mRNA差別顯示技術(shù)解讀課件

mRNA差別顯示技術(shù)生工1班楊金鑫mRNA差別顯示技術(shù)生工1班主要內(nèi)容概述定義及原理應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)展望主要內(nèi)容

高等生物大約有3~5萬(wàn)個(gè)不同的基因，在每一個(gè)正常的體細(xì)胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細(xì)胞中僅有10%~20%的少部分基因被選擇性表達(dá)，這種選擇性表達(dá)是在發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化的根本原因，是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程的核心機(jī)制。因此，比較不同組織之間，或相同組織在不同生理?xiàng)l件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，可分離并克隆出這些特異性表達(dá)的基因。近年來(lái)，該領(lǐng)域的研究取得了很大進(jìn)展，扣除雜交（subtractivehybridization,SH）、基因芯片技術(shù)（DNAchiptechnique）、基因表達(dá)的系統(tǒng)分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、噬菌體全套抗體庫(kù)技術(shù)(phagedisplayantibodyrepertoirelibrarytechnique)和雙向電泳技術(shù)(two-dimensionalgelelectrophoresis)先后成功地建立。一.概述高等生物大約有3~5萬(wàn)個(gè)不同的基因，在每一個(gè)正基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。指在對(duì)信號(hào)或誘導(dǎo)物做出應(yīng)答時(shí)，選擇表達(dá)不同的基因，或使基因的表達(dá)水平有所不同?；虿町惐磉_(dá)基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。指在對(duì)信號(hào)或誘導(dǎo)物做出DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達(dá)基因強(qiáng)有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術(shù)方面做了大量改進(jìn)，使技術(shù)更適用、更簡(jiǎn)便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3）DNA電泳技術(shù)

DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立二.基本概念

mRNA差別顯示技術(shù)也稱為差示反轉(zhuǎn)錄PCR（DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR）簡(jiǎn)稱為ddRT-PCR。它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因。二.基本概念mRNA差別顯示技術(shù)也稱為差示反

反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。其原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptiRNA指紋

RNA首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下使RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，之后以其DNA為模板，通過(guò)以DNA指紋技術(shù)建立指紋圖譜進(jìn)行分析。DNA指紋

某些DNA序列的差異可通過(guò)限制性酶切片段長(zhǎng)度的改變反映出來(lái)，此即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。其主要原因是由于DNA序列個(gè)別堿基的突變而引起某個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的獲得或丟失，表現(xiàn)為不同長(zhǎng)度的酶切片段．RNA指紋RNA首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下使R水稻品種DNA指紋水稻品種DNA指紋基本原理

利用所有真核基因的mRNA的3’端都有一段多聚腺苷酸poly(A)尾結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，將不同來(lái)源的總mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,此cDNA合成是采用oligo(dT)12MN為引物，其中M為A,C,G中的任意一種，N為A,C,G或T中的任意一種，共有12種oligo(dT)12MN引物，其中M為錨定堿基可增大引物的Tm值，N稱為分類堿基，對(duì)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分類。用這12種引物分別對(duì)同一總mRNA樣品進(jìn)行cDNA合成，即進(jìn)行12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到12種類型的cDNA，從而也將總mRNA分為12個(gè)亞群。在此基礎(chǔ)上對(duì)每一類cDNA進(jìn)行隨機(jī)引物和相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物PCR擴(kuò)增，由于擴(kuò)增的cDNA片段被放射性同位素標(biāo)記，因而利用放射自顯影技術(shù)通過(guò)對(duì)不同組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，從而反映出不同樣品間基因的時(shí)間和空間上的組織特異性的表達(dá)?；驹砝盟姓婧嘶虻膍RNA的3’端都有一段

