干擾素的生產(chǎn)工藝課件

中文名稱：干擾素英文名稱：interferon;IFN藥物類別：抗腫瘤藥，抗病毒藥所屬類別：生物反應調(diào)節(jié)劑中文名稱：1干擾素簡介70年代中期人們發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者自身產(chǎn)生干擾素的能力低下，在應用外源性干擾素后，不僅產(chǎn)生了上述抗病毒作用，同時可以增加肝細胞膜上人白細胞組織相容性抗原的密度，促進T細胞溶解感染性肝細胞的效能.干擾素簡介70年代中期人們發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者自身產(chǎn)生干擾2現(xiàn)狀目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國產(chǎn)重組IFN－α1型和IFN－α2型，進口的干擾能（IFN－α2b）、羅擾素（IFN－α2a）、惠福仁（類淋巴母細胞干擾素）及組合干擾素等等?，F(xiàn)狀目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國產(chǎn)重組IFN－3類別各種亞型的干擾素-α（含α1或α2或α2a或α2b）療效近似；干擾素-β（IFNβ）也有相似效果，但它在肌肉組織中易被滅活。干擾素-β制劑進入血液后，穩(wěn)定性差，確切療效尚在觀察中，但可作為干擾素-α的替代制劑。類別各種亞型的干擾素-α（含α1或α2或α2a或α2b）療效4什么是干擾素（IFN）?干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘導劑，通過刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（人體免疫系統(tǒng)的一種）、巨噬細胞、淋巴細胞以及體細胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白。這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導分化作用。什么是干擾素（IFN）?干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘5干擾素的相對分子質(zhì)量小，對熱穩(wěn)定，4℃可保存很長時間，-20℃可長期保存其活性，56℃則被破壞，pH（酸堿度）2~10范圍內(nèi)干擾素不被破壞。人體自然就能產(chǎn)生干擾素，經(jīng)一定的制劑加工過程也能制造成藥物-干擾素制劑。

干擾素的相對分子質(zhì)量小，對熱穩(wěn)定，4℃可保存很長時間，-206藥理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，它一般為廣譜病毒抑制劑，對RNA和DNA病毒都有抑制作用。2.抑制細胞增殖。干擾素抑制細胞分裂的活性有明顯的選擇性，對腫瘤細胞的活性比正常細胞大500～1000倍。干擾素抗腫瘤效果可以是直接抑制腫瘤細胞增殖，或通過宿主機體的免疫防御機制限制腫瘤的生長。藥理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒73．誘導細胞凋亡：干擾素可以誘導腫瘤細胞凋亡，從而殺滅腫瘤細胞。4.干擾素對體液免疫、細胞免疫均有免疫調(diào)節(jié)作用，對巨噬細胞及NK細胞也有一定的免疫增強作用。

3．誘導細胞凋亡：干擾素可以誘導腫瘤細胞凋亡，從而殺滅腫瘤細8作用機制:干擾素不能直接滅活病毒，而是通過誘導細胞合成抗病毒蛋白（AVP）發(fā)揮效應。干擾素首先作用于細胞的干擾素受體，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導等一系列生休過程，激活細胞基因表達多種抗病毒蛋白，實現(xiàn)對病毒的抑制作用。作用機制:干擾素不能直接滅活病毒，而是通過誘導細胞合成抗病9適應癥：1.用于多種惡性腫瘤，包括毛細胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期轉(zhuǎn)移性腎癌及胰腺惡性內(nèi)分泌腫瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。2.與其他抗腫瘤藥物并用。3.作為放療、化療及手術(shù)的輔助治療劑。4.病毒性疾病的防治。適應癥：1.用于多種惡性腫瘤，包括毛細胞白血病、慢性白血病10不良反應：1.全身反應主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和不適。2.骨髓抑制在用藥中可出現(xiàn)白細胞、血小板和網(wǎng)狀紅細胞減少。不良反應：1.全身反應主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和113.局部反應部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24小時后即可消退。4.其他脫發(fā)、皮疹、血沉加快、嗜睡、一過性肝損傷。偶見過敏性休克，用藥前作過敏試驗。3.局部反應部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24小時12臨床上常用的干擾素有哪些制劑自然干擾素人體白細胞重組干擾素復合干擾素臨床上常用的干擾素有哪些制劑自然干擾素13相關(guān)藥物國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)1.α1b干擾素中國預防醫(yī)學科學院

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143.人α2b干擾素長春生物制品研究所安徽安科生物高科技有限公司(安達芬)

