強(qiáng)，且遇水生成白色沉淀，實(shí)驗(yàn)用過的儀器要先用稀鹽酸浸泡后再清洗。維生素的分類及生理功能課件34植物油中VE的測(cè)定（文獻(xiàn)方法）樣品處理：準(zhǔn)確稱取1g左右的樣品用25mL丙酮溶解。儀器條件：流動(dòng)相：乙腈+甲醇=80+20流速：1.2ml/min色譜柱：C18反相柱波長(zhǎng)：298nm此法可以同時(shí)測(cè)定γ-生育酚、a-生育酚、δ-生育酚植物油中VE的測(cè)定（文獻(xiàn)方法）樣品處理：準(zhǔn)確稱取1g354.7.4β-胡蘿卜素的測(cè)定（HPLC法）試樣中的β-胡蘿卜素，用石油醚+丙酮混合液提取，經(jīng)三氧化鋁柱純化，然后以高效液相色譜法測(cè)定，以保留時(shí)間定性，以峰高或峰面積定量。注意：濃縮提取液時(shí)，防止蒸干，避免胡蘿卜素在空氣中氧化或因高溫、紫外線直射等破壞。4.7.4β-胡蘿卜素的測(cè)定（HPLC法）試樣中的β-胡蘿364.7.5維生素B1的測(cè)定—熒光法(GB/T5009.84)原理：硫胺素（VB1）在堿性鐵氰化鉀溶液中被氧化為嘧噻色素，在紫外線照射下，嘧噻色素發(fā)出熒光。在給定條件下，以及沒有其他熒光物質(zhì)干擾時(shí)，熒光強(qiáng)度與嘧噻色素成正比，即與溶液中硫胺素量成正比。試樣在硫酸作用下，加熱提取VB1，冷卻后用淀粉酶處理使VB1分離，然后以所得溶液做測(cè)定。測(cè)定步驟：提取(水解、酶解）→凈化→氧化→測(cè)定水解、酶解的作用:使結(jié)合態(tài)VB1變?yōu)橛坞x態(tài)VB14.7.5維生素B1的測(cè)定—熒光法(GB/T5009.37維生素B1的測(cè)定—HPLC法維生素B1通常采用反相鍵合相色譜法進(jìn)行分離，利用紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。利用熒光檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)，應(yīng)首先使從樣品中提取的維生素B1氧化成硫色素，然后轉(zhuǎn)入正丁醇或異丁醇中，再進(jìn)行HPLC分析。維生素B1的測(cè)定—HPLC法維生素B1通常采用反相鍵合相色譜384.7.6維生素B2的測(cè)定——熒光法原理：試樣在稀鹽酸中水解、酶解，調(diào)整PH值，過濾除去蛋白質(zhì)等物質(zhì)；試樣溶液經(jīng)高錳酸鉀氧化，除去干擾物，再經(jīng)硅鎂吸附劑的柱層析，提純的核黃素在波長(zhǎng)525nm下發(fā)生黃綠色熒光，在稀溶液中其熒光強(qiáng)度與核黃素的濃度成正比。再加入低亞硫酸鈉，將VB2還原成無熒光的物質(zhì)，然后再測(cè)定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光，兩者相差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。測(cè)定核黃素的方法還有：微生物法和HPLC法。4.7.6維生素B2的測(cè)定——熒光法原理：試樣在稀鹽酸中水39維生素的分類及生理功能課件404.7.7維生素C（抗壞血酸）的測(cè)定

維生素C的生理功能及性質(zhì)維生素C是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱作抗壞血酸。維生素C具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。在食品中，這三種形式均有存在，但主要是前兩者，故許多國家的食品成分表均以抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量表示。4.7.7維生素C（抗壞血酸）的測(cè)定維生素C的生理功能及41還原型維生素C有強(qiáng)還原性，有抑制多酚氧化酶作用，故常添加于啤酒、果汁等食品中作抗氧化劑。在新鮮的水果蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、獼猴桃、柑橘等食品中含量尤為豐富。維生素的分類及生理功能課件42維生素C的測(cè)定方法2，6—二氯靛酚滴定法2，4—二硝基苯肼比色法熒光法高效液相色譜法維生素C的測(cè)定方法43（1）2，6—二氯靛酚滴定法測(cè)定的是還原型抗壞血酸的含量該方法簡(jiǎn)便、靈敏，但特異性差，樣品中的其他還原性物質(zhì)（如鐵離子、銅離子等）會(huì)干擾測(cè)定，使結(jié)果偏高，對(duì)色深樣液的滴定終點(diǎn)不易辨別。（1）2，6—二氯靛酚滴定法44（2）2，4—二硝基苯肼比色法和熒光法測(cè)得的是抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。