基本原理是，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個(gè)多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說(shuō)的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為模板，以oligo(dT)為引物合成出cDNA拷貝。根據(jù)mRNA分子3’-末端序列末端結(jié)構(gòu)的分析可以看到，在這段poly(A)序列起點(diǎn)堿基之前的一個(gè)堿基，除了為A的情況之外，只能有C、G、T三種可能。根據(jù)這種序列結(jié)構(gòu)特征，P.Peng等人設(shè)計(jì)合成三種不同的下游引物，它由11個(gè)或12個(gè)連續(xù)的脫氧核苷酸加上一個(gè)3’-末端錨定脫氧核苷酸組成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個(gè)mRNA群體在cDNA水平上分成三個(gè)亞群體。然后用一個(gè)上游的隨機(jī)引物和與反轉(zhuǎn)錄時(shí)相同的oligo(dT)引物對(duì)這個(gè)ｃＤＮＡ亞群體進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，因?yàn)檫@個(gè)上游的引物將隨機(jī)結(jié)合在cDNA上,因此來(lái)自不同ｍＲＮＡ的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是不同的，可以在測(cè)序膠上明顯分辨開來(lái)，從而篩選出不同樣品間基因差異表達(dá)的DNA片段?；驹硎牵瑤缀跛械恼婧嘶騧RNA分子的3’-末mRNA差別顯示技術(shù)解讀課件5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長(zhǎng)dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動(dòng)cDNA第一鏈合成不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴(kuò)增，克隆測(cè)序，同源比對(duì)隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(1)提取總RNA，在這個(gè)步驟中注意不能有DNA污染，一般用無(wú)RNA酶的DNA酶在37℃下處理30min；(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以O(shè)ligoT11MN為引物(M為G、A、C中的任一種，N為A、C、G、T任一種)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；(3)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增cDNA的第一條鏈；(4)擴(kuò)增后的cDNA進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表達(dá)的cDNA片段在6%測(cè)序膠上分開；(5)找出不同處理間差異顯示的條帶，從膠上切割下來(lái)，并回收，再進(jìn)行第二次擴(kuò)增；(6)克隆差異片段，差異片段可作為探針；(7)Northern雜交，驗(yàn)證目的片段，去掉假陽(yáng)性片段；(8)對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序；(9)以克隆的目的片段為探針，從基因組文庫(kù)中篩選出相應(yīng)的全長(zhǎng)基因。技術(shù)一般步驟(1)提取總RNA，在這個(gè)步驟中注意不能有DNA污染，一般mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖mRNA差別顯示技術(shù)解讀課件放射性自顯影技術(shù)放射性自顯影法與普通照相的曝光、顯影、定影原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射線使照相乳膠“感光”，再經(jīng)顯影和定影處理，將乳膠中因受輻照而致敏的鹵化銀顆粒還原成金屬銀，洗去未“感光”的鹵化銀后則圖像自然顯示出來(lái)。圖像中任何區(qū)域的黑度取決于留存的金屬銀的量，它反映了射線在這個(gè)區(qū)域所沉積的能量。記錄、檢查和測(cè)量整體和組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平中放射性示蹤物的分布、進(jìn)行定性和半定量測(cè)定，稱為放射自顯影法。

放射性自顯影技術(shù)放射性自顯影法與普通照相的曝光、顯影DD的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA因?yàn)閺膬煞N或更多的特定組織樣品來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物在同一塊膠上鑒定，因此能用于鑒定特定組織或細(xì)胞來(lái)源樣品之間轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的定性和定量變化可以同時(shí)檢測(cè)到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可步步驗(yàn)證比較可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析

DD的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)DD的缺點(diǎn)