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3.人α2b干擾素長春生物制品研究所安徽安科生物高科15干擾素生產(chǎn)工藝路線:路線1：體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準上市產(chǎn)量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細胞來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性干擾素生產(chǎn)工藝路線:路線1：16路線2：人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準用于臨床。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點：活性低，退出臨床應用。路線2：人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：17路線3：基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程。路線3：基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:18路線4：動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表達產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點：分泌表達，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴格路線4：動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：19路線5：基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝：宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）上市產(chǎn)品：IFNα-2b/安福隆表達產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析路線5：基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝：20基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立：第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立：21第一步：干擾素α-2b基因的克隆制備白細胞，病毒誘導，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。第一步：干擾素α-2b基因的克隆制備白細胞，病毒誘導，分離m22第二步：表達載體的構(gòu)建IFN基因與表達載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽性克隆獲得序列正確表達載體第二步：表達載體的構(gòu)建IFN基因與表達載體連接23第三步：工程菌的構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種第三步：工程菌的構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿24菌種庫的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。菌種庫的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性25干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過程干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過程26搖瓶培養(yǎng)：取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。搖瓶培養(yǎng)：取保存工作種子批菌種，室溫融化27種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30℃，pH7.0?？刂疲杭壜?lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%。28發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%?？刂疲杭壜?lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點控制：OD值達9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測：發(fā)酵液雜菌檢查發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。29菌體收集：連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過12個月。檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。菌體收集：連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min30干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解預處理離心初級分離干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解311.菌體裂解：裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF。破碎－20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。1.菌體裂解：裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.322.預處理-沉淀：加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。2.預處理-沉淀：加絮凝劑聚乙烯亞胺:333.離心：連續(xù)流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。3.離心：連續(xù)流離心機：2℃～10℃，16000r/min344.初級分離：鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。4.初級分離：鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過35干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素361.溶解粗干擾素配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導值。溶解：2℃～10℃，勻漿，完全溶解。1.溶解粗干擾素配制純化緩沖液：372.沉淀與疏水層析等電點沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。等電點沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過夜2.沉淀與疏水層析等電點沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉38超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。394.陽離子交換層析與濃縮用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進行洗脫配合SDS收集干擾素峰。濃縮：10ku超濾膜進行。4.陽離子交換層析與濃縮用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）405.凝膠過濾層析洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂上樣，相同緩沖液進行洗脫。合并干擾素部分5.凝膠過濾層析洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷416.無菌過濾分裝0.22μm濾膜過濾干擾素溶液分裝－20℃以下的冰箱中保存。6.無菌過濾分裝0.22μm濾膜過濾干擾素溶液427.檢測項目干擾素鑒別試驗干擾素效價測定蛋白質(zhì)含量，純度測定，分子量宿主殘余蛋白、殘余DNA干擾素結(jié)構(gòu)鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列其他：熱原，內(nèi)毒素，殘留抗生素7.檢測項目干擾素鑒別試驗43演示完畢！謝謝演示完畢！謝謝44中文名稱：干擾素英文名稱：interferon;IFN藥物類別：抗腫瘤藥，抗病毒藥所屬類別：生物反應調(diào)節(jié)劑中文名稱：45干擾素簡介70年代中期人們發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者自身產(chǎn)生干擾素的能力低下，在應用外源性干擾素后，不僅產(chǎn)生了上述抗病毒作用，同時可以增加肝細胞膜上人白細胞組織相容性抗原的密度，促進T細胞溶解感染性肝細胞的效能.干擾素簡介70年代中期人們發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者自身產(chǎn)生干擾46現(xiàn)狀目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國產(chǎn)重組IFN－α1型和IFN－α2型，進口的干擾能（IFN－α2b）、羅擾素（IFN－α2a）、惠福仁（類淋巴母細胞干擾素）及組合干擾素等等?，F(xiàn)狀目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國產(chǎn)重組IFN－47類別各種亞型的干擾素-α（含α1或α2或α2a或α2b）療效近似；干擾素-β（IFNβ）也有相似效果，但它在肌肉組織中易被滅活。干擾素-β制劑進入血液后，穩(wěn)定性差，確切療效尚在觀察中，但可作為干擾素-α的替代制劑。類別各種亞型的干擾素-α（含α1或α2或α2a或α2b）療效48什么是干擾素（IFN）?干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘導劑，通過刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（人體免疫系統(tǒng)的一種）、巨噬細胞、淋巴細胞以及體細胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白。這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導分化作用。什么是干擾素（IFN）?干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘49干擾素的相對分子質(zhì)量小，對熱穩(wěn)定，4℃可保存很長時間，-20℃可長期保存其活性，56℃則被破壞，pH（酸堿度）2~10范圍內(nèi)干擾素不被破壞。人體自然就能產(chǎn)生干擾素，經(jīng)一定的制劑加工過程也能制造成藥物-干擾素制劑。

