熒光蛋白表達(dá)課件

熒光蛋白表達(dá)課件熒光蛋白表達(dá)課件1背景介紹背景介紹2綠色熒光蛋白GFP綠色熒光蛋白GFP3熒光蛋白表達(dá)課件4增強(qiáng)型GFP（EGFP）

野生型GFP折疊易受溫度影響，發(fā)光較弱，并且在某些細(xì)胞中不表達(dá)，因此人們運(yùn)用定點(diǎn)突變等技術(shù)對野生型GFP進(jìn)行了改造。目前應(yīng)用較為廣泛的是增強(qiáng)型GFP（EGFP），它是將Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使GFP的熒光強(qiáng)度提高了35倍，而且激發(fā)后16~24h后仍可穩(wěn)定地檢測到熒光。增強(qiáng)型GFP（EGFP）野生型GFP折疊易受溫度影響，5GFP的熒光性質(zhì)及應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)(1)易于檢測，靈敏度高。(2)熒光性質(zhì)穩(wěn)定。(3)對細(xì)胞無毒害。(4)構(gòu)建載體方便。(5)可直接用于活細(xì)胞測定。(6)不受假陽性干擾。(7)廣譜性。(8)易于得到突變體。GFP的熒光性質(zhì)及應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)(1)易于檢測，靈敏度高。6熒光蛋白表達(dá)課件7EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結(jié)構(gòu)。氨基酸序列：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的8綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用前景廣闊。GFP及其突變體已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)空間定位、生物分子之間相互作用、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面?；谛滦凸δ軣晒獾鞍?如光激活熒光蛋白和光轉(zhuǎn)換熒光蛋白和氧化還原敏感的GFP等)的光學(xué)分子成像技術(shù)的發(fā)展，為在活細(xì)胞乃至活體動(dòng)物內(nèi)研究基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能提供了更多的選擇空間。綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)9GFP用途1、作為轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的篩選標(biāo)記2、GFP在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用2.1在生物學(xué)研究中的應(yīng)用2.2在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用2.3在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用GFP用途1、作為轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的篩選標(biāo)記101、作為轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的篩選標(biāo)記