苯肼法操作復(fù)雜，特異性差，易受共存物質(zhì)的影響；熒光法受干擾的影響較小，結(jié)果較準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜。維生素的分類及生理功能課件45（3）高效液相色譜法可以同時(shí)測(cè)得抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的含量。

具有干擾少，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，靈敏、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，是上述幾種方法中最先進(jìn)、可靠的方法。但分析成本較高。主要介紹維生素C常用的測(cè)定方法2，6—二氯靛酚滴定法、苯肼比色法（3）高效液相色譜法46（一）2，6-二氯靛酚滴定法以新鮮果蔬為樣品進(jìn)行講解和演示原理：

還原型抗壞血酸可以還原染料2，6—二氯靛酚。該染料在酸性溶液中是粉紅色（在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色），被還原后顏色消失；還原型抗壞血酸還原染料后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時(shí)，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)染料液的量，與樣品中抗壞血酸含量成正比。

（一）2，6-二氯靛酚滴定法以新鮮果蔬為樣品進(jìn)行講解和演示47試劑

①1%草酸溶液②2%草酸溶液③抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液④2，6—二氯靛酚溶液⑤0.001mol/L碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取干燥的碘酸鉀0.3567g，用水稀釋至100ml，取出1ml，用水稀至100ml，此溶液1ml相當(dāng)于抗壞血酸0.088mg。⑥1%淀粉溶液⑦6%碘化鉀溶液試劑48抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定：

配制：準(zhǔn)確稱取20mg抗壞血酸，溶于1％的草酸中，并稀釋至100ml，置冰箱中保存。用時(shí)取出5ml，置于50ml容量瓶中，用1％草酸溶液定容，配成0.02mg/ml的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)定：吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液5ml于三角瓶中，加入6％碘化鉀溶液0.5ml、1％淀粉溶液3滴，以0.00lmol/L碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，終點(diǎn)為淡藍(lán)色。維生素的分類及生理功能課件49C---抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/mL；V1---滴定時(shí)消耗0.001mol/L碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2---滴定時(shí)所取抗壞血酸的體積，mL；0.088---lmL0.001mol碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于抗壞血酸的量，mg/mL維生素的分類及生理功能課件502，6-二氯靛酚溶液的配制和標(biāo)定

配制：稱取2，6—二氯靛酚50mg，溶于200mL含有52mg碳酸氫鈉的熱水中，待冷，置于冰箱中過夜。次日過濾于250mL棕色容量瓶中，定容，在冰箱中保存。每星期標(biāo)定1次。標(biāo)定：取5ml已知濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1％草酸溶液5ml，搖勻，用2，6—二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉紅色，在15s不褪色為終點(diǎn)。

維生素的分類及生理功能課件51計(jì)算:

式中：T---每毫升染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)，mg/mL；C---抗壞血酸的濃度，mg/mL；V1---抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；V2---消耗2，6-二氯靛酚的體積，ml計(jì)算:52測(cè)定步驟

①提取:鮮樣的制備:稱100g鮮樣，加等量的2％草酸溶液，于組織搗碎機(jī)中打成勻漿。取10～40g勻漿于100ml容量瓶?jī)?nèi)，用1％草酸稀釋至刻度，混合均勻。

干樣的制備:

稱1～4g干樣放入乳缽內(nèi)加l％草酸溶液磨成勻漿，倒入100ml容量瓶中，用1％草酸稀釋至刻度。過濾上述樣液，不易過濾的可用離心機(jī)沉淀后，傾出上清液過濾備用。

測(cè)定步驟①提取:53②滴定：

吸取5～10ml濾液，快速用2,6-二氯靛酚溶液滴定，直到紅色不能立即消失，而后再盡快地一滴一滴的加入（樣品中可能存在其他還原性雜質(zhì)，但一般雜質(zhì)還原染料的速度均比抗壞血酸慢），以呈現(xiàn)的粉紅色在15s內(nèi)不消失為終點(diǎn)。同時(shí)做空白。

維生素的分類及生理功能課件54

③結(jié)果計(jì)算式中：x---樣品中抗壞血酸含量，mg/100g；T---1mL染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mg/mL；V--滴定樣液時(shí)消耗染料的體積，mL；V0---滴定空白時(shí)消耗染料的體積，mL；m---滴定時(shí)所取濾液中樣品的質(zhì)量，g。③結(jié)果計(jì)算55說明