每種技術(shù)的誕生都不可能是完美的，mRNA差異顯示技術(shù)雖然從創(chuàng)立時(shí)起就很受歡迎，但是許多研究者發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定缺陷，其中三點(diǎn)較為突出：第一，操作步驟多，外源DNA污染嚴(yán)重而導(dǎo)致假陽(yáng)性率高，即差異片斷用Northern雜交時(shí)無(wú)陽(yáng)性信號(hào)，重復(fù)穩(wěn)定性較差。據(jù)研究，這種假陽(yáng)性率可高達(dá)70％第二，獲得的差異條帶短小，多為300bp左右，并且多為3’端非編碼區(qū)序列（UTR），難以直接判斷其功能和意義。第三，必須采用放射性同位素標(biāo)記反應(yīng)，使得實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高、易造成同位素污染，且不好回收差異片斷。DD的缺點(diǎn)每種技術(shù)的誕生都不可能是完美的，mR（１）用無(wú)ＲＮＡ酶的ＤＮＡ酶處理總ＲＮＡ，防止ＤＮＡ污染。（２）使用Ｔａｇ酶時(shí)，批號(hào)應(yīng)相同，不要經(jīng)常調(diào)換。（３）ＰＣＲ循環(huán)次數(shù)減至３０次，提高退火溫度，減少非特異性條帶。（４）把從測(cè)序膠上切下來(lái)的條帶純化后分成兩部分，一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩選克隆。（５）改變引物長(zhǎng)度，如有的在３′端錨定引物和５′端各加上１０個(gè)堿基，帶上ＥｃｏＲＩ雙酶切位點(diǎn)，如此可顯著提高重復(fù)性改進(jìn)方法（１）用無(wú)ＲＮＡ酶的ＤＮＡ酶處理總ＲＮＡ，防止ＤＮＡ污染。改三.mRNA差異顯示技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功運(yùn)用于動(dòng)物的胚胎發(fā)育、組織分化、生長(zhǎng)因子激活與抑制、細(xì)胞周期控制、癌變及疾病相關(guān)基因的鑒定和克隆，在植物無(wú)性繁殖、形態(tài)發(fā)生、次生代謝、抗逆抗病等方面被用來(lái)進(jìn)行基因的鑒定、克隆以及功能研究，并取得很好的結(jié)果。概括起來(lái)其主要用途可以歸納為以下三點(diǎn)：第一，尋找差異表達(dá)的基因。第二，研究個(gè)體、種群或品種間轉(zhuǎn)錄水平上的遺傳變異。第三，鑒定經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中控制重要數(shù)量經(jīng)濟(jì)性狀位點(diǎn)的基因。三.mRNA差異顯示技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用mRNA差異顯示技基因的鑒定與克隆差異顯示技術(shù)目前已成為鑒定和克隆基因的重要方法。Ｈａｎｎａｐｐｅｌ等利用一對(duì)近等基因系，研究了西紅柿基因組特異區(qū)。這對(duì)近等基因系中有一個(gè)含有抗煙草花葉病毒（ＴＭＶ）抗性基因Ｔｍ－２ａ，一個(gè)不含。這兩個(gè)近等基因系有一個(gè)差異片段，克隆后經(jīng)Ｎｏｒｔｈｅｒｎ雜交證實(shí)是陽(yáng)性克隆，并且發(fā)現(xiàn)，這個(gè)片段與抗性有密切關(guān)系。Ｊｏｓｈｉ利用修飾的差異顯示法克隆了小麥ＨＳＰ７０基因族的３個(gè)公認(rèn)的基因，他認(rèn)為差異顯示法在很短時(shí)間內(nèi)就可以克隆基因。Ｋｎａａｐ和Ｋｅｎｄｅ克隆了水稻的赤霉素調(diào)控基因，利用赤霉素處理水稻，一個(gè)誘導(dǎo)，一個(gè)不誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)二者在差異顯示時(shí)，ｍＲＮＡ表達(dá)量相差１０倍，因而很容易克隆了一個(gè)赤霉素調(diào)控基因。Ｓｈａｒｍａ和Ｄａｖｉｓ利用差異顯示法，分析了擬南芥對(duì)臭氧的反應(yīng)。擬南芥用臭氧處理后，在根和成熟花中，臭氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物ＡｔＯＺＩ１ｍＲＮＡ含量極高，是葉的３～５倍。