分子標(biāo)記：作為一種新型的報(bào)告基因，GFP已在生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用綠色熒光蛋白獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(proteintagging)，即利用DNA重組術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。1、作為轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的篩選標(biāo)記分子標(biāo)記：作為一11GFP的相對分子質(zhì)量小，能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而保持其天然蛋白質(zhì)的特性，可特異地進(jìn)行蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的地位研究。大量實(shí)驗(yàn)表明，GFP可定位到細(xì)胞核、細(xì)胞骨架、葉綠體、線粒體等細(xì)胞器中。另外、將GFP作為活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的標(biāo)記分子，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微技術(shù)可以研究細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用。GFP的相對分子質(zhì)量小，能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而122.1在生物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP可以作為標(biāo)記分子，目前已被廣泛應(yīng)用于基因標(biāo)記、蛋白質(zhì)標(biāo)記、環(huán)境微生物研究、寄生蟲學(xué)研究以及發(fā)育生物學(xué)研究中基因表達(dá)模式的探索等方面，成為活細(xì)胞分子水平研究的工具。目前生物農(nóng)藥的殺蟲效果往往得不到準(zhǔn)確評估，而利用GFP標(biāo)記，通過熒光觀察可以避免評估殺蟲劑殺蟲效果時(shí)僅僅記錄有典型感染癥狀的害蟲個(gè)體，而忽視無明顯感染癥狀但確實(shí)已經(jīng)感染或正在感染的害蟲個(gè)體，同時(shí)無需進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定即可方便地區(qū)分殺蟲劑致死和天然病原致死，從而客觀準(zhǔn)確地評價(jià)殺蟲劑的毒力。2.1在生物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP可以作為標(biāo)記分子，目前132.2在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用GFP在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用將GFP基因直接導(dǎo)入目標(biāo)生物或?qū)FP基因克隆到病毒、細(xì)菌或質(zhì)粒上，通過它們的介導(dǎo)而間接標(biāo)記目標(biāo)生物，進(jìn)行生態(tài)學(xué)規(guī)律研究。用GFP基因標(biāo)記遺傳工程微生物以監(jiān)測其在水環(huán)境中的存活和去向。朱應(yīng)等構(gòu)建了帶GFP基因的重組棉鈴蟲病毒。該病毒一次感染棉鈴蟲后不再重復(fù)感染，室內(nèi)飼養(yǎng)3代，各代均可見典型的發(fā)綠色熒光的棉鈴蟲，表明病毒可以介導(dǎo)GFP標(biāo)記其宿主，預(yù)計(jì)將為研究棉鈴蟲的遷飛和暴發(fā)規(guī)律提供強(qiáng)有力的手段。跟蹤觀察微生物。傳統(tǒng)方法中，一般用熒光染料標(biāo)記微生物，由于微生物的分裂，燃料被稀釋，因此長期以來未能觀察到微生物侵入活細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)過程。GFP基因能克服上述的缺點(diǎn)，且在活細(xì)胞中能直接觀察到無需破壞原有細(xì)胞而阻止感染的繼續(xù)進(jìn)行。2.2在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用GFP在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用將GFP基因142.3在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用在組織工程的種子細(xì)胞研究中，有學(xué)者利用GFP示蹤證實(shí)了脂肪來源的干細(xì)胞的分化方向和分化能力；利用增強(qiáng)型GFP篩選合適的生物材料，如發(fā)現(xiàn)最合適的構(gòu)建氣管軟骨的細(xì)胞來源是肋軟骨細(xì)胞。GFP還用于細(xì)胞因子作用的研究，如發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子的持續(xù)表達(dá)可以延緩成牙骨質(zhì)細(xì)胞的鈣化過程；以及活體動(dòng)態(tài)觀察的研究，為脊柱和椎間盤等部位的細(xì)胞治療或基因治療后的隨訪建立了新研究方法。在藥學(xué)研究中，用GFP對目的物進(jìn)行標(biāo)記，分析目的物在細(xì)胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而從眾多的化合物中篩選出與體內(nèi)信號分子功能相似“潛力”化合物，這樣的方法簡便易行。因此，GFP成為了藥物篩選及藥物作用機(jī)制研究中的有力工具。2.3在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用在組織工程的種子細(xì)胞研究中，有學(xué)15在眼科中，許多視網(wǎng)膜疾病如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變等由于遺傳缺陷或基因表達(dá)異常等導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常、代謝紊亂或促進(jìn)與抑制新生血管形成因子表達(dá)，從而嚴(yán)重危害視力。GFP也廣泛應(yīng)用于視網(wǎng)膜的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、目的基因的調(diào)控及感光細(xì)胞凋亡保護(hù)的研究。在免疫學(xué)治療方面，應(yīng)用GFP作為表皮生長因子受體研究的工具，并對第二信使蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，這不僅可以揭示其在活細(xì)胞內(nèi)作用，還可以觀察一些抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑等信號傳導(dǎo)抑制藥物的作用效應(yīng)。在眼科中，許多視網(wǎng)膜疾病如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性16紅色熒光蛋白RFP紅色熒光蛋白RFP17紅色熒光蛋白的來源

1999年,Matz等從印度洋2太平洋地區(qū)的珊瑚蟲中分離出6種與綠色熒光蛋白(greenfluorescentproteins,GFP)同源的熒光蛋白,并鑒定了它們的光譜性質(zhì)。其中來源于Discosomasp.紅色熒光蛋白(drFP583)在紫外線的照射下可發(fā)射紅色熒光,其最大吸收波長為558nm,最大發(fā)射波長為583nm。其發(fā)射波長較長,靈敏度與信噪比均比GFP高,為基于GFP的體內(nèi)研究提供了一個(gè)很好的互補(bǔ)工具。紅色熒光蛋白的來源1999年,Matz18紅色熒光蛋白的演變drFP583具有自身的缺點(diǎn),如寡聚化、成熟過程緩慢和對細(xì)胞有毒性等限制了它的應(yīng)用。因此,人們對其進(jìn)行各種修飾和改進(jìn),以得到不同發(fā)光特性、不同聚集狀態(tài)及適于不同細(xì)胞的突變體。最先進(jìn)行突變實(shí)驗(yàn)的是drFP583,而Clontech公司已將它的一個(gè)低毒、低寡聚化及成熟快的突變體E572NA商業(yè)化,商品名為DsRed。第二代DsRed，即大家所熟知的DsRed2，它的多肽氨基末端已經(jīng)進(jìn)行了一些突變改造，這樣就可以使組織蛋白凝