①所有試劑最好用重蒸餾水配制。②樣品采取后，應(yīng)浸泡在已知量的2%草酸溶液中，以防止維生素C氧化損失。操作過程要迅速，防止抗壞血酸被氧化。③若測(cè)動(dòng)物性樣品，須用10%三氯乙酸代替2%草酸溶液提取。④若樣品濾液顏色較深，影響滴定終點(diǎn)觀察，可加入白陶土再過濾，過濾后要迅速滴定。⑤若樣品中含有Fe2+、Cu2+、Sn2+、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等還原性雜質(zhì)時(shí)，會(huì)使結(jié)果偏高。說明①所有試劑最好用重蒸餾水配制。56（二）2，4二硝基苯肼比色法原理

總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸，樣品中還原型抗血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4-二硝基苯肼生成紅色的脎，在濃硫酸的脫水作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)榻奂t色的無水化合物—雙-2，4-二硝基苯肼，在濃硫酸中顯色穩(wěn)定，吸光度的大小與總抗壞血酸含量成比，進(jìn)行比色定量。

（二）2，4二硝基苯肼比色法原理57操作過程：

樣品處理→氧化→呈色→硫酸處理→比色→數(shù)據(jù)處理

（1）樣品制備：同2，6-二氯靛酚滴定法

（2）氧化處理：取25mL上述濾液，加入2g活性炭，振搖lmin，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10mL此氧化提取液，加入10mL20g/L的硫脲溶液，混勻。操作過程：58（3）呈色反應(yīng)：

于三個(gè)試管中各加入4mL經(jīng)氧化的樣品稀釋液,一個(gè)試管作為空白，在其余試管中加入1.0mL20g/L2，4-二硝基苯肼溶液，將所有試管放入（37士0.5）℃恒溫箱或水浴中，保溫3h。3h后取出，除空白管外，將所有試管放入冰水中?？瞻坠芾涞绞覝?，然后加入1.0mL20g/L2,4-二硝基苯肼溶液，在室溫中放置10～15min后放入冰水內(nèi)。其余步驟同樣品。維生素的分類及生理功能課件59（4）硫酸（9＋1）處理

當(dāng)試管放入冰水后，向每一試管中加入5mL硫酸（9十1）滴加時(shí)間至少需要1min，（防止溶液溫度升高而使部分有機(jī)物分解著色，影響空白值），需邊加邊搖動(dòng)試管。將試管自冰水中取出，在室溫放置30min后比色。（5）比色用1cm比色杯，以空白液調(diào)零點(diǎn)，于500nm波長(zhǎng)測(cè)吸光值。（4）硫酸（9＋1）處理60

(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制①加2g活性炭于50ml標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/mL）中，搖動(dòng)1min，過濾。②取10mL濾液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用10g/L的草酸溶液稀釋至刻度，抗壞血酸濃度20μg/mL。

③取5、10、20、25、40、50、60ml稀釋液，分別放入7個(gè)100ml容量瓶中，用10g/L硫脲溶液稀釋至刻度，使最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為1、2、4、5、8、10、12μg/mL。④按樣品測(cè)定步驟進(jìn)行顯色反應(yīng)并比色。⑤以吸光值為縱坐標(biāo)，以抗壞血酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制61計(jì)算式中

X---總抗壞血酸含量，mg/100g；ρ---由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得“樣品氧化液”中總抗壞血酸的濃度μg/mLV---試樣用10g/L草酸溶液定容的體積，ml；F---樣品氧化處理過程中的稀釋倍數(shù)；

m---試樣質(zhì)量（10g/L草酸溶液定容后的溶液中試樣的質(zhì)量），g。計(jì)算62說明（1）本法為國家標(biāo)準(zhǔn)方法，適用于蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測(cè)定。（2）活性炭對(duì)抗壞血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧進(jìn)行界面反應(yīng)，加入量過低，氧化不充分，測(cè)定結(jié)果偏低，加入量過高，對(duì)抗壞血酸有吸附作用，使結(jié)果也偏低。（3）硫脲可防止抗壞血酸繼續(xù)氧化，同時(shí)促進(jìn)脎的形成。最后溶液中硫脲的濃度要一致，否則影響測(cè)定結(jié)果。維生素的分類及生理功能課件63（4）試管從冰浴中取出后，因糖類的存在造成顯色不穩(wěn)定，顏色會(huì)逐漸加深，30min后影響將減小，故在加入9+1的硫酸后30min后準(zhǔn)時(shí)比色。（5）測(cè)定波長(zhǎng)一般在495～540nm，樣品雜質(zhì)多時(shí)在540nm較合適，但靈敏度較最大吸收波長(zhǎng)（520nm）下的靈敏度降低30％維生素的分類及生理功能課件64HPLC法測(cè)定樣品中VC含量?jī)?yōu)點(diǎn)：選擇性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)單。樣品處理：液體樣品可過濾后直接進(jìn)樣；固體樣品可用草酸或偏磷酸浸泡或經(jīng)澄清處理后進(jìn)樣。推薦色譜條件：氨基柱或反相離子交換柱流動(dòng)相：甲醇-水（5+95）流速：1.5mL/min

波長(zhǎng)：254nmHPLC法測(cè)定樣品中VC含量?jī)?yōu)點(diǎn)：選擇性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)65作業(yè)：測(cè)定維生素A時(shí)，為什么要用皂化法處理樣品？維生素A和維生素C的測(cè)定中，樣品處理和提取有何不同之處？為什么？繼續(xù)練習(xí)滴定法測(cè)定維生素C作業(yè)：664.7維生素的測(cè)定

概述脂溶性維生素A、E的測(cè)定水溶性維生素B、C的測(cè)定4.7維生素的測(cè)定概述674.7.1概述（1）維生素的分類及生理功能（2）測(cè)定的目的和意義（3）維生素的測(cè)定方法4.7.1概述（1）維生素的分類及生理功能68

（1）維生素的分類及生理功能功能：

維生素是維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類小分子有機(jī)化合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多。目前已經(jīng)確認(rèn)的有30多種，其中有20種被認(rèn)為與維持人體健康和促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育是至關(guān)重要的。主要是通過作為輔酶的成分調(diào)節(jié)代謝過程，人體對(duì)它的需要量極少，但作用非常大。一般在體內(nèi)不能合成或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝??；長(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相關(guān)新陳代謝的紊亂，出現(xiàn)各種特有的癥狀。（1）維生素的分類及生理功能功能：69分類：按溶解性能可將它們分成兩大類：一類是能溶在脂肪或脂溶性溶劑中的，叫脂溶性維生素（如A、D、E、K等）；另一類是能溶解在水中的，叫水溶性維生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。分類：70（2）測(cè)定的目的和意義

可評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值；開發(fā)利用富含維生素的食品；多數(shù)維生素的性質(zhì)不穩(wěn)定，常常作為強(qiáng)化劑在食品工業(yè)的某些產(chǎn)品中使用?？梢匝芯渴称吩诓煌募庸?、儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性，進(jìn)而指導(dǎo)人們制定合理的工藝條件，減少維生素的損失；起到監(jiān)督維生素強(qiáng)化食品的劑量，以防攝入過多的維生素而引起中毒。（2）測(cè)定的目的和意義可評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值；71

（3）維生素的測(cè)定方法微生物法：基于某種微生物生長(zhǎng)需要特定的維生素，方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、不需要特殊儀器，樣品不需經(jīng)特殊處理，但只能測(cè)定水溶性維生素。化學(xué)法：比色法、滴定法儀器法：色譜法、熒光法、酶法、免疫法等。特別是HPLC可用于大多數(shù)維生素的測(cè)定，并且在某些條件下可同時(shí)分析幾種維生素，但分析費(fèi)用較高。

應(yīng)根據(jù)不同的食品基質(zhì)和條件選擇不同的分析方法（3）維生素的測(cè)定方法72重點(diǎn)講解的方法：高效液相色譜法（HPLC法）同時(shí)測(cè)定脂溶性維生素A和維生素E比色法測(cè)定維生素AHPLC法測(cè)定胡蘿卜素滴定法和比色法測(cè)定維生素C熒光法測(cè)定B1、B2重點(diǎn)講解的方法：734.7.2維生素A、E的測(cè)定—HPLC法

（GB/T5009.82)以乳粉為樣品演示樣品的預(yù)處理和HPLC的使用VA的性質(zhì)：維生素A是β-紫羅酮環(huán)與一元醇所組成的一類化合物及其衍生物的總稱。通常所說的維生素A是指視黃醇或視黃醇醋酸酯。⑴因有許多不飽和鏈，故見光易分解；⑵在缺氧情況下，對(duì)熱較穩(wěn)定，對(duì)光特別敏感。測(cè)定速度要快。⑶不溶于水，溶于有機(jī)溶劑，對(duì)堿穩(wěn)定4.7.2維生素A、E的測(cè)定—HPLC法