序列分析證明，ＡｔＯＺＩ１編碼一個(gè)Ｍｒ８６００蛋白多肽，其序列與已知的蛋白序列基本一致，充分表明差異顯示方法是克隆基因的有效方法。趙大中等比較春化過(guò)和不春化的小麥，發(fā)現(xiàn)春化２０ｄ的小麥有一個(gè)與春化相關(guān)的ｃＤＮＡ克隆，經(jīng)Ｎｏｒｔｈｅｒｎ雜交和同源性分析，證明ＶＲＣ５４是春化特異克隆片段，該克隆片段的基因?qū)Υ夯枨笮椭参锏某苫ㄕT導(dǎo)起重要作用?；虻蔫b定與克隆差異顯示技術(shù)目前已成為鑒定和研究激素對(duì)植物發(fā)育的影響在植物的發(fā)育過(guò)程中，激素自始至終起著作用，調(diào)控著植物的器官形成、生長(zhǎng)發(fā)育。研究其作用具有重要意義。Peters等發(fā)現(xiàn)，用玉米素處理紅葉藜的細(xì)胞時(shí)，mRNA表達(dá)量迅速增加，從而使細(xì)胞分裂加快。Chen等發(fā)現(xiàn)，用赤霉素處理水稻幼苗，然后采用mRNA差異顯示技術(shù)，處理過(guò)的幼苗中mRNA有特異的差異帶(UBCgene)?？寺〈似?，發(fā)現(xiàn)此片段影響基因調(diào)控過(guò)程中的某些蛋白。瞬時(shí)表達(dá)分析表明，該序列位于啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游231～159堿基位置；另外，還發(fā)現(xiàn)UBCgene可促進(jìn)α-淀粉酶基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)水稻幼苗發(fā)育。研究激素對(duì)植物發(fā)育的影響在植物的發(fā)育過(guò)程中研究抗病機(jī)制植物病害每年都使農(nóng)作物受到大量損失，因此提高農(nóng)作物的抗病能力不僅有利于減少損失，而且有利于減少農(nóng)藥使用和環(huán)境污染。目前研究植物抗病機(jī)理主要方法是探討植物－微生物的相互作用機(jī)制。Benito等［18］通過(guò)研究西紅柿真菌病害，利用差異顯示法對(duì)抗病機(jī)理進(jìn)行了探索。他們發(fā)現(xiàn)，健康的番茄葉和被真菌或煙草枯斑病毒侵染的番茄葉的mRNA有較大差異。在病菌侵入后，植物防衛(wèi)基因會(huì)迅速產(chǎn)生一系列mRNA，產(chǎn)生蛋白與病原菌相互作用，殺死病原菌或病毒。在相互作用過(guò)程中，有3個(gè)mRNA片段(ddB-2，ddB-5，ddB-47)大量積累，但相互作用后，則很快消失。這表明，植物的抗病與某些防衛(wèi)基因的瞬時(shí)表達(dá)有密切關(guān)系。研究抗病機(jī)制植物病害每年都使農(nóng)作物受到大量損失，因此DD的展望由于人們認(rèn)識(shí)的基因還不夠全面，特別是對(duì)生物發(fā)生、發(fā)育及病理生理過(guò)程中某些新的功能基因和調(diào)控作用認(rèn)識(shí)不足，因此差異顯示技術(shù)將在研究生物進(jìn)化、損傷修復(fù)、癌變及治療反應(yīng)過(guò)程中具有重要意義。差顯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)為在該領(lǐng)域中尋找新基因提供了有用的工具。相信隨著不斷的應(yīng)用和技術(shù)的不斷改善，差異顯示技術(shù)必越來(lái)越多的在生命科學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基因鑒定、克隆等方面起到更大的作用，對(duì)揭示生物界基因表達(dá)調(diào)控的奧秘將起重要作用。經(jīng)過(guò)近幾年的研究，在提高重復(fù)性，降低假陽(yáng)性方面有所改進(jìn)，尤其mRNA差異顯示試劑盒的商品化，為mRNA差異顯示提供了成套試劑，mRNA差異顯示技術(shù)將會(huì)越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)的研究。對(duì)進(jìn)一步揭開基因表達(dá)調(diào)控的奧秘，將發(fā)揮越來(lái)越大的作用。DD的展望由于人們認(rèn)識(shí)的基因還不夠全面，特別是對(duì)生物

