干擾素的生產(chǎn)工藝課件

中文名稱：干擾素英文名稱：interferon;IFN藥物類別：抗腫瘤藥，抗病毒藥所屬類別：生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑中文名稱：1干擾素簡(jiǎn)介70年代中期人們發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者自身產(chǎn)生干擾素的能力低下，在應(yīng)用外源性干擾素后，不僅產(chǎn)生了上述抗病毒作用，同時(shí)可以增加肝細(xì)胞膜上人白細(xì)胞組織相容性抗原的密度，促進(jìn)T細(xì)胞溶解感染性肝細(xì)胞的效能.干擾素簡(jiǎn)介70年代中期人們發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者自身產(chǎn)生干擾2現(xiàn)狀目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國(guó)產(chǎn)重組IFN－α1型和IFN－α2型，進(jìn)口的干擾能（IFN－α2b）、羅擾素（IFN－α2a）、惠福仁（類淋巴母細(xì)胞干擾素）及組合干擾素等等。現(xiàn)狀目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國(guó)產(chǎn)重組IFN－3類別各種亞型的干擾素-α（含α1或α2或α2a或α2b）療效近似；干擾素-β（IFNβ）也有相似效果，但它在肌肉組織中易被滅活。干擾素-β制劑進(jìn)入血液后，穩(wěn)定性差，確切療效尚在觀察中，但可作為干擾素-α的替代制劑。類別各種亞型的干擾素-α（含α1或α2或α2a或α2b）療效4什么是干擾素（IFN）?干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，通過(guò)刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（人體免疫系統(tǒng)的一種）、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白。這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)分化作用。什么是干擾素（IFN）?干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘5干擾素的相對(duì)分子質(zhì)量小，對(duì)熱穩(wěn)定，4℃可保存很長(zhǎng)時(shí)間，-20℃可長(zhǎng)期保存其活性，56℃則被破壞，pH（酸堿度）2~10范圍內(nèi)干擾素不被破壞。人體自然就能產(chǎn)生干擾素，經(jīng)一定的制劑加工過(guò)程也能制造成藥物-干擾素制劑。

干擾素的相對(duì)分子質(zhì)量小，對(duì)熱穩(wěn)定，4℃可保存很長(zhǎng)時(shí)間，-206藥理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，它一般為廣譜病毒抑制劑，對(duì)RNA和DNA病毒都有抑制作用。2.抑制細(xì)胞增殖。干擾素抑制細(xì)胞分裂的活性有明顯的選擇性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性比正常細(xì)胞大500～1000倍。干擾素抗腫瘤效果可以是直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，或通過(guò)宿主機(jī)體的免疫防御機(jī)制限制腫瘤的生長(zhǎng)。藥理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒73．誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：干擾素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而殺滅腫瘤細(xì)胞。4.干擾素對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫均有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)巨噬細(xì)胞及NK細(xì)胞也有一定的免疫增強(qiáng)作用。

3．誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：干擾素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而殺滅腫瘤細(xì)8作用機(jī)制:干擾素不能直接滅活病毒，而是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞合成抗病毒蛋白（AVP）發(fā)揮效應(yīng)。干擾素首先作用于細(xì)胞的干擾素受體，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生休過(guò)程，激活細(xì)胞基因表達(dá)多種抗病毒蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的抑制作用。作用機(jī)制:干擾素不能直接滅活病毒，而是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞合成抗病9適應(yīng)癥：1.用于多種惡性腫瘤，包括毛細(xì)胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期轉(zhuǎn)移性腎癌及胰腺惡性內(nèi)分泌腫瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。2.與其他抗腫瘤藥物并用。3.作為放療、化療及手術(shù)的輔助治療劑。4.病毒性疾病的防治。適應(yīng)癥：1.用于多種惡性腫瘤，包括毛細(xì)胞白血病、慢性白血病10不良反應(yīng)：1.全身反應(yīng)主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和不適。2.骨髓抑制在用藥中可出現(xiàn)白細(xì)胞、血小板和網(wǎng)狀紅細(xì)胞減少。不良反應(yīng)：1.全身反應(yīng)主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和113.局部反應(yīng)部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24小時(shí)后即可消退。4.其他脫發(fā)、皮疹、血沉加快、嗜睡、一過(guò)性肝損傷。偶見(jiàn)過(guò)敏性休克，用藥前作過(guò)敏試驗(yàn)。3.局部反應(yīng)部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24小時(shí)12臨床上常用的干擾素有哪些制劑自然干擾素人體白細(xì)胞重組干擾素復(fù)合干擾素臨床上常用的干擾素有哪些制劑自然干擾素13相關(guān)藥物國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)1.α1b干擾素中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院

衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品研究所

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2.人α2a干擾素衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品研究所

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143.人α2b干擾素長(zhǎng)春生物制品研究所安徽安科生物高科技有限公司(安達(dá)芬)

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4.人γ干擾素上海生物化學(xué)研究所

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3.人α2b干擾素長(zhǎng)春生物制品研究所安徽安科生物高科15干擾素生產(chǎn)工藝路線:路線1：體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準(zhǔn)上市產(chǎn)量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細(xì)胞來(lái)源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性干擾素生產(chǎn)工藝路線:路線1：16路線2：人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準(zhǔn)用于臨床。優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點(diǎn)：活性低，退出臨床應(yīng)用。路線2：人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：17路線3：基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化，N-met，無(wú)活性包涵體工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過(guò)程，隨后變性、復(fù)性過(guò)程。路線3：基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:18路線4：動(dòng)物無(wú)限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表達(dá)產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點(diǎn)：分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高,過(guò)程嚴(yán)格路線4：動(dòng)物無(wú)限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：19路線5：基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝：宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）上市產(chǎn)品：IFNα-2b/安福隆表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性工藝特點(diǎn)：發(fā)酵周期短：幾個(gè)小時(shí)無(wú)需變性、復(fù)性過(guò)程，獲得有活性產(chǎn)品純化過(guò)程：淘汰抗體親和層析路線5：基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝：20基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立：第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立：21第一步：干擾素α-2b基因的克隆制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測(cè)序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。第一步：干擾素α-2b基因的克隆制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離m22第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建IFN基因與表達(dá)載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽(yáng)性克隆獲得序列正確表達(dá)載體第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建IFN基因與表達(dá)載體連接23第三步：工程菌的構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種第三步：工程菌的構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿24菌種庫(kù)的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。菌種庫(kù)的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性25干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過(guò)程干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過(guò)程26搖瓶培養(yǎng)：取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測(cè)：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。搖瓶培養(yǎng)：取保存工作種子批菌種，室溫融化27種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30℃，pH7.0?？刂疲杭?jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速檢測(cè)：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%。28發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%?？刂疲杭?jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點(diǎn)控制：OD值達(dá)9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測(cè)：發(fā)酵液雜菌檢查發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。29菌體收集：連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過(guò)12個(gè)月。檢測(cè)：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。菌體收集：連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min30干擾素α-2b分離工藝過(guò)程菌體裂解預(yù)處理離心初級(jí)分離干擾素α-2b分離工藝過(guò)程菌體裂解311.菌體裂解：裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF。破碎－20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。1.菌體裂解：裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.322.預(yù)處理-沉淀：加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。2.預(yù)處理-沉淀：加絮凝劑聚乙烯亞胺:333.離心：連續(xù)流離心機(jī)：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。3.離心：連續(xù)流離心機(jī)：2℃～10℃，16000r/min344.初級(jí)分離：鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過(guò)夜。離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。4.初級(jí)分離：鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過(guò)35干擾素純化工藝過(guò)程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽(yáng)離子交換層析與濃縮凝膠過(guò)濾層析無(wú)菌過(guò)濾分裝干擾素純化工藝過(guò)程溶解粗干擾素361.溶解粗干擾素配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級(jí)層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。溶解：2℃～10℃，勻漿，完全溶解。1.溶解粗干擾素配制純化緩沖液：372.沉淀與疏水層析等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。等電點(diǎn)沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過(guò)夜2.沉淀與疏水層析等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉38超濾：1000ku超濾膜過(guò)濾，除去大蛋白。透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導(dǎo)值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。超濾：1000ku超濾膜過(guò)濾，除去大蛋白。394.陽(yáng)離子交換層析與濃縮用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹(shù)脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進(jìn)行洗脫配合SDS收集干擾素峰。濃縮：10ku超濾膜進(jìn)行。4.陽(yáng)離子交換層析與濃縮用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）405.凝膠過(guò)濾層析洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹(shù)脂上樣，相同緩沖液進(jìn)行洗脫。合并干擾素部分5.凝膠過(guò)濾層析洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷416.無(wú)菌過(guò)濾分裝0.22μm濾膜過(guò)濾干擾素溶液分裝－20℃以下的冰箱中保存。6.無(wú)菌過(guò)濾分裝0.22μm濾膜過(guò)濾干擾素溶液427.檢測(cè)項(xiàng)目干擾素鑒別試驗(yàn)干擾素效價(jià)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，純度測(cè)定，分子量宿主殘余蛋白、殘余DNA干擾素結(jié)構(gòu)鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列其他：熱原，內(nèi)毒素，殘留抗生素7.檢測(cè)項(xiàng)目干擾素鑒別試驗(yàn)43演示完畢！謝謝演示完畢！謝謝44中文名稱：干擾素英文名稱：interferon;IFN藥物類別：抗腫瘤藥，抗病毒藥所屬類別：生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑中文名稱：45干擾素簡(jiǎn)介70年代中期人們發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者自身產(chǎn)生干擾素的能力低下，在應(yīng)用外源性干擾素后，不僅產(chǎn)生了上述抗病毒作用，同時(shí)可以增加肝細(xì)胞膜上人白細(xì)胞組織相容性抗原的密度，促進(jìn)T細(xì)胞溶解感染性肝細(xì)胞的效能.干擾素簡(jiǎn)介70年代中期人們發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者自身產(chǎn)生干擾46現(xiàn)狀目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國(guó)產(chǎn)重組IFN－α1型和IFN－α2型，進(jìn)口的干擾能（IFN－α2b）、羅擾素（IFN－α2a）、惠福仁（類淋巴母細(xì)胞干擾素）及組合干擾素等等?，F(xiàn)狀目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國(guó)產(chǎn)重組IFN－47類別各種亞型的干擾素-α（含α1或α2或α2a或α2b）療效近似；干擾素-β（IFNβ）也有相似效果，但它在肌肉組織中易被滅活。干擾素-β制劑進(jìn)入血液后，穩(wěn)定性差，確切療效尚在觀察中，但可作為干擾素-α的替代制劑。類別各種亞型的干擾素-α（含α1或α2或α2a或α2b）療效48什么是干擾素（IFN）?干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，通過(guò)刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（人體免疫系統(tǒng)的一種）、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白。這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)分化作用。什么是干擾素（IFN）?干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘49干擾素的相對(duì)分子質(zhì)量小，對(duì)熱穩(wěn)定，4℃可保存很長(zhǎng)時(shí)間，-20℃可長(zhǎng)期保存其活性，56℃則被破壞，pH（酸堿度）2~10范圍內(nèi)干擾素不被破壞。人體自然就能產(chǎn)生干擾素，經(jīng)一定的制劑加工過(guò)程也能制造成藥物-干擾素制劑。

干擾素的相對(duì)分子質(zhì)量小，對(duì)熱穩(wěn)定，4℃可保存很長(zhǎng)時(shí)間，-2050藥理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，它一般為廣譜病毒抑制劑，對(duì)RNA和DNA病毒都有抑制作用。2.抑制細(xì)胞增殖。干擾素抑制細(xì)胞分裂的活性有明顯的選擇性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性比正常細(xì)胞大500～1000倍。干擾素抗腫瘤效果可以是直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，或通過(guò)宿主機(jī)體的免疫防御機(jī)制限制腫瘤的生長(zhǎng)。藥理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒513．誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：干擾素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而殺滅腫瘤細(xì)胞。4.干擾素對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫均有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)巨噬細(xì)胞及NK細(xì)胞也有一定的免疫增強(qiáng)作用。

3．誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：干擾素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而殺滅腫瘤細(xì)52作用機(jī)制:干擾素不能直接滅活病毒，而是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞合成抗病毒蛋白（AVP）發(fā)揮效應(yīng)。干擾素首先作用于細(xì)胞的干擾素受體，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生休過(guò)程，激活細(xì)胞基因表達(dá)多種抗病毒蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的抑制作用。作用機(jī)制:干擾素不能直接滅活病毒，而是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞合成抗病53適應(yīng)癥：1.用于多種惡性腫瘤，包括毛細(xì)胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期轉(zhuǎn)移性腎癌及胰腺惡性內(nèi)分泌腫瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。2.與其他抗腫瘤藥物并用。3.作為放療、化療及手術(shù)的輔助治療劑。4.病毒性疾病的防治。適應(yīng)癥：1.用于多種惡性腫瘤，包括毛細(xì)胞白血病、慢性白血病54不良反應(yīng)：1.全身反應(yīng)主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和不適。2.骨髓抑制在用藥中可出現(xiàn)白細(xì)胞、血小板和網(wǎng)狀紅細(xì)胞減少。不良反應(yīng)：1.全身反應(yīng)主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和553.局部反應(yīng)部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24小時(shí)后即可消退。4.其他脫發(fā)、皮疹、血沉加快、嗜睡、一過(guò)性肝損傷。偶見(jiàn)過(guò)敏性休克，用藥前作過(guò)敏試驗(yàn)。3.局部反應(yīng)部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24小時(shí)56臨床上常用的干擾素有哪些制劑自然干擾素人體白細(xì)胞重組干擾素復(fù)合干擾素臨床上常用的干擾素有哪些制劑自然干擾素57相關(guān)藥物國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)1.α1b干擾素中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院

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2.人α2a干擾素衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品研究所

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武漢天奧制藥有限公司（栓劑）相關(guān)藥物國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)1.α1b干擾素中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院

583.人α2b干擾素長(zhǎng)春生物制品研究所安徽安科生物高科技有限公司(安達(dá)芬)

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3.人α2b干擾素長(zhǎng)春生物制品研究所安徽安科生物高科59干擾素生產(chǎn)工藝路線:路線1：體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準(zhǔn)上市產(chǎn)量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細(xì)胞來(lái)源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性干擾素生產(chǎn)工藝路線:路線1：60路線2：人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準(zhǔn)用于臨床。優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點(diǎn)：活性低，退出臨床應(yīng)用。路線2：人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：61路線3：基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化，N-met，無(wú)活性包涵體工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過(guò)程，隨后變性、復(fù)性過(guò)程。路線3：基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:62路線4：動(dòng)物無(wú)限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表達(dá)產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點(diǎn)：分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高,過(guò)程嚴(yán)格路線4：動(dòng)物無(wú)限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：63路線5：基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝：宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）上市產(chǎn)品：IFNα-2b/安福隆表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性工藝特點(diǎn)：發(fā)酵周期短：幾個(gè)小時(shí)無(wú)需變性、復(fù)性過(guò)程，獲得有活性產(chǎn)品純化過(guò)程：淘汰抗體親和層析路線5：基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝：64基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立：第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立：65第一步：干擾素α-2b基因的克隆制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測(cè)序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。第一步：干擾素α-2b基因的克隆制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離m66第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建IFN基因與表達(dá)載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽(yáng)性克隆獲得序列正確表達(dá)載體第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建IFN基因與表達(dá)載體連接67第三步：工程菌的構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種第三步：工程菌的構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿68菌種庫(kù)的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。菌種庫(kù)的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性69干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過(guò)程干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過(guò)程70搖瓶培養(yǎng)：取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測(cè)：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。搖瓶培養(yǎng)：取保存工作種子批菌種，室溫融化71種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30℃，pH7.0?？刂疲杭?jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速檢測(cè)：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%。72發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%?？刂疲杭?jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點(diǎn)控制：OD值達(dá)9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測(cè)：發(fā)酵液雜菌檢查發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。73菌體收集：連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過(guò)12個(gè)月。檢測(cè)：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。菌體收集：連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min74干擾素α-2b分離工藝過(guò)程菌體裂解預(yù)處理離心初級(jí)分離干擾素α-2b分離工藝過(guò)程菌體裂解751.菌體裂解：裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF。破碎－20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。1.菌體裂解：裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.762.預(yù)處理-沉淀：加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。2.預(yù)處理-沉淀：加絮凝劑聚乙烯亞胺:773.離心：連續(xù)流離心機(jī)：2℃～10℃，16000r/min收集