集和降低毒性。

在第三代DsRed的突變體中，成熟時(shí)間

更短，熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)。紅色熒光蛋白的演變drFP583具有自19熒光蛋白表達(dá)課件20紅色熒光蛋白序列紅色熒光蛋白序列21紅色熒光蛋白的應(yīng)用

紅色熒光蛋白極大的豐富了細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)光學(xué)成像的熒光探針，使其能夠與生物體內(nèi)多種物質(zhì)聯(lián)合，實(shí)現(xiàn)對生物體內(nèi)生命物質(zhì)活動(dòng)的監(jiān)視，紅色熒光蛋白在繼綠色熒光蛋白后，在某種定義下可以說是革新了生物學(xué)研究——運(yùn)用紅色熒光蛋白可以檢測到細(xì)胞的活動(dòng)，可以標(biāo)記表達(dá)蛋白，可以進(jìn)行深入的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)等。特別是在癌癥的研究過程中，由于紅色熒光蛋白的出現(xiàn)使得科學(xué)家們能夠觀測到腫瘤細(xì)胞的具體活動(dòng)，比如腫瘤細(xì)胞的成長、入侵、轉(zhuǎn)移和新生等，應(yīng)用前景廣泛。紅色熒光蛋白的應(yīng)用紅色熒光蛋白極大的豐富22紅色熒光蛋白的應(yīng)用

在活細(xì)胞及動(dòng)物全身成像中需要表現(xiàn)較好的紅色熒光蛋白，主要是由于在多種顏色成像實(shí)驗(yàn)中需要紅色探針，另外基于較長的激發(fā)波長產(chǎn)生的光毒性較小，可以用來探測較深的生物組織。紅色熒光蛋白的應(yīng)用在活細(xì)胞及動(dòng)物全身成23黃色熒光蛋白YFP黃色熒光蛋白YFP24

黃色熒光蛋白（YellowFluorescentProtein，YFP）可以看做GFP一種突變體，最初來源于維多利亞多管水母（Aequoreavictoria）。相對于綠色熒光蛋白，其熒光向紅色光譜偏移，而這主要是由于蛋白203位蘇氨酸變?yōu)槔野彼?。其最大激發(fā)波長為514nm，最大發(fā)射波長為527nm。黃色熒光蛋白（YellowFluorescentPr25熒光蛋白表達(dá)課件26YFP序列1atgaagttcgttgtacgggccctgaccgcgaccgccgtggcggcggcggtcgccgccctc61gccggatgctcggcgacctcgccggcccccggctccgccgagggctcctcagcggggacg121aagctcgtcgtctacacgccgcagggcgaccccgtgcgcgggggctacatcaccaagcac181gccaaatcggacctcggcctggacgtaaagctggtcaacggggcgggcggagatctcgcc241acccgcctcatcgccgagaagaacaacccgcaggcggacgtcgtcgtcgtcctcggggca301ccgcagctcaaccggatcgaccaggcgggtgtgctccagcctttcgctccagactgggcc361ggcaagatcccgtccgccttcgcgtccggaagcaaggacttcacactgctgacgcagacc421ccgatcgcgatcgcctacaacgcgtccacgatgacggcggcccaggcgccgagcagttgg481acggacctggccaagccggagtacaaggacaagttcgccttcccggccctcaccagccag541acgggccaggcggcagccgtgggaatcctgtggcgctacgccgatcacacgaccggcacg601gtgtcgcagaaaggctgggacacgctcgccgcgatcctccacaacgccaagcagaccgcc661gccggcgcgccgttcgactgggcacaggtgaggtccggcgttcagccgatcgtggtgagc721tggctgggcggcattcaaaccggcacctccgacaacaccatcgacctcaggatcgtcgac781gccgtcggcgggagcccgttcgtcaacggcggcgtcggcatggtcaaggacacgaagaac841gcagccgcggcccgcaagttcatcgactggttcggctccgacagcttccaggtcgggttc901gtcaccgcgacgaagaacgatacccccctcaacccggatgcggtcaagcggctccccggg961gccgagcagggactgcgccaggtcaccccgcagaagatcgactggggcgtggtgtcccag1021cgcctctcggactggttgcagaagatccagctcgatgtgcagggctgaYFP序列1atgaagttcgttgta27