mRNA差別顯示技術(shù)生工1班楊金鑫mRNA差別顯示技術(shù)生工1班主要內(nèi)容概述定義及原理應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)展望主要內(nèi)容

高等生物大約有3~5萬(wàn)個(gè)不同的基因，在每一個(gè)正常的體細(xì)胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細(xì)胞中僅有10%~20%的少部分基因被選擇性表達(dá)，這種選擇性表達(dá)是在發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化的根本原因，是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程的核心機(jī)制。因此，比較不同組織之間，或相同組織在不同生理?xiàng)l件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，可分離并克隆出這些特異性表達(dá)的基因。近年來(lái)，該領(lǐng)域的研究取得了很大進(jìn)展，扣除雜交（subtractivehybridization,SH）、基因芯片技術(shù)（DNAchiptechnique）、基因表達(dá)的系統(tǒng)分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、噬菌體全套抗體庫(kù)技術(shù)(phagedisplayantibodyrepertoirelibrarytechnique)和雙向電泳技術(shù)(two-dimensionalgelelectrophoresis)先后成功地建立。一.概述高等生物大約有3~5萬(wàn)個(gè)不同的基因，在每一個(gè)正基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。指在對(duì)信號(hào)或誘導(dǎo)物做出應(yīng)答時(shí)，選擇表達(dá)不同的基因，或使基因的表達(dá)水平有所不同?；虿町惐磉_(dá)基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。指在對(duì)信號(hào)或誘導(dǎo)物做出DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達(dá)基因強(qiáng)有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術(shù)方面做了大量改進(jìn)，使技術(shù)更適用、更簡(jiǎn)便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3）DNA電泳技術(shù)

DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立二.基本概念

mRNA差別顯示技術(shù)也稱為差示反轉(zhuǎn)錄PCR（DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR）簡(jiǎn)稱為ddRT-PCR。它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因。二.基本概念mRNA差別顯示技術(shù)也稱為差示反

反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。其原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptiRNA指紋

RNA首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下使RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，之后以其DNA為模板，通過(guò)以DNA指紋技術(shù)建立指紋圖譜進(jìn)行分析。DNA指紋

某些DNA序列的差異可通過(guò)限制性酶切片段長(zhǎng)度的改變反映出來(lái)，此即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。其主要原因是由于DNA序列個(gè)別堿基的突變而引起某個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的獲得或丟失，表現(xiàn)為不同長(zhǎng)度的酶切片段．RNA指紋RNA首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下使R水稻品種DNA指紋水稻品種DNA指紋基本原理

利用所有真核基因的mRNA的3’端都有一段多聚腺苷酸poly(A)尾結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，將不同來(lái)源的總mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,此cDNA合成是采用oligo(dT)12MN為引物，其中M為A,C,G中的任意一種，N為A,C,G或T中的任意一種，共有12種oligo(dT)12MN引物，其中M為錨定堿基可增大引物的Tm值，N稱為分類堿基，對(duì)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分類。用這12種引物分別對(duì)同一總mRNA樣品進(jìn)行cDNA合成，即進(jìn)行12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到12種類型的cDNA，從而也將總mRNA分為12個(gè)亞群。在此基礎(chǔ)上對(duì)每一類cDNA進(jìn)行隨機(jī)引物和相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物PCR擴(kuò)增，由于擴(kuò)增的cDNA片段被放射性同位素標(biāo)記，因而利用放射自顯影技術(shù)通過(guò)對(duì)不同組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，從而反映出不同樣品間基因的時(shí)間和空間上的組織特異性的表達(dá)?；驹砝盟姓婧嘶虻膍RNA的3’端都有一段

