用正交法測定幾種因素對酶活力的影響實驗報告

...wd......wd......wd...用正交法測定幾種因素對酶活力的影響一、前言正交實驗法正交實驗法就是利用排列整齊的表-正交表來對試驗進展整體設(shè)計、綜合比較、統(tǒng)計分析，實現(xiàn)通過少數(shù)的實驗次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，以到達最高生產(chǎn)工藝效果。正交表能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，使每次試驗都具有較強的代表性，由于正交表具備均衡分散的特點，保證了全面實驗的某些要求，這些試驗往往能夠較好或更好的到達實驗的目的。正交實驗設(shè)計包括兩局部內(nèi)容:第一，是若何安排實驗;第二，是若何分析實驗結(jié)果。酶活力酶活力〔enzymeactivity〕也稱為酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反響的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反響的速度來表示，酶催化反響速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測定酶活力實際就是測定酶促反響的速度。酶促反響速度可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在一般的酶促反響體系中，底物往往是過量的，測定初速度時，底物減少量占總量的極少局部，不易準(zhǔn)確檢測，而產(chǎn)物那么是從無到有，只要測定方法靈敏，就可準(zhǔn)確測定。二、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)并掌握正交法應(yīng)用原理。2.采用正交法測定多種因素對酶活力的影響。三、實驗原理酶促反響常常同時受到多種因素(包括激活劑和抑制劑等)的交互影響，可采用正交法進展綜合研究，即通過少量試驗收到更好的效果：多快好省。本實驗以正交法同時測定[S]、[E]、溫度和pH值對trypsin活性的影響，以求得酶活最大時相應(yīng)影響因素的最正確值(水平)，并借此初步掌握正交法的使用。四、實驗器材和試劑實驗器材：①試管②漏斗③溫度計④吸管⑤恒溫水浴鍋⑥分光光度計實驗試劑：①2%血紅蛋白液(Hb)②15%三氯醋酸液(TCA)③trypsin酶液④0.04mol/L巴比妥緩沖液(pH7,8,9)⑤考馬斯亮藍(lán)染液五、實驗操作1.實驗設(shè)計本實驗為四因素三水平(總試驗次數(shù)34=81)，可選用L9正交表〔僅需9次試驗)，展開后其特性為均衡搭配〔1〕每列中水平數(shù)1、2、3出現(xiàn)次數(shù)一樣，均為3次；〔2〕每兩列的橫行數(shù)對(1-1/1-2/…/3-2/3-3)各出現(xiàn)一次。列號試驗號12341111121222313334212352231623127313283213933212.將各因素及其相應(yīng)水平參數(shù)依次填入得到實驗安排表試驗號試劑/ml1682493572%血紅蛋白液0.20.50.80.20.50.80.20.50.8緩沖溶液pH72.6pH81.7pH91.7pH82.3pH92.3pH72.0pH92.0pH72.0pH82.037℃預(yù)溫5min50℃預(yù)溫5min60℃預(yù)溫5min酶液0.20.80.50.50.20.80.80.50.237℃反響10min50℃反響10min60℃反響10min〔1〕各試管編號，分別參加對應(yīng)容量的底物(2%Hb)和相應(yīng)pH值的緩沖液，混勻；〔2〕同溫處理的3支試管同時預(yù)溫5min；〔3〕各試管依序分別參加對應(yīng)容量的trypsin酶液(統(tǒng)一加樣時間間隔)，混勻；〔4〕同溫處理的3支試管置對應(yīng)恒溫水浴中反響10min；〔5〕各試管依次參加15%三氯醋酸液2ml，混勻以終止反響；〔6〕非酶促對照：另取一試管，先參加2%血紅蛋白液0.5ml及pH8緩沖液2.0ml，再加15%三氯醋酸液2.0ml，混勻靜置10min后再參加酶液0.5ml；〔7〕上述各管反響液室溫靜置15min后過濾，取濾液待測酶活；〔8〕酶活測定(考馬斯亮藍(lán)法，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備略)：取試管假設(shè)干支編號，分別參加對應(yīng)的樣品濾液1.0ml及考馬斯亮藍(lán)液4.0ml，混勻，室溫靜置3min，以非酶促對照管為空白，于波長595nm比色測定。3.數(shù)據(jù)記錄及分析將各管測定所得光密度值對應(yīng)填入表格，分別算出各因素一、二及三水平的試驗結(jié)果總和Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并分別取其平均值計算相應(yīng)的極差(各列中最大與最小值之差)；比較各因素極差的大小以評估各因素對酶活的影響，并對酶活最高時的各因素水平作一直觀分析。六、實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理1.實驗數(shù)據(jù)：pH值溫度pH7pH8pH9測量值平均值測量值平均值測量值平均值37℃0.0030.00230.0680.06670.1850.18400.0020.0660.1850.0020.0660.18250℃0.0590.05600.0960.09670.0790.08100.0580.0970.0820.0510.0970.08260℃0.1400.14170.1630.16100.0650.06600.1410.1590.0640.1440.1610.0692.實驗數(shù)據(jù)處理分析：列號試驗號1[S]/ml2[E]/ml3溫度/〔℃〕4pH試驗結(jié)果A12345678910.210.210.220.520.520.530.830.830.810.220.530.810.220.530.810.220.530.81372503602503601373601372501728393917282839170.00230.05600.14170.09670.16100.06670.06600.18400.0810Ⅰ〔一水平試驗結(jié)果總和〕Ⅱ〔二水平試驗結(jié)果總和〕Ⅲ〔三水平試驗結(jié)果總和〕0.20000.92470.33100.16500.40100.28940.25300.23370.36870.24430.18870.4224Ⅰ/3Ⅱ/3Ⅲ/30.06670.30820.11030.05500.13370.09650.08430.07790.12290.08140.06290.1408極差0.24150.07870.04500.0779由上述表格各因素極差大小可看出，底物濃度對于酶活力影響最大，其次是酶濃度，再次是pH，最后是溫度。根據(jù)上表數(shù)據(jù)，以吸光度值〔Ⅰ/3、Ⅱ/3、Ⅲ/3〕為縱坐標(biāo)，因素的水平數(shù)為橫坐標(biāo)作圖圖一底物濃度對酶活力的影響從圖一可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增大，酶活力是逐漸降低的，約在底物濃度為0.5mol/ml時酶活力到達最低。圖二酶濃度對酶活力的影響從圖二可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著酶濃度升高，酶活力是逐漸降低的，約在酶濃度為0.55mol/ml時酶活力到達最低。圖三溫度對酶活力的影響從圖三可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，反響速率是逐漸升高的，即酶活力是逐漸升高的，約在溫度為50℃時酶活力到達最高。圖四pH對酶活力的影響從圖四可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著pH升高，反響速率是逐漸升高的，即酶活力是逐漸升高的，約在pH為8時酶活力到達最高。七、實驗本卷須知1.每參加一種試劑都需要充分混勻。2.應(yīng)確保酶促反響的溫度及反響時間的準(zhǔn)確性。八、思考題1.正交法有何優(yōu)點答：通過少數(shù)的實驗次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，能夠在因素變化范