像綠色熒光蛋白一樣，YFP是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中一種非常常用的報(bào)告基因。目前，有三種改良的黃色熒光蛋白：Citrine,Venus,andYpet。這三種改良的蛋白熒光更亮，更穩(wěn)定，而且成熟更快，因此應(yīng)用廣泛。黃色熒光蛋白最常用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，作為熒光能量的接受體（acceptor）。像綠色熒光蛋白一樣，YFP是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中一種282.所用質(zhì)粒介紹PUC19質(zhì)粒

大腸桿菌克隆用質(zhì)粒pUC19,簡稱pUC19，是質(zhì)粒載體的一種。在由限制性核酸內(nèi)切酶修飾過的質(zhì)粒DNA序列中插入外源的目的基因，以質(zhì)粒為載體，將目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法導(dǎo)進(jìn)宿主細(xì)胞，pUC19常用于DNA片段克隆、DNA測序、外源基因表達(dá)等。

pUC19大小只有2686bp，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的DNA片段，GenBank注冊號為L08752(pUC18)和X02514(pUC19)。由pBR322改造而來，其中l(wèi)acZ(MSC)來自M13mp18/19圖3-4是其質(zhì)粒圖譜。pUC系列載體含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細(xì)胞中可表現(xiàn)α-互補(bǔ)作用。因此在多克隆位點(diǎn)中插入了外源片段后，可通過α-互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。

2.所用質(zhì)粒介紹PUC19質(zhì)粒大腸桿菌克隆用質(zhì)粒pUC129熒光蛋白表達(dá)課件30pET-28a載體

pET-28a-c(+)載體帶有一個(gè)N端的His/Thrombin/T7蛋白標(biāo)簽，同時(shí)含有一個(gè)可以選擇的C端His標(biāo)簽。pET28a載體的單一的多克隆位點(diǎn)見上面的環(huán)狀質(zhì)粒圖譜。注意：載體序列是以pBR322質(zhì)粒的編碼規(guī)矩進(jìn)行編碼的，所以T7蛋白表達(dá)區(qū)在質(zhì)粒圖譜上面是反向的。

T7RNA聚合酶啟動(dòng)的克隆和表達(dá)區(qū)域在質(zhì)粒圖譜中也被標(biāo)注了出來。質(zhì)粒的F1復(fù)制子是被定向的，所以在T7噬菌體聚合酶的作用下，包含有蛋白編碼序列的病毒粒子能夠產(chǎn)生，并啟動(dòng)蛋白表達(dá)，同時(shí)蛋白表達(dá)將被T7終止子序列(Cat.No.69337-3)的作用下終止蛋白翻譯。pET-28a載體

pET-28a-c(+)載體帶有一個(gè)31熒光蛋白表達(dá)課件32兩種菌株差異

克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因表達(dá)相關(guān)的酶，

不能夠表達(dá)出目的基因，轉(zhuǎn)入的載體在其中大量復(fù)制；表達(dá)宿主：E.coliBL21（DE3）則可以表達(dá)出目的基因，即得到綠色、黃色、紅色的熒光蛋白。兩種菌株差異克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因33兩種載體差異克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細(xì)菌，將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接，再導(dǎo)入原核細(xì)菌內(nèi)，質(zhì)粒會(huì)在原核細(xì)菌內(nèi)大量復(fù)制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定會(huì)表達(dá)，但一定被大量復(fù)制。表達(dá)載體：就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動(dòng)子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達(dá)的載體?？寺≥d體目的在于復(fù)制足夠多的目標(biāo)質(zhì)粒，所以常帶有較強(qiáng)的自我復(fù)制元件，如復(fù)制起始位點(diǎn)等，往往在菌體內(nèi)存在多拷貝，所以抽質(zhì)粒會(huì)抽出一大堆，但不具備表達(dá)元件。而表達(dá)質(zhì)粒有復(fù)雜的構(gòu)成，為的是控制目標(biāo)蛋白的表達(dá)，如各種啟動(dòng)子（T7），調(diào)節(jié)子（LacZ）等，而且以pET為代表的表達(dá)載體在菌體內(nèi)都是低拷貝的，防止?jié)B漏表達(dá)。

是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子--核糖體結(jié)合位點(diǎn)--克隆位點(diǎn)--轉(zhuǎn)錄終止信號，這是用來區(qū)別克隆載體和表達(dá)載體的標(biāo)志。兩種載體差異克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細(xì)菌，將343.大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因工程中常用的工具。雖然它不能像真核系統(tǒng)一樣進(jìn)行翻譯后加工，但由于其遺傳背景相對比較清楚，使用安全、操作簡便、周期短、經(jīng)濟(jì)，因此仍然是使用最廣泛的、也是不可被替代的系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)的核心是表達(dá)載體。用來在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的載體有很多種。構(gòu)建有效的表達(dá)載體是表達(dá)目的基因的基本要求，同時(shí)也是影響基因表達(dá)水平以及蛋白活性的總要因素。標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌表達(dá)載體的主要組成包括：啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始區(qū)、多克隆位點(diǎn)、終止子、復(fù)制起點(diǎn)以及抗性篩選因子等。3.大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因工353.大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)一般來說,這些載體應(yīng)滿足以下要求:重組質(zhì)?？截悢?shù)高，表達(dá)量高適用范圍廣表達(dá)產(chǎn)物容易純化在菌體內(nèi)穩(wěn)定性好目前已知的應(yīng)用較廣的大腸桿菌表達(dá)載體有非融合表達(dá)載體、融合表達(dá)載體、分泌型表達(dá)載體和表面呈現(xiàn)表達(dá)載體等。3.大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)一般來說,這些載體應(yīng)滿足36

pET表達(dá)系統(tǒng)簡介pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng),它是最初由Studier等利用與啟動(dòng)子配套能高效轉(zhuǎn)錄特定基因的外源RNA聚合酶構(gòu)建的T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng),可以從各種基因(包括原核、真核細(xì)胞)生產(chǎn)大量的目的蛋白,pET表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:

※優(yōu)化靶蛋白表達(dá):pET系統(tǒng)以其獨(dú)特的優(yōu)勢和載體、宿主之間重組的“協(xié)調(diào)”而優(yōu)化特異靶蛋白表達(dá)。

※嚴(yán)格控制基礎(chǔ)表達(dá)水平:

pET表達(dá)系統(tǒng)能嚴(yán)格控制誘導(dǎo)劑缺失時(shí)的基礎(chǔ)表達(dá)水平,許多難用其他E1coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的基因可在pET系統(tǒng)中高效穩(wěn)定地克隆和表達(dá)。

※宿主菌的最佳背景:pET系統(tǒng)有11種不同DE3溶原化宿主菌,其中使用最廣泛的為BL21及其衍生菌株,它的優(yōu)點(diǎn)在于缺失lon和ompT蛋白酶。

pET表達(dá)系統(tǒng)簡介374.SDS原理及蛋白分離與檢測

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS，polyacrylamidegelelectrophoresis）方法可對蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離，并可精確測得蛋白質(zhì)的分子量。常用的方法為SDS不連續(xù)系統(tǒng)。4.SDS原理及蛋白分離與檢測38

SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。熒光蛋白表達(dá)課件39

SDS首次由Shapiro等提出后,已成為廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離的一種方法。由于SDS是一種陰離子去污劑,在還原劑(β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇,DTT)存在下,能破壞蛋白質(zhì)亞基之間的非共價(jià)鍵,使其解離成單個(gè)的亞基,能按照一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物,其負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷,也就消除或降低不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別,這樣就使電泳遷移率只取決于相對分子量大小這一因素。由于SDS儀器簡單、操作方便、重復(fù)性好、可靠性強(qiáng),除了測定蛋白質(zhì)分子量外,還可以作為一種分離、純化的工具,此方法對于其他方法難溶的復(fù)合酶、病毒、及膜蛋白都可通過其解離作用而進(jìn)行分析,而且對于某些變性蛋白質(zhì)也能很方便直觀的分離出來。SDS首次由S40實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)416.重組蛋白的SDS檢測1.獲得目的基因5.EGFP基因的原核表達(dá)及檢測3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coliDH5α2.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliBL216.重組蛋白的SDS檢測1.獲得目的基因5.42詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程43一、實(shí)驗(yàn)試劑上、下游引物,ddH2O,10XBuffer,dNTP,質(zhì)粒pEGFP-N3&pET-28a(+),TaqDNA聚合酶,限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ&EcoRⅠ,T4DNA連接酶,CaCl2溶液,膠回收試劑盒(BindingBuffer,洗脫緩沖液,SPWWashbuffer),質(zhì)粒小提試劑盒(含有RnaseA的溶液I,溶液II,溶液III,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer),LB培養(yǎng)基(LP0042TRYRTONE1%,LP0021YEASTEXTRACT0.5%,NaCl1%),麥康凱培養(yǎng)基(蛋白胨17g,脙胨3g,豬膽鹽5g,NaCl5g,瓊脂17g,ddH2O1000mL,乳糖10g,0.01%結(jié)晶紫水溶液10mL,0.5%中性紅水溶液5mL),卡那霉素,TAE,EB溶液;30%丙烯酰胺(Acr);10%SDS;1.5mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.9);1.0mol/LTris-HCl緩沖液(pH6.8);0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0);TEMED;樣品溶解液;固定液;染色液;脫色液。一、實(shí)驗(yàn)試劑44二、實(shí)驗(yàn)儀器PCR儀、1.5ml離心管、PCR管、移液槍、酒精燈、槍尖、Ep管、培養(yǎng)皿、牙簽、試管、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、離心機(jī)、旋渦振蕩器、微波爐、電泳儀、制膠槽、電泳槽、梳子、錐形瓶、電子天平、手套、接種環(huán)、玻璃板、制膠板、模具、電吹風(fēng)、SDS電泳儀二、實(shí)驗(yàn)儀器451.獲得目的基因1.獲得目的基因46熒光蛋白表達(dá)課件472.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上2.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上483.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coliDH5α3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coliDH5α494.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliBL214.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliBL21505.EGFP基因的原核表達(dá)及檢測5.EGFP基因的原核表達(dá)及檢測516.重組蛋白的SDS檢測6.重組蛋白的SDS檢測52預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果53pET-28a：5369bp左右EGFP：6.1kb左右ERFP：6kb左右EYFP：6.5kb1.目的基因和pET-28a質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果：pET-28a：5369bp左右1.目的基因和pET-28a54SDS：樣品在26KD存在條帶，對照1和對照2沒有；自然光下菌落呈綠色可說明pET28a-EGFP能夠在原核系統(tǒng)中得到高效表達(dá),并且表達(dá)效果較好。2.熒光蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與檢測：SDS：樣品在26KD存在條帶，對照1和對照2沒有55參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)56[1]ShimomuraO,JohnsonFH,SaigaY.Extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea[J].J.Cell.Comp.Physiol.,1962,59(3):223239.[2]吳沛橋,巴曉革,胡海,等.綠色熒光蛋白GFP的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究,2009,28(1):8386.[3]馬金石.綠色熒光蛋白[J].化學(xué)通報(bào),2009,72(3):243250.[4]代文杰,呂曉穎,周保國,等.人源化綠色熒光蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)檢測[J].肝膽胰外科雜志,2002,14(4):213214.[5]ParkKW,CheongHT,LaiL,etal.Productionofnucleartransferderivedswinethatexpresstheenhancedgreenfluorescentprotein[J].AniBiotech,2001,12(2):173181.[6]SkadsenRW,HohnTM.UseofFusariumgraminearumtransformedwithgfptofollowinfectionpatternsinbarleyandArabidopsis[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology,2004,64(1):4553.[7]張國增,王強(qiáng).熒光染料在植物細(xì)胞Ca2+濃度測定中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(9):198201.[8]郝鋼躍,張維東,張?jiān)掠?等.穩(wěn)定高表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因膀胱癌細(xì)胞株的構(gòu)建[J].山東醫(yī)藥,2009,49(46):13.[9]王婧,李昌,李林溪,等.反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)HIV1Gag蛋白和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白細(xì)胞系的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(2):203209.[1]ShimomuraO,JohnsonFH,57【10】曲萍，隋延仿等.增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的基因克隆、表達(dá)及蛋白純化.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2006;35:10.【11】吳沛橋，巴曉革等.綠色熒光蛋白GFP的研究進(jìn)展及應(yīng)用.生物醫(yī)學(xué)工程研究，2009,28（1）：83~86.【12】戎晶晶,刁振宇,周國華.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展.藥物生物技術(shù),2005,12(6):416~420.【13】柴玉波，陳蘇民.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體的類型及其研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊1997年第19卷第4期.【14】解庭波.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展.長江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008年9月第5卷第3期.【15】高艷利，楊思文等.SDS電泳技術(shù)分析蛋白質(zhì)的研究.遼寧化工，2007年7月第36卷第7期?！?0】曲萍，隋延仿等.增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的基因克隆、表達(dá)及58熒光蛋白表達(dá)課件熒光蛋白表達(dá)課件59背景介紹背景介紹60綠色熒光蛋白GFP綠色熒光蛋白GFP61熒光蛋白表達(dá)課件62增強(qiáng)型GFP（EGFP）

野生型GFP折疊易受溫度影響，發(fā)光較弱，并且在某些細(xì)胞中不表達(dá)，因此人們運(yùn)用定點(diǎn)突變等技術(shù)對野生型GFP進(jìn)行了改造。目前應(yīng)用較為廣泛的是增強(qiáng)型GFP（EGFP），它是將Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使GFP的熒光強(qiáng)度提高了35倍，而且激發(fā)后16~24h后仍可穩(wěn)定地檢測到熒光。增強(qiáng)型GFP（EGFP）野生型GFP折疊易受溫度影響，63GFP的熒光性質(zhì)及應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)(1)易于檢測，靈敏度高。(2)熒光性質(zhì)穩(wěn)定。(3)對細(xì)胞無毒害。(4)構(gòu)建載體方便。(5)可直接用于活細(xì)胞測定。(6)不受假陽性干擾。(7)廣譜性。(8)易于得到突變體。GFP的熒光性質(zhì)及應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)(1)易于檢測，靈敏度高。64熒光蛋白表達(dá)課件65EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結(jié)構(gòu)。氨基酸序列：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的66綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用前景廣闊。GFP及其突變體已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)空間定位、生物分子之間相互作用、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面?；谛滦凸δ軣晒獾鞍?如光激活熒光蛋白和光轉(zhuǎn)換熒光蛋白和氧化還原敏感的GFP等)的光學(xué)分子成像技術(shù)的發(fā)展，為在活細(xì)胞乃至活體動(dòng)物內(nèi)研究基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能提供了更多的選擇空間。綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)67GