實時熒光定量PCR原理和實驗課件

實時熒光定量PCR原理和實驗

.實時熒光定量PCR原理和實驗

.1我們都知道理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線并不是標準的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環(huán)的增多，擴增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進入了平臺期。由于各種環(huán)境因素的復雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重復實驗，各種條件基本一致,最后得到的DNA拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動很大。為什么終點定量不準確？

.我們都知道理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的PCR2為什么不選普通PCR?對于絕大多數(shù)實驗，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測等,需要測定的都是PCR放大之前標本中的DNA原始拷貝數(shù),經(jīng)過PCR擴增以后的DNA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實情況。在這種情況下，就不能采用終點定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起始拷貝的數(shù)量。傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素摻入標記后的光密度掃描等，測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。.為什么不選普通PCR?.3熒光定量PCR的優(yōu)勢在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學物質(zhì),隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。該技術(shù)借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。.熒光定量PCR的優(yōu)勢在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一4CT值與模板DNA的關(guān)系

一般地，我們有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是說第n次PCR循環(huán)時的熒光信號強度(Rn)等于背景信號強度(RB)加上每個分子的熒光強度(即單位熒光強度，RS)與分子數(shù)目的乘積。當循環(huán)次數(shù)n=CT時，則有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。兩邊取對數(shù)，得log(RT-RB)=logX0

+CTlog(1+Ex)+logRs。整理此式，CTlog(1+Ex)=-logX0

+log(RT-RB)–logRs。

Ct=-klgX0+b.CT值與模板DNA的關(guān)系

一般地，我們有Rn=RB+XO(15CT值的確定

基線:在PCR的最初幾個循環(huán)中，熒光信號是幾乎不變的，這確定了擴增圖中的基線。基線范圍的定義是從第3個循環(huán)起到CT值前3個循環(huán)止，一般取第3到第15個循環(huán)之間。在這些初始的循環(huán)中，我們看到的其實是反應(yīng)的熒光背景。

Rn（Normalizedreporter）:是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。

△Rn:是Rn扣除基線后得到的標準化結(jié)果（△Rn=Rn–基線）。

閾值:

用于確定實時定量分析中的CT值的某個△Rn水平。一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環(huán)熒光信號標準差的10倍，這個水平設(shè)定得比基線高，又在擴增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)足夠低。

閾值循環(huán)（CT）：熒光穿過閾值時的循環(huán)數(shù),即閾值與擴增曲線的交叉點。

.CT值的確定

基線:在PCR的最初幾個循環(huán)中，熒光信號是幾乎6顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質(zhì)量，CT值是一個完全客觀的參數(shù)。CT值越小，模板DNA的起始拷貝數(shù)越多；CT值越大，模板DNA的起始拷貝數(shù)越少。正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。.顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質(zhì)量7實驗方案的設(shè)計根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量兩種。典型的相對定量如比較經(jīng)過不同方式處理的兩個樣本中基因表達水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對定量則需要使用標準曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBRGreenI熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴格，所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實驗設(shè)計更為簡便。在選擇實驗方案時要根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯?shù)據(jù)精度的要求來決定。.實驗方案的設(shè)計根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對8

TaqMan探針技術(shù)原理

TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。.

TaqMan探針技術(shù)原理

TaqMan探針法是高度特異9

TaqMan探針根據(jù)其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqManMGB探針。MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-FluorescentQuencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。實驗證明，TaqManMGB探針對于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。TaqManMGB探針

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TaqMan探針根據(jù)其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩10SYBRGreenI熒光染料技術(shù)原理

SYBRGreenI熒光染料技術(shù)原理SYBRGreenI是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖6）。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBRGreen熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當SYBRGreen染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBRGreen染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。.SYBRGreenI熒光染料技術(shù)原理

SYBRGree11數(shù)據(jù)的校正定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統(tǒng)計學要求并對數(shù)據(jù)進行嚴格的校正，以消除偶然誤差。因此重復實驗和設(shè)立內(nèi)對照非常重要。由于各種各樣的客觀原因，這一點在實踐中往往被輕視或忽視，需要著重強調(diào)。當然，與定性實驗一樣，定量PCR也要設(shè)立陰性和陽性對照，以監(jiān)控試劑和實驗操作方面可能出現(xiàn)的問題。.數(shù)據(jù)的校正定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統(tǒng)計學要求并12重復實驗和陰性對照

定量實驗，誤差是不可避免的。設(shè)立重復實驗，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，可以將誤差降低到最小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復3次以上，嚴格的定量更應(yīng)當重復6～8次，以滿足小樣本統(tǒng)計的要求。

陰性對照中不加模板DNA，而以水或緩沖液代替，用于檢驗是否存在PCR污染。.重復實驗和陰性對照定量實驗，誤差是不可避免的。設(shè)立重復實驗13實時熒光定量RT—PCR內(nèi)參基因的選擇

由于內(nèi)參基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組的數(shù)量。內(nèi)參基因擴增中的變化可以反映RNA產(chǎn)量、質(zhì)量和／或cDNA合成效率的變化。選擇適當?shù)膬?nèi)參基因以減少檢測標本間的差異是必須的。內(nèi)參基因一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。核酸提取時通常以重量或體積為單位取樣，再加上提取效率和操作誤差，造成等量提取物不一定來源于等量細胞（或基因組）。將定量結(jié)果校正為以細胞（或基因組）為單位，不同樣品之間才具有可比性。.實時熒光定量RT—PCR內(nèi)參基因的選擇核酸提取時通常142003年10月：喬布斯被檢查出胰腺癌。2004年，喬布斯接受了腫瘤切除手術(shù)。實時熒光定量PCR實驗—ΔΔCT法

蘋果前CEO史蒂夫·喬布斯逝世。讓我們一起悼念這位“改變世界的天才”！.2003年10月：喬布斯被檢查出胰腺癌。實時熒光定量PCR實15用什么方法來檢測?藥物對腫瘤細胞的影響:檢測相關(guān)基因的表達是否發(fā)生了變化(EGR3、MAOB、OGDH、OSGEP、SERPING1）

.用什么方法來檢測?藥物對腫瘤細胞的影響:檢測相關(guān)基因的表達是16

RNAcDNA擴增產(chǎn)物細胞裂解逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)定量PCR反應(yīng)untreatedtreated

RNAcDNA擴增產(chǎn)物細胞裂解逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)定量PCR反應(yīng)基因表達(geneexpression)是指細胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子GeneRNA蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)錄翻譯(cDNA)對擴增產(chǎn)物進行定量，擴增產(chǎn)物的變化體現(xiàn)了RNA的變化逆轉(zhuǎn)錄.RNAcDNA17實驗方案的設(shè)計定量PCR絕對定量相對定量相對標準曲線??CT.實驗方案的設(shè)計定量PCR絕對定量相對定量相對標準曲線??CT18??CT實驗的設(shè)計目的基因、內(nèi)參基因、參照樣本、重復反應(yīng)孔

??CT實驗的設(shè)計選擇PCR方法選擇化學方法：選擇RT方法選擇探針和引物TaqMan或SYBRGreenIdye指明??CT實驗中組成部分:.??CT實驗的設(shè)計目的基因、內(nèi)參基因、參照樣本、重復反應(yīng)孔19DesigntheComparativeCTExperimentPreparetheReactions.

Preparethereactionplate.AnalyzetheComparativeCTExperiment

.RuntheExperimentPreparethetemplatePreparethesampledilutionsPreparethereactionmixforeachtargetassayPreparefortherunEnablethenotificationsettingsStarttherunMonitortherunUnloadtheinstrumentViewtheGeneExpressionPlotandWellViewtheAmplificationPublishtheData

theComparativeCTExperimentworkflow

.DesigntheComparativeCTExpe20RT反應(yīng)的操作RT反應(yīng)提取RNA將提取的總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA:反轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒提取RNARNA的濃度:A260/A280在1.9左右總RNA的質(zhì)量RNA的完整性:瓊脂糖凝膠電泳總RNA初始濃度的調(diào)節(jié):50ng/μL.0h12h24h48hRNARNARNARNA.RT反應(yīng)的操作RT反應(yīng)提取RNA將提取的總RNA轉(zhuǎn)化為cDN21ComponentμL/ReactionμL/21Reactionsa10?ReverseTranscriptionBuffer1021025?dNTPs48410?randomprimers10210MultiScribe?ReverseTranscriptase,50U/μL5105Nuclease-freewater21441Totalperreaction5010501.準備RTmastermix

2.RT反應(yīng)體系50μLoftheRTmastermix30μLofnuclease-freewater20μLofRNAsampleStepTypeTimeTemperatureHOLD10min25°CHOLD120min37°CHOLD5sec85°C

3.Programthethermalcycler.Component22樣品的稀釋SampleNameStockConcentration(ng/μL)SampleVolume(μL)DiluentVolume(μL)TotalVolumeofDilutedSample(μL)0h100.066.066.0132.012h100.066.066.0132.024h100.066.066.0132.048h100.066.066.0132.0Thestocksampleconcentrationis100ng/μL.AfterdilutingthesampleaccordingtotheSampleDilutionsCalculationstable,thesamplehasaconcentrationof50ng/μL.Adding5μLatthisconcentrationtothefinalreactionmixvolumeof50μLyieldsa1?concentrationinthefinalreaction..樣品的稀釋SampleStockConcentratio23配制PCR反應(yīng)mixComponentVolume(μL)for1ReactionMasterMix(2.0?)25.0AssayMix(20.0?)2.50Water17.50TotalVolume45.0

Thereactionmixcomponentsare:–TaqMan?UniversalPCRMasterMix(2?)–18SAssayMix(20?)–EGR3AssayMix(20?)–MAOBAssayMix(20?)–OGDHAssayMix(20?)–OSGEPAssayMix(20?)–SERPING1AssayMix(20?)–Water反應(yīng)成分反應(yīng)成分的體積計算.配制PCR反應(yīng)mixComponent24Forthe18Sassay,addtherequiredcomponentstothe18SReactionMixtube:ComponentVolume(μL)for1ReactionVolume(μL)for16Reaction)TaqMan?UniversalPCRMasterMix(2?)25.0440.018SAssayMix(20?)2.544.0Water17.5308.0TotalReactionMixVolume45.0792.0TubeReactionMixReactionMixVolume(μL)SampleSampleVolume(μL)118SReactionMix198.00h22.0218SReactionMix198.012h22.0318SReactionMix198.024h22.0418SReactionMix198.048h22.0(Plus10%Excess).Forthe18Sassay,addthereq25..26ViewtheGeneExpressionPlotandWellTable.ViewtheGeneExpressionPlot27..28ViewtheAmplificationPlot

?RnvsCycle–?RnisthemagnitudeofnormalizedfluorescencegeneratedbythereporterateachcycleduringthePCRamplification.Thisplotdisplays?Rnasafunctionofcyclenumber.Youcanusethisplottoidentifyandexamineirregularamplificationandtoviewthresholdandbaselinevaluesfortherun.RnvsCycle–Rnisthefluorescencefromthereporterdyenormalizedtothefluorescencefromthepassivereference.ThisplotdisplaysRnasafunctionofcyclenumber.Youcanusethisplottoidentifyandexamineirregularamplification.CTvsWell–CTisthePCRcyclenumberatwhichthefluorescencemeetsthethresholdintheamplificationplot.ThisplotdisplaysCTasafunctionofwellposition.Youcanusethisplottolocateoutlyingamplification(outliers)..ViewtheAmplificationPlot?R29ViewtheAmplificationPlot-?RnvsCycle

.ViewtheAmplificationPlot-?30BaselineExamples.BaselineExamples.31ViewtheAmplificationPlot-?RnvsCycle.ViewtheAmplificationPlot-?32ThresholdExamples.ThresholdExamples.33ViewtheAmplificationPlot-CTvsWell

.ViewtheAmplificationPlot-C34實時熒光定量PCR原理和實驗

.實時熒光定量PCR原理和實驗

.35我們都知道理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線并不是標準的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環(huán)的增多，擴增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進入了平臺期。由于各種環(huán)境因素的復雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重復實驗，各種條件基本一致,最后得到的DNA拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動很大。為什么終點定量不準確？

.我們都知道理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的PCR36為什么不選普通PCR?對于絕大多數(shù)實驗，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測等,需要測定的都是PCR放大之前標本中的DNA原始拷貝數(shù),經(jīng)過PCR擴增以后的DNA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實情況。在這種情況下，就不能采用終點定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起始拷貝的數(shù)量。傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素摻入標記后的光密度掃描等，測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。.為什么不選普通PCR?.37熒光定量PCR的優(yōu)勢在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學物質(zhì),隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。該技術(shù)借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。.熒光定量PCR的優(yōu)勢在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一38CT值與模板DNA的關(guān)系

一般地，我們有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是說第n次PCR循環(huán)時的熒光信號強度(Rn)等于背景信號強度(RB)加上每個分子的熒光強度(即單位熒光強度，RS)與分子數(shù)目的乘積。當循環(huán)次數(shù)n=CT時，則有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。兩邊取對數(shù)，得log(RT-RB)=logX0