基本原理是，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個(gè)多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說(shuō)的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為模板，以oligo(dT)為引物合成出cDNA拷貝。根據(jù)mRNA分子3’-末端序列末端結(jié)構(gòu)的分析可以看到，在這段poly(A)序列起點(diǎn)堿基之前的一個(gè)堿基，除了為A的情況之外，只能有C、G、T三種可能。根據(jù)這種序列結(jié)構(gòu)特征，P.Peng等人設(shè)計(jì)合成三種不同的下游引物，它由11個(gè)或12個(gè)連續(xù)的脫氧核苷酸加上一個(gè)3’-末端錨定脫氧核苷酸組成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個(gè)mRNA群體在cDNA水平上分成三個(gè)亞群體。然后用一個(gè)上游的隨機(jī)引物和與反轉(zhuǎn)錄時(shí)相同的oligo(dT)引物對(duì)這個(gè)ｃＤＮＡ亞群體進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，因?yàn)檫@個(gè)上游的引物將隨機(jī)結(jié)合在cDNA上,因此來(lái)自不同ｍＲＮＡ的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是不同的，可以在測(cè)序膠上明顯分辨開來(lái)，從而篩選出不同樣品間基因差異表達(dá)的DNA片段?；驹硎?，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末mRNA差別顯示技術(shù)解讀課件5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機(jī)引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長(zhǎng)dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動(dòng)cDNA第一鏈合成不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴(kuò)增，克隆測(cè)序，同源比對(duì)隨機(jī)結(jié)合到cDNA鏈上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(1)提取總RNA，在這個(gè)步驟中注意不能有DNA污染，一般用無(wú)RNA酶的DNA酶在37℃下處理30min；(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以O(shè)ligoT11MN為引物(M為G、A、C中的任一種，N為A、C、G、T任一種)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；(3)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增cDNA的第一條鏈；(4)擴(kuò)增后的cDNA進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表達(dá)的cDNA片段在6%測(cè)序膠上分開；(5)找出不同處理間差異顯示的條帶，從膠上切割下來(lái)，并回收，再進(jìn)行第二次擴(kuò)增；(6)克隆差異片段，差異片段可作為探針；(7)Northern雜交，驗(yàn)證目的片段，去掉假陽(yáng)性片段；(8)對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序；(9)以克隆的目的片段為探針，從基因組文庫(kù)中篩選出相應(yīng)的全長(zhǎng)基因。技術(shù)一般步驟(1)提取總RNA，在這個(gè)步驟中注意不能有DNA污染，一般mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖mRNA差異顯示技術(shù)簡(jiǎn)略流程圖mRNA差別顯示技術(shù)解讀課件放射性自顯影技術(shù)放射性自顯影法與普通照相的曝光、顯影、定影原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射線使照相乳膠“感光”，再經(jīng)顯影和定影處理，將乳膠中因受輻照而致敏的鹵化銀顆粒還原成金屬銀，洗去未“感光”的鹵化銀后則圖像自然顯示出來(lái)。圖像中任何區(qū)域的黑度取決于留存的金屬銀的量，它反映了射線在這個(gè)區(qū)域所沉積的能量。記錄、檢查和測(cè)量整體和組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平中放射性示蹤物的分布、進(jìn)行定性和半定量測(cè)定，稱為放射自顯影法。

放射性自顯影技術(shù)放射性自顯影法與普通照相的曝光、顯影DD的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA因?yàn)閺膬煞N或更多的特定組織樣品來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物在同一塊膠上鑒定，因此能用于鑒定特定組織或細(xì)胞來(lái)源樣品之間轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的定性和定量變化可以同時(shí)檢測(cè)到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可步步驗(yàn)證比較可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析

DD的優(yōu)點(diǎn)以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)DD的缺點(diǎn)