干擾素的相對分子質(zhì)量小，對熱穩(wěn)定，4℃可保存很長時間，-2050藥理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，它一般為廣譜病毒抑制劑，對RNA和DNA病毒都有抑制作用。2.抑制細胞增殖。干擾素抑制細胞分裂的活性有明顯的選擇性，對腫瘤細胞的活性比正常細胞大500～1000倍。干擾素抗腫瘤效果可以是直接抑制腫瘤細胞增殖，或通過宿主機體的免疫防御機制限制腫瘤的生長。藥理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒513．誘導細胞凋亡：干擾素可以誘導腫瘤細胞凋亡，從而殺滅腫瘤細胞。4.干擾素對體液免疫、細胞免疫均有免疫調(diào)節(jié)作用，對巨噬細胞及NK細胞也有一定的免疫增強作用。

3．誘導細胞凋亡：干擾素可以誘導腫瘤細胞凋亡，從而殺滅腫瘤細52作用機制:干擾素不能直接滅活病毒，而是通過誘導細胞合成抗病毒蛋白（AVP）發(fā)揮效應。干擾素首先作用于細胞的干擾素受體，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導等一系列生休過程，激活細胞基因表達多種抗病毒蛋白，實現(xiàn)對病毒的抑制作用。作用機制:干擾素不能直接滅活病毒，而是通過誘導細胞合成抗病53適應癥：1.用于多種惡性腫瘤，包括毛細胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期轉(zhuǎn)移性腎癌及胰腺惡性內(nèi)分泌腫瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。2.與其他抗腫瘤藥物并用。3.作為放療、化療及手術(shù)的輔助治療劑。4.病毒性疾病的防治。適應癥：1.用于多種惡性腫瘤，包括毛細胞白血病、慢性白血病54不良反應：1.全身反應主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和不適。2.骨髓抑制在用藥中可出現(xiàn)白細胞、血小板和網(wǎng)狀紅細胞減少。不良反應：1.全身反應主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和553.局部反應部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24小時后即可消退。4.其他脫發(fā)、皮疹、血沉加快、嗜睡、一過性肝損傷。偶見過敏性休克，用藥前作過敏試驗。3.局部反應部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24小時56臨床上常用的干擾素有哪些制劑自然干擾素人體白細胞重組干擾素復合干擾素臨床上常用的干擾素有哪些制劑自然干擾素57相關(guān)藥物國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)1.α1b干擾素中國預防醫(yī)學科學院

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3.人α2b干擾素長春生物制品研究所安徽安科生物高科59干擾素生產(chǎn)工藝路線:路線1：體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準上市產(chǎn)量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細胞來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性干擾素生產(chǎn)工藝路線:路線1：60路線2：人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準用于臨床。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點：活性低，退出臨床應用。路線2：人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：61路線3：基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程。路線3：基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:62路線4：動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表達產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點：分泌表達，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴格路線4：動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：63路線5：基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝：宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）上市產(chǎn)品：IFNα-2b/安福隆表達產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析路線5：基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝：64基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立：第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立：65第一步：干擾素α-2b基因的克隆制備白細胞，病毒誘導，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。第一步：干擾素α-2b基因的克隆制備白細胞，病毒誘導，分離m66第二步：表達載體的構(gòu)建IFN基因與表達載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽性克隆獲得序列正確表達載體第二步：表達載體的構(gòu)建IFN基因與表達載體連接67第三步：工程菌的構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種第三步：工程菌的構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿68菌種庫的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。菌種庫的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性69干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過程干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過程70搖瓶培養(yǎng)：取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。搖瓶培養(yǎng)：取保存工作種子批菌種，室溫融化71種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30℃，pH7.0?？刂疲杭壜?lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%。72發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點控制：OD值達9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測：發(fā)酵液雜菌檢查發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。73菌體收集：連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過12個月。檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。菌體收集：連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min74干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解預處理離心初級分離干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解751.菌體裂解：裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF。破碎－20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。1.菌體裂解：裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.762.預處理-沉淀：加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。2.預處理-沉淀：加絮凝劑聚乙烯亞胺:773.離心：連續(xù)流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集