移植性鱗癌兔模型的建立及生物學(xué)特征

移植性鱗癌兔模型的建立及生物學(xué)特征邢在臣;丁國(guó)偉;艾德里VX22VX2將新西蘭大白兔分別用瘤細(xì)胞懸液注入法和瘤組織塊切開(kāi)植入法移植于兔耳皮下，2果與結(jié)論：瘤細(xì)胞懸液注入組和瘤組織塊植入組的成瘤率分別為73.3%和50%，差異有顯著性意義75%86%.VX2【期刊名稱(chēng)】《中國(guó)組織工程研究》【年(卷),期】2012(000)037【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)(P6876-6880)【關(guān)鍵詞】VX2腫瘤;鱗癌;動(dòng)物模型;耳郭;生物學(xué)特征;組織構(gòu)建【作者】邢在臣;丁國(guó)偉;艾德里【作者單位】泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東省泰安271000;同濟(jì)大學(xué)醫(yī)院管理處，上海市200092;KamulegeyaAdriane，金賈，烏干達(dá)999123【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】R318引言鱗癌是頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤，建立頭頸部鱗癌動(dòng)物模型，是臨床治療和基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)。VX2細(xì)胞是由shope病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株[1]，有易于移植，生長(zhǎng)迅速和侵襲性強(qiáng)的特點(diǎn)。其形態(tài)學(xué)、生化和生物學(xué)特性與人類(lèi)癌瘤相似，目前已廣泛應(yīng)用于肝、腎腫瘤的影像學(xué)及化療、栓塞動(dòng)物模型的研究[2-5]。VX2瘤，并對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、組織學(xué)、生物學(xué)行為進(jìn)行初步觀察。材料和方法設(shè)計(jì)：隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn)：于2004-01/2006-05在上海同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心和中心實(shí)驗(yàn)室完成。材料：252.5-3.0kg1發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》細(xì)胞：兔VX2癌株由解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院段云友教授惠贈(zèng)。試劑及儀器：試劑及儀器來(lái)源RPMI1640培養(yǎng)液戊巴比妥鈉，錐蟲(chóng)藍(lán)溶液不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)(200目)倒置顯微鏡(R70)美國(guó)Gibco公司美國(guó)Sigma公司上海銳谷生物科技有限公司日本奧林巴斯公司方法：VX2荷瘤種兔的制備：VX2瘤細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)，經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)配至2×1010L-11mL瘤細(xì)胞懸液注射于兔后腿外側(cè)17d3cm×2cm，瘤組織塊和瘤細(xì)胞懸液的制備：瘤組織塊制備：取帶瘤傳種兔，體積分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉0.1mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，無(wú)菌條件下取兔后股肌肉內(nèi)腫瘤，置培養(yǎng)皿中，加入RPMI1640培養(yǎng)液5mL，剪取瘤體邊緣生長(zhǎng)旺盛的魚(yú)肉樣腫瘤組織，分別剪成3mm×3mm×5mm的小塊，將組織塊切成3mm×3mm×1mm 的組織片備用。瘤細(xì)胞懸液制備：把瘤組織塊剪成細(xì)小組織塊,放置在直徑200μm的組織過(guò)濾網(wǎng)1000r/min5minPBS120%1h252150.2mL1530103%0.1mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，常0.5-1.0cm120癌模型兔的瘤組織進(jìn)行傳代，檢測(cè)傳代成功率。腫瘤生長(zhǎng)檢測(cè)：移植后第7天，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大直徑與最大橫徑，計(jì)算腫瘤大概體積(V=a×b2/2)。所有腫瘤按各時(shí)間段表體積大小來(lái)檢測(cè)，腫瘤生長(zhǎng)率(%)=V(n+1周n43率和肺轉(zhuǎn)移率。主要觀察指標(biāo)：各組成瘤率，腫瘤生長(zhǎng)率，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和肺轉(zhuǎn)移率的變化。SPSS11.5檢驗(yàn)，P＜0.05義。結(jié)果25生，均計(jì)入結(jié)果分析。1210273.3%1350%。瘤細(xì)胞懸液注入組的成瘤率高于瘤細(xì)胞組織塊植入組(P1，2表1各組植入后腫瘤體積變化Table1 Changeoftumorvolumeaftertransplantation3(±s,cm)Timeaftertransplantation(wk)TumorcellssuspensioninjectiongroupTumortissueincisionimplantationgroup123450.05±0.020.18±0.091.46±0.805.09±6.566.06±8.730.07±0.320.16±0.060.94±0.824.11±9.115.41±18.95表2各組植入后腫瘤生長(zhǎng)率變化Table2 Growthrateoftransplantedtumors(%)Timeaftertransplantation(wk)TumorcellssuspensioninjectionTumortissueincisionimplantationgroup12345-346.2810.5349.1118.9-253.1571.1427.5134.8從數(shù)據(jù)分析可以看出，瘤細(xì)胞懸液注入組瘤細(xì)胞懸液移植方法和瘤細(xì)胞組織注入組組織塊移植方法相比，瘤細(xì)胞懸液注入組在腫瘤生長(zhǎng)速度，腫瘤生長(zhǎng)率等方面要比瘤細(xì)胞組織注入組要略快，但兩者差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。耳鱗癌模型兔的區(qū)域淋巴結(jié)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移11d左右首先發(fā)現(xiàn)有兔耳旁部淋巴腫大，49(9/12)75%15d46(6/7)86%41組組肺標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶轉(zhuǎn)移52210201773。1a0.2mL21b，c41dFigure1 Morphologyofthetransplantedtumorsintheauricleofsuspensioninjectiongroup1瘤細(xì)胞懸液注入組耳郭部移植瘤形態(tài)移植第28天荷瘤兔(瘤細(xì)胞懸液注入組)解剖后，取原發(fā)灶、耳旁淋巴結(jié)、肺組織，體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5μm切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)變化片腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，血管豐富，VX2癌細(xì)胞形態(tài)大小不一，核大，深染，分裂2Figure2 Histologicalfeaturesofthetransplantedtumorsincellssuspensioninjectiongroup(Hematoxylin-eosinstaining,×40)2瘤細(xì)胞懸，×40)討論頭頸部鱗狀細(xì)胞癌動(dòng)物模型主要有自發(fā)性、誘發(fā)性和移植性動(dòng)物模型VX2荷瘤作為移植瘤源，VX2瘤株具有可多部位移植及移植后成活率高等特點(diǎn)，且生物瘤模型的建立1/3VX2瘤即使腫瘤巨大，對(duì)兔生存質(zhì)量影響相對(duì)較小，不易引起重要臟變性壞死，54移植瘤生長(zhǎng)的影響因素：VX2荷瘤細(xì)胞的自身特性、動(dòng)物特性、移植的方法和部位都是移植成功關(guān)鍵因素，腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，只有腫瘤細(xì)胞達(dá)到一定的數(shù)量，細(xì)胞才能增殖，腫瘤才能生長(zhǎng)，建議耳局部注射細(xì)胞量不低于2×107個(gè)。腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性和狀態(tài)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)嘗試將肌肉內(nèi)傳代之腫瘤剪切成1mm×1mm×1mm 的組織塊，再行兔耳皮下埋植，移植成功率低于59%，實(shí)驗(yàn)選用3mm×3mm×1mm 組織片埋置，成功率為50%，略微低于前者，都低于活體組織細(xì)胞懸液注射法，但差異無(wú)顯著性意義，原因可能是組織塊中的壞死細(xì)胞比率大，壞死細(xì)胞會(huì)刺激肌體自身免疫反應(yīng)，阻礙了腫瘤的生長(zhǎng)。有學(xué)者報(bào)道使用組塊懸液的方法移植腫瘤，成功率較高，方法較細(xì)胞懸液方法簡(jiǎn)單，但不能控制和化植入的細(xì)胞數(shù)目，移植成功的腫瘤大小不一，對(duì)動(dòng)物模型的后續(xù)各種抗腫瘤實(shí)會(huì)產(chǎn)生不利影響，實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，相比使用瘤細(xì)胞懸液法，瘤組織塊移植法移植功的腫瘤，直徑大小不均勻。移植部位，同樣應(yīng)用瘤組織懸液法，移植所成腫瘤植部位的不同對(duì)移植成功率也有影響，有研究報(bào)道，VX2荷瘤在皮下組織中的生長(zhǎng)能力很差，遠(yuǎn)低于在后腿肌肉內(nèi)的成功率，也許與腫瘤局部血供的程度有密切關(guān)系。實(shí)驗(yàn)所建立兔耳郭鱗癌動(dòng)物模型，腫瘤生長(zhǎng)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與肺轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為非常接近人類(lèi)的頭頸部鱗癌[15-16]，該動(dòng)物模型成瘤率高，成瘤時(shí)間穩(wěn)定，且位置暴露，易于觀察和測(cè)量腫瘤變化，有利于進(jìn)一步的進(jìn)出和臨床抗腫瘤研究。在建立動(dòng)物模型方法上，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用活細(xì)胞懸液法成瘤率稍高于組織塊法，在腫瘤生長(zhǎng)率和淋巴轉(zhuǎn)移率方面兩者無(wú)明顯差異。在植入的方式上，實(shí)驗(yàn)建議選擇成瘤率較高的瘤細(xì)胞懸液注射法，而且組織塊移植法由于難以準(zhǔn)確量化植入細(xì)胞量，造成成瘤大小不一，并且存在較高的瘤退縮現(xiàn)象，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。瘤組織塊法的優(yōu)點(diǎn)是操作程序相對(duì)簡(jiǎn)單，要求條件低。瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)的難度大，且重新植入后難以成瘤，因此也不建議使用。致謝：感謝上海市浦南醫(yī)院口腔科黃劍對(duì)本次實(shí)驗(yàn)的技術(shù)指導(dǎo)。4參考文獻(xiàn)RousP,KiddJG,SmithWE,etal.Experimentsonthecauseofrabbitcarcinomaderivedfromvirus-inducedpapillomas.JExp1952;96(2):159-174.HanslerJ,NeureiterD,WasserburgerM,etal.Percutaneousguidedradiofrequencyablationwithperfusedneedleapplicators:ImprovedsurvivalwiththeVX2tumormodelinrabbits.Radiology.2004;230(1):169-174.VossenJA,BuijsM,SyedL,etal.DevelopmentofaneworthotopicanimalmodelofmetastaticlivercancerintherabbitVX2model:effectmetastasesafterpartialhepatectomy,intra-arterialtreatmentwith3-bromopyruvateandchemoembolization.ClinExpMetastasis.2008;25(7)811-817.BrunersP,BraunschweigT,HodeniusM,etal.Thermoablationmalignantkidneytumorsusingmagneticnanoparticles:aninvivofeasibilitystudyinarabbitmodel.CardiovascInterventRadiol.2010;33(1):127-134.KimKW,LeeJM,KimJH,etal.CTcolormappingofthearterialenhancementfractionofVX2carcinomaimplantedinrabbitliver:comparisonwithperfusionCT.AJRAmJRoentgenol.2011;196(1):102-108.TheMinistryofScienceandTechnologyofthePeople’sRepublicChina.GuidanceSuggestionsfortheCareandUseofLaboratoryAnimals.2006-09-30.AdrianeK,HuangJ,DingG,etal.Selfassembledmagnetichydrogelmicrospheres;magneticdrugtargetingofVX2auriculartumorsusingpingyangmycin.JDrugTarget.2006;14(4):243-253.GuoweiD,AdrianeK,zaichenX,etal.PVPmagneticbiocompatibility,invitroandinvivobleomycinrelease.IntJ2007;328(1):78-85.SonodaA,NittaN,OhtaS,etal.EnhancedantitumoreffectoftirapazaminedeliveredintraperitoneallytoVX2livertumor-bearingrabbitssubjectedtotransarterialhepaticembolization.CardiovascIntervent2011;34(6):1272-1277.ChoSK,ShinSW,DoYS,etal.Single-bolusregionalwithdoxorubicinversuschemoembolizationinarabbitVX2tumorDiagnIntervRadiol.2011;17(4):374-380.HarkerGJ,StephensFO.Comparisonofintra-arterialversusintravenous5-fluorouraciladministrationonepidermalsquamouscarcinomainsheep.EurJCancer.1992;28A(8-9):1437-1441.CaoXP,LiuXJ,HaoZF,etal.HuaxiKouqiangYixueZazhi.2