+CTlog(1+Ex)+logRs。整理此式，CTlog(1+Ex)=-logX0

+log(RT-RB)–logRs。

Ct=-klgX0+b.CT值與模板DNA的關(guān)系

一般地，我們有Rn=RB+XO(139CT值的確定

基線:在PCR的最初幾個循環(huán)中，熒光信號是幾乎不變的，這確定了擴增圖中的基線?；€范圍的定義是從第3個循環(huán)起到CT值前3個循環(huán)止，一般取第3到第15個循環(huán)之間。在這些初始的循環(huán)中，我們看到的其實是反應(yīng)的熒光背景。

Rn（Normalizedreporter）:是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。

△Rn:是Rn扣除基線后得到的標準化結(jié)果（△Rn=Rn–基線）。

閾值:

用于確定實時定量分析中的CT值的某個△Rn水平。一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環(huán)熒光信號標準差的10倍，這個水平設(shè)定得比基線高，又在擴增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)足夠低。

閾值循環(huán)（CT）：熒光穿過閾值時的循環(huán)數(shù),即閾值與擴增曲線的交叉點。

.CT值的確定

基線:在PCR的最初幾個循環(huán)中，熒光信號是幾乎40顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質(zhì)量，CT值是一個完全客觀的參數(shù)。CT值越小，模板DNA的起始拷貝數(shù)越多；CT值越大，模板DNA的起始拷貝數(shù)越少。正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。.顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質(zhì)量41實驗方案的設(shè)計根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量兩種。典型的相對定量如比較經(jīng)過不同方式處理的兩個樣本中基因表達水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對定量則需要使用標準曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBRGreenI熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴格，所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實驗設(shè)計更為簡便。在選擇實驗方案時要根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯?shù)據(jù)精度的要求來決定。.實驗方案的設(shè)計根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對42

TaqMan探針技術(shù)原理

TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。.

TaqMan探針技術(shù)原理

TaqMan探針法是高度特異43

TaqMan探針根據(jù)其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqManMGB探針。MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-FluorescentQuencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。實驗證明，TaqManMGB探針對于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。TaqManMGB探針

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TaqMan探針根據(jù)其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩44SYBRGreenI熒光染料技術(shù)原理

SYBRGreenI熒光染料技術(shù)原理SYBRGreenI是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖6）。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBRGreen熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當SYBRGreen染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBRGreen染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。.SYBRGreenI熒光染料技術(shù)原理

SYBRGree45數(shù)據(jù)的校正定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統(tǒng)計學要求并對數(shù)據(jù)進行嚴格的校正，以消除偶然誤差。因此重復實驗和設(shè)立內(nèi)對照非常重要。由于各種各樣的客觀原因，這一點在實踐中往往被輕視或忽視，需要著重強調(diào)。當然，與定性實驗一樣，定量PCR也要設(shè)立陰性和陽性對照，以監(jiān)控試劑和實驗操作方面可能出現(xiàn)的問題。.數(shù)據(jù)的校正定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統(tǒng)計學要求并46重復實驗和陰性對照

定量實驗，誤差是不可避免的。設(shè)立重復實驗，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，可以將誤差降低到最小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復3次以上，嚴格的定量更應(yīng)當重復6～8次，以滿足小樣本統(tǒng)計的要求。

陰性對照中不加模板DNA，而以水或緩沖液代替，用于檢驗是否存在PCR污染。.重復實驗和陰性對照定量實驗，誤差是不可避免的。設(shè)立重復實驗47實時熒光定量RT—PCR內(nèi)參基因的選擇

由于內(nèi)參基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組的數(shù)量。內(nèi)參基因擴增中的變化可以反映RNA產(chǎn)量、質(zhì)量和／或cDNA合成效率的變化。選擇適當?shù)膬?nèi)參基因以減少檢測標本間的差異是必須的。內(nèi)參基因一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。核酸提取時通常以重量或體積為單位取樣，再加上提取效率和操作誤差，造成等量提取物不一定來源于等量細胞（或基因組）。將定量結(jié)果校正為以細胞（或基因組）為單位，不同樣品之間才具有可比性。.實時熒光定量RT—PCR內(nèi)參基因的選擇核酸提取時通常482003年10月：喬布斯被檢查出胰腺癌。2004年，喬布斯接受了腫瘤切除手術(shù)。實時熒光定量PCR實驗—ΔΔCT法

蘋果前CEO史蒂夫·喬布斯逝世。讓我們一起悼念這位“改變世界的天才”！.2003年10月：喬布斯被檢查出胰腺癌。實時熒光定量PCR實49用什么方法來檢測?藥物對腫瘤細胞的影響:檢測相關(guān)基因的表達是否發(fā)生了變化(EGR3、MAOB、OGDH、OSGEP、SERPING1）

.用什么方法來檢測?藥物對腫瘤細胞的影響:檢測相關(guān)基因的表達是50

RNAcDNA擴增產(chǎn)物細胞裂解逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)定量PCR反應(yīng)untreatedtreated

RNAcDNA擴增產(chǎn)物細胞裂解逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)定量PCR反應(yīng)基因表達(geneexpression)是指細胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子GeneRNA蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)錄翻譯(cDNA)對擴增產(chǎn)物進行定量，擴增產(chǎn)物的變化體現(xiàn)了RNA的變化逆轉(zhuǎn)錄.RNAcDNA51實驗方案的設(shè)計定量PCR絕對定量相對定量相對標準曲線??CT.實驗方案的設(shè)計定量PCR絕對定量相對定量相對標準曲線??CT52??CT實驗的設(shè)計目的基因、內(nèi)參基因、參照樣本、重復反應(yīng)孔

??CT實驗的設(shè)計選擇PCR方法選擇化學方法：選擇RT方法選擇探針和引物TaqMan或SYBRGreenIdye指明??CT實驗中組成部分:.??CT實驗的設(shè)計目的基因、內(nèi)參基因、參照樣本、重復反應(yīng)孔53DesigntheComparativeCTExperimentPreparetheReactions.

Preparethereactionplate.AnalyzetheComparativeCTExperiment

.RuntheExperimentPreparethetemplatePreparethesampledilutionsPreparethereactionmixforeachtargetassayPreparefortherunEnablethenotificationsettingsStarttherunMonitortherunUnloadtheinstrumentViewtheGeneExpressionPlotandWellViewtheAmplificationPublishtheData

theComparativeCTExperimentworkflow

.DesigntheComparativeCTExpe54RT反應(yīng)的操作RT反應(yīng)提取RNA將提取的總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA:反轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒提取RNARNA的濃度:A260/A280在1.9左右總RNA的質(zhì)量RNA的完整性:瓊脂糖凝膠電泳總RNA初始濃度的調(diào)節(jié):50ng/μL.0h12h24h48hRNARNARNARNA.RT反應(yīng)的操作RT反應(yīng)提取RNA將提取的總RNA轉(zhuǎn)化為cDN55ComponentμL/ReactionμL/21Reactionsa10?ReverseTranscriptionBuffer1021025?dNTPs48410?randomprimers10210MultiScribe?ReverseTranscriptase,50U/μL5105Nuclease-freewater21441Totalperreaction5010501.準備RTmastermix

2.RT反應(yīng)體系50μLoftheRTmastermix30μLofnuclease-freewater20μLofRNAsampleStepTypeTimeTemperatureHOLD10min25°CHOLD120min37°CHOLD5sec85°C

3.Programthethermalcycler.Component56樣品的稀釋SampleNameStockConcentration(ng/μL)SampleVolume(μL)DiluentVolume(μL)TotalVolumeofDilutedSample(μL)0h100.066.066.0132.012h100.066.066.0132.024h100.066.066.0132.048h100.066.066.0132.0Thestocksampleconcentrationis100ng/μL.AfterdilutingthesampleaccordingtotheSampleDilutionsCalculationstable,thesamplehasaconcentrationof50ng/μL.Adding5μLatthisconcentrationtothefinalreactionmixvolumeof50μLyieldsa1?concentrationinthefinalreaction..樣品的稀釋SampleStockConcentratio57配制PCR反應(yīng)mixComponentVolume(μL)for1ReactionMasterMix(2.0?)25.0AssayMix(20.0?)2.50Water17.50TotalVolume45.0

Thereactionmixcomponentsare:–TaqMan?UniversalPCRMasterMix(2?)–18SAssayMix(20?)–EGR3AssayMix(20?)–MAOBAssayMix(20?)–OGDHAssayMix(20?)–OSGEPAssayMix(20?)–SERPING1AssayMix(20?)–Water反應(yīng)成分反應(yīng)成分的體積計算.配制PCR反應(yīng)mixComponent58Forthe18Sassay,addtherequiredcomponentstothe18SReactionMixtube:ComponentVolume(μL)for1ReactionVolume(μL)for16Reaction)TaqMan?UniversalPCRMasterMix(2?)25.0440.018SAssayMix(20?)2.544.0Water