74VE的性質(zhì)：又稱生育酚，目前已經(jīng)確認(rèn)的有8種異構(gòu)體，最常見的有α、β、γ、δ-生育酚。溶于脂溶性溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，酸性環(huán)境中比堿性環(huán)境中穩(wěn)定，無氧條件下，對(duì)熱、光及堿性環(huán)境中也相對(duì)穩(wěn)定。VE廣泛分布在各種糧食的胚和植物油中。VE的性質(zhì)：又稱生育酚，目前已經(jīng)確認(rèn)75測(cè)定原理：（1）液相色譜的原理：液相色譜是采用液體為流動(dòng)相的一種色譜法。高效液相色譜儀由高壓泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器、記錄和數(shù)據(jù)處理裝置等部分組成。高壓泵以恒定的流量，從貯液容器吸取作為流動(dòng)相的溶劑輸送到色譜柱，試樣由進(jìn)樣裝置導(dǎo)入，隨流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離。分離后的組分進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)，并用記錄儀繪出色譜圖，或與其他數(shù)據(jù)處理裝置相連，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理

色譜圖：某一波長(zhǎng)下各個(gè)不同時(shí)刻的吸光度值描點(diǎn)作圖。測(cè)定原理：76（2）高效液相色譜檢測(cè)樣品中的維生素A、E的原理：樣品中的維生素E及維生素A經(jīng)皂化提取處理后，將其從不皂化部分提取至有機(jī)溶劑中。用高效液相色譜法C18反相柱將維生E和維生素A分離，經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，并用內(nèi)標(biāo)法定量維生素的分類及生理功能課件77(3）什么是內(nèi)標(biāo)法？

取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分，按依次增加或減少的已知階段量，各自分別加入各單體所規(guī)定的定量?jī)?nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，調(diào)制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取此標(biāo)準(zhǔn)液的一定量注入色譜柱，根據(jù)色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高的比例為縱坐標(biāo)，取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量之比或標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

然后按單體中所規(guī)定的方法調(diào)制試樣液，調(diào)制試樣液時(shí)，預(yù)先加入與調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)溶液等量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，然后按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的同樣條件下得出色譜圖，求出被測(cè)成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高之比，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線來求出被測(cè)成分的含量。(3）什么是內(nèi)標(biāo)法？78

內(nèi)標(biāo)物的選取原則：能與被測(cè)成分完全分離，但其保留時(shí)間又盡可能接近被測(cè)成分的穩(wěn)定的物質(zhì)。維生素的分類及生理功能課件79

試劑（1）無水乙醚：不含有過氧化物。（2）無水乙醇：不得含有醛類物質(zhì)。（3）無水硫酸鈉。（4）甲醇：重蒸后使用。（5）重蒸水：水中加少量高錳酸鉀，臨用前蒸餾。（6）抗壞血酸溶液（100g／L）：臨用前進(jìn)行配制。（7）氫氧化鉀溶液（50g／100g）：取50g氫氧化鉀,溶于50g水中，混勻

80

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（1）維生素A標(biāo)準(zhǔn)液：視黃醇（純度85％）或視黃醇乙酸酯（純度90％）經(jīng)皂化處理后使用。用脫醛乙醇溶解維生素A標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為lmg/mL。臨用前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。（2）維生素E標(biāo)準(zhǔn)液：a-生育酚（純度95％），γ-生育酚（純純95％），δ-生育酚（純度95％）。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為lmg/mL,臨用前用紫外分光光度法分別標(biāo)定此三種維生素E的準(zhǔn)確濃度。（3）內(nèi)標(biāo)溶液：稱取苯并芘（純度98％），用脫醛乙醇配制成10ug/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制81儀器和設(shè)備（1）高效液相色譜儀帶紫外分光檢測(cè)器。（2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。（3）高速離心機(jī)（帶小塑料離心管）（4）高純氮?dú)?。?）紫外分光光度計(jì)。維生素的分類及生理功能課件82

樣品處理：

皂化→提取→洗滌→濃縮→

定容

樣品處理：83（1）皂化：稱取適量樣品于三角瓶中，加30mL無水乙醇，振搖使樣品分散。加入5mL100g/L抗壞血酸溶液和2.0mL苯并芘內(nèi)標(biāo)液，混勻，加10mL氫氧化鉀溶液，沸水回流30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷卻。

思考：皂化時(shí)加入Vc的作用是什么？（1）皂化：84

（2）提?。?/p>

將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50mL水分2-3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL無水乙醚分2次洗皂化瓶及殘?jiān)?，乙醚液并入分液漏斗中。輕輕振搖2min，靜置分層，棄去水層。維生素的分類及生理功能課件85(3)洗滌：每次用約50mL水將乙醚液洗至中性，需洗4~5次(3)洗滌：86（4）濃縮：

將乙醚提取液經(jīng)無水硫酸鈉（約5g）濾入150mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，用約15mL乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次，并入蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，醚剩下約2mL時(shí)，取下蒸發(fā)瓶。維生素的分類及生理功能課件87（5）定容：

用氮?dú)獯蹈梢颐?，隨即加入2mL乙醇，充分混合，溶解提取物。5000r/min離心5min，上清液供色譜分析用。（5）定容：88液相色譜推薦條件：分析柱：C18反相柱5μm，4.6mm×25Cm；流動(dòng)相：甲醇：水=98：2，混勻，臨用前脫氣；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：300nm;進(jìn)樣量：20μL；流速：1.70mL/min。

維生素的分類及生理功能課件89標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（1）維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：取上述配制的維生素A、E的標(biāo)準(zhǔn)溶液按一定的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，在下表要求的條件下測(cè)定其吸光度，根據(jù)其吸光系數(shù)計(jì)算其準(zhǔn)確濃度。標(biāo)準(zhǔn)比吸光系數(shù)E(1%,cm)測(cè)定波長(zhǎng)（nm）視黃醇1835325γ-生育酚71294δ-生育酚92.8298a-生育酚91.2298標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)比吸光系數(shù)E(1%,cm)測(cè)定波長(zhǎng)90標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計(jì)算：

p---某維生素濃度，mg/mL；A---維生素的平均紫外吸光值；E---某種維生素l％比吸光系數(shù);F---稀釋倍數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計(jì)算：91（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:

本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量。把高、低兩個(gè)濃度的維生素A、γ-生育酚、a-生育酚、δ-生育酚及內(nèi)標(biāo)苯并芘液混合，（其內(nèi)標(biāo)苯并芘的濃度值相同）將二種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見色譜圖。以維生素峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，維生素的濃度(ug/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。維生素的分類及生理功能課件92維生素的分類及生理功能課件93樣品分析：取樣品處理液20μl，用標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣的條件進(jìn)行色譜分析，繪制色譜圖。定性：根據(jù)保留時(shí)間定性定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，以此比值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測(cè)維生素的含量。維生素的分類及生理功能課件94計(jì)算：式中：X---某種維生素的含量，mg/100g；P---由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的某種維生素含量，μg/mL；V---樣品濃縮后定容體積，ml；m--樣品質(zhì)量，g。計(jì)算：95說明及討論

（1）維生素極易被光破壞，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在微弱光線下進(jìn)行，或使用棕色玻璃儀器。（2）乙醚為溶劑的萃取體系，易發(fā)生乳化現(xiàn)象。在提取、洗滌操作中，不要用力過猛，若發(fā)生乳化，可加幾滴乙醇破乳。（3）本法是國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，適用于各種食物和飼料中維生素A和維生素E的同時(shí)測(cè)定。（4）本法不能將β-生育酚γ-生育酚分開，所以γ-生育酚的色譜峰中含有β-生育酚。

說明及討論96IU（國際單位）與質(zhì)量的換算1IUVa=0.33μg1IUβ-胡蘿卜素=0.6μg1UgVd=40IU1IUVd=0.025μg1IU維生素D=0.025ug維生素D31IUVe=1mgVe(DL-a-生育酚醋酸酯)1mgDL-a-生育酚=1.1IUVe1mgD-a-生育酚=1.49IUVe1mgD-a-生育酚醋酸酯=1.36IUVeIU（國際單位）與質(zhì)量的換算1IUVa=0.33μg97

4.7.3維生素A的測(cè)定（三氯化銻比色法）

原理：VA+三氯化銻→藍(lán)色物質(zhì)，于620nm測(cè)吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。

試劑：無水Na2SO4、乙酸酐：吸水乙醚：抽提乙醇、KOH：皂化反應(yīng)三氯甲烷：溶劑三氯化銻-三氯甲烷：反應(yīng)試劑酚酞：用于鑒別洗滌液中有無堿4.7.3維生素A的測(cè)定（三氯化銻比色法）98步驟：（1）預(yù)處理：皂化、提取、洗滌、濃縮（2）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：用VA標(biāo)準(zhǔn)液繪制，用CHCl3調(diào)零。注意在移入光路前，迅速加入三氯化銻，6秒內(nèi)測(cè)定(3)樣品測(cè)定：用樣品溶液代替標(biāo)準(zhǔn)液溶液。

維生素的分類及生理功能課件99說明(1)萃取時(shí),不要用力過猛，避免發(fā)生乳化。（2）氯仿中必須無水，因三氯化銻遇水會(huì)出現(xiàn)沉淀，干擾比色測(cè)定。（3）由于三氯化銻與VA所產(chǎn)生的蘭色物質(zhì)不穩(wěn)定，注意在移入光路前，迅速加入三氯化銻，6秒內(nèi)測(cè)定。（4）三氯化銻腐蝕性強(qiáng)，且遇水生成白色沉淀，實(shí)驗(yàn)用過的儀器要先用稀鹽酸浸泡后再清洗。維生素的分類及生理功能課件100植物油中VE的測(cè)定（文獻(xiàn)方法）樣品處理：準(zhǔn)確稱取1g左右的樣品用25mL丙酮溶解。儀器條件：流動(dòng)相：乙腈+甲醇=80+20流速：1.2ml/min色譜柱：C18反相柱波長(zhǎng)：298nm此法可以同時(shí)測(cè)定γ-生育酚、a-生育酚、δ-生育酚植物油中VE的測(cè)定（文獻(xiàn)方法）樣品處理：準(zhǔn)確稱取1g1014.7.4β-胡蘿卜素的測(cè)定（HPLC法）試樣中的β-胡蘿卜素，用石油醚+丙酮混合液提取，經(jīng)三氧化鋁柱純化，然后以高效液相色譜法測(cè)定，以保留時(shí)間定性，以峰高或峰面積定量。注意：濃縮提取液時(shí)，防止蒸干，避免胡蘿卜素在空氣中氧化或因高溫、紫外線直射等破壞。4.7.4β-胡蘿卜素的測(cè)定（HPLC法）試樣中的β-胡蘿1024.7.5維生素B1的測(cè)定—熒光法(GB/T5009.84)原理：硫胺素（VB1）在堿性鐵氰化鉀溶液中被氧化為嘧噻色素，在紫外線照射下，嘧噻色素發(fā)出熒光。在給定條件下，以及沒有其他熒光物質(zhì)干擾時(shí)，熒光強(qiáng)度與嘧噻色素成正比，即與溶液中硫胺素量成正比。試樣在硫酸作用下，加熱提取VB1，冷卻后用淀粉酶處理使VB1分離，然后以所得溶液做測(cè)定。測(cè)定步驟：提取(水解、酶解）→凈化→氧化→測(cè)定水解、酶解的作用:使結(jié)合態(tài)VB1變?yōu)橛坞x態(tài)VB14.7.5維生素B1的測(cè)定—熒光法(GB/T5009.103維生素B1的測(cè)定—HPLC法維生素B1通常采用反相鍵合相色譜法進(jìn)行分離，利用紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。利用熒光檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)，應(yīng)首先使從樣品中提取的維生素B1氧化成硫色素，然后轉(zhuǎn)入正丁醇或異丁醇中，再進(jìn)行HPLC分析。維生素B1的測(cè)定—HPLC法維生素B1通常采用反相鍵合相色譜1044.7.6維生素B2的測(cè)定——熒光法原理：試樣在稀鹽酸中水解、酶解，調(diào)整PH值，過濾除去蛋白質(zhì)等物質(zhì)；試樣溶液經(jīng)高錳酸鉀氧化，除去干擾物，再經(jīng)硅鎂吸附劑的柱層析，提純的核黃素在波長(zhǎng)525nm下發(fā)生黃綠色熒光，在稀溶液中其熒光強(qiáng)度與核黃素的濃度成正比。再加入低亞硫酸鈉，將VB2還原成無熒光的物質(zhì)，然后再測(cè)定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光，兩者相差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。測(cè)定核黃素的方法還有：微生物法和HPLC法。4.7.6維生素B2的測(cè)定——熒光法原理：試樣在稀鹽酸中水105維生素的分類及生理功能課件1064.7.7維生素C（抗壞血酸）的測(cè)定

維生素C的生理功能及性質(zhì)維生素C是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱作抗壞血酸。維生素C具有較強(qiáng)的還原性，對(duì)光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進(jìn)一步水解則生成2，3-二酮古樂糖酸，失去生理作用。在食品中，這三種形式均有存在，但主要是前兩者，故許多國家的食品成分表均以抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量表示。4.7.7維生素C（抗壞血酸）的測(cè)定維生素C的生理功能及107還原型維生素C有強(qiáng)還原性，有抑制多酚氧化酶作用，故常添加于啤酒、果汁等食品中作抗氧化劑。在新鮮的水果蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、獼猴桃、柑橘等食品中含量尤為豐富。維生素的分類及生理功能課件108維生素C的測(cè)定方法2，6—二氯靛酚滴定法2，4—二硝基苯肼比色法熒光法高效液相色譜法維生素C的測(cè)定方法109（1）2，6—二氯靛酚滴定法測(cè)定的是還原型抗壞血酸的含量該方法簡(jiǎn)便、靈敏，但特異性差，樣品中的其他還原性物質(zhì)（如鐵離子、銅離子等）會(huì)干擾測(cè)定，使結(jié)果偏高，對(duì)色深樣液的滴定終點(diǎn)不易辨別。（1）2，6—二氯靛酚滴定法110（2）2，4—二硝基苯肼比色法和熒光法測(cè)得的是抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。

苯肼法操作復(fù)雜，特異性差，易受共存物質(zhì)的影響；熒光法受干擾的影響較小，結(jié)果較準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜。維生素的分類及生理功能課件111（3）高效液相色譜法可以同時(shí)測(cè)得抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的含量。

具有干擾少，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，靈敏、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，是上述幾種方法中最先進(jìn)、可靠的方法。但分析成本較高。主要介紹維生素C常用的測(cè)定方法2，6—二氯靛酚滴定法、苯肼比色法（3）高效液相色譜法112（一）2，6-二氯靛酚滴定法以新鮮果蔬為樣品進(jìn)行講解和演示原理：

還原型抗壞血酸可以還原染料2，6—二氯靛酚。該染料在酸性溶液中是粉紅色（在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色），被還原后顏色消失；還原型抗壞血酸還原染料后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時(shí)，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)染料液的量，與樣品中抗壞血酸含量成正比。

（一）2，6-二氯靛酚滴定法以新鮮果蔬為樣品進(jìn)行講解和演示113試劑

①1%草酸溶液②2%草酸溶液③抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液④2，6—二氯靛酚溶液⑤0.001mol/L碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取干燥的碘酸鉀0.3567g，用水稀釋至100ml，取出1ml，用水稀至100ml，此溶液1ml相當(dāng)于抗壞血酸0.088mg。⑥1%淀粉溶液⑦6%碘化鉀溶液試劑114抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)定：

配制：準(zhǔn)確稱取20mg抗壞血酸，溶于1％的草酸中，并稀釋至100ml，置冰箱中保存。用時(shí)取出5ml，置于50ml容量瓶中，用1％草酸溶液定容，配成0.02mg/ml的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)定：吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液5ml于三角瓶中，加入6％碘化鉀溶液0.5ml、1％淀粉溶液3滴，以0.00lmol/L碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，終點(diǎn)為淡藍(lán)色。維生素的分類及生理功能課件115C---抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/mL；V1---滴定時(shí)消耗0.001mol/L碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2---滴定時(shí)所取抗壞血酸的體積，mL；0.088---lmL0.001mol碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于抗壞血酸的量，mg/mL維生素的分類及生理功能課件1162，6-二氯靛酚溶液的配制和標(biāo)定

配制：稱取2，6—二氯靛酚50mg，溶于200mL含有52mg碳酸氫鈉的熱水中，待冷，置于冰箱中過夜。次日過濾于250mL棕色容量瓶中，定容，在冰箱中保存。每星期標(biāo)定1次。標(biāo)定：取5ml已知濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1％草酸溶液5ml，搖勻，用2，6—二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉紅色，在15s不褪色為終點(diǎn)。

維生素的分類及生理功能課件117計(jì)算:

式中：T---每毫升染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)，mg/mL；C---抗壞血酸的濃度，mg/mL；V1---抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；V2---消耗2，6-二氯靛酚的體積，ml計(jì)算:118測(cè)定步驟

①提取:鮮樣的制備:稱100g鮮樣，加等量的2％草酸溶液，于組織搗碎機(jī)中打成勻漿。取10～40g勻漿于100ml容量瓶?jī)?nèi)，用1％草酸稀釋至刻度，混合均勻。

干樣的制備:

稱1～4g干樣放入乳缽內(nèi)加l％草酸溶液磨成勻漿，倒入100ml容量瓶中，用1％草酸稀釋至刻度。過濾上述樣液，不易過濾的可用離心機(jī)沉淀后，傾出上清液過濾備用。

測(cè)定步驟①提取:119②滴定：

吸取5～10ml濾液，快速用2,6-二氯靛酚溶液滴定，直到紅色不能立即消失，而后再盡快地一滴一滴的加入（樣品中可能存在其他還原性雜質(zhì)，但一般雜質(zhì)還原染料的速度均比抗壞血酸慢），以呈現(xiàn)的粉紅色在15s內(nèi)不消失為終點(diǎn)。同時(shí)做空白。

維生素的分類及生理功能課件120

③結(jié)果計(jì)算式中：x---樣品中抗壞血酸含量，mg/100g；T---1mL染料溶液相當(dāng)于抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mg/mL；V--滴定樣液時(shí)消耗染料的體積，mL；V0---滴定空白時(shí)消耗染料的體積，mL；m---滴定時(shí)所取濾液中樣品的質(zhì)量，g。