每種技術(shù)的誕生都不可能是完美的，mRNA差異顯示技術(shù)雖然從創(chuàng)立時(shí)起就很受歡迎，但是許多研究者發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定缺陷，其中三點(diǎn)較為突出：第一，操作步驟多，外源DNA污染嚴(yán)重而導(dǎo)致假陽(yáng)性率高，即差異片斷用Northern雜交時(shí)無(wú)陽(yáng)性信號(hào)，重復(fù)穩(wěn)定性較差。據(jù)研究，這種假陽(yáng)性率可高達(dá)70％第二，獲得的差異條帶短小，多為300bp左右，并且多為3’端非編碼區(qū)序列（UTR），難以直接判斷其功能和意義。第三，必須采用放射性同位素標(biāo)記反應(yīng)，使得實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高、易造成同位素污染，且不好回收差異片斷。DD的缺點(diǎn)每種技術(shù)的誕生都不可能是完美的，mR（１）用無(wú)ＲＮＡ酶的ＤＮＡ酶處理總ＲＮＡ，防止ＤＮＡ污染。（２）使用Ｔａｇ酶時(shí)，批號(hào)應(yīng)相同，不要經(jīng)常調(diào)換。（３）ＰＣＲ循環(huán)次數(shù)減至３０次，提高退火溫度，減少非特異性條帶。（４）把從測(cè)序膠上切下來(lái)的條帶純化后分成兩部分，一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩選克隆。（５）改變引物長(zhǎng)度，如有的在３′端錨定引物和５′端各加上１０個(gè)堿基，帶上ＥｃｏＲＩ雙酶切位點(diǎn)，如此可顯著提高重復(fù)性改進(jìn)方法（１）用無(wú)ＲＮＡ酶的ＤＮＡ酶處理總ＲＮＡ，防止ＤＮＡ污染。改三.mRNA差異顯示技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功運(yùn)用于動(dòng)物的胚胎發(fā)育、組織分化、生長(zhǎng)因子激活與抑制、細(xì)胞周期控制、癌變及疾病相關(guān)基因的鑒定和克隆，在植物無(wú)性繁殖、形態(tài)發(fā)生、次生代謝、抗逆抗病等方面被用來(lái)進(jìn)行基因的鑒定、克隆以及功能研究，并取得很好的結(jié)果。概括起來(lái)其主要用途可以歸納為以下三點(diǎn)：第一，尋找差異表達(dá)的基因。第二，研究個(gè)體、種群或品種間轉(zhuǎn)錄水平上的遺傳變異。第三，鑒定經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中控制重要數(shù)量經(jīng)濟(jì)性狀位點(diǎn)的基因。三.mRNA差異顯示技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用mRNA差異顯示技基因的鑒定與克隆差異顯示技術(shù)目前已成為鑒定和克隆基因的重要方法。Ｈａｎｎａｐｐｅｌ等利用一對(duì)近等基因系，研究了西紅柿基因組特異區(qū)。這對(duì)近等基因系中有一個(gè)含有抗煙草花葉病毒（ＴＭＶ）抗性基因Ｔｍ－２ａ，一個(gè)不含。這兩個(gè)近等基因系有一個(gè)差異片段，克隆后經(jīng)Ｎｏｒｔｈｅｒｎ雜交證實(shí)是陽(yáng)性克隆，并且發(fā)現(xiàn)，這個(gè)片段與抗性有密切關(guān)系。Ｊｏｓｈｉ利用修飾的差異顯示法克隆了小麥ＨＳＰ７０基因族的３個(gè)公認(rèn)的基因，他認(rèn)為差異顯示法在很短時(shí)間內(nèi)就可以克隆基因。Ｋｎａａｐ和Ｋｅｎｄｅ克隆了水稻的赤霉素調(diào)控基因，利用赤霉素處理水稻，一個(gè)誘導(dǎo)，一個(gè)不誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)二者在差異顯示時(shí)，ｍＲＮＡ表達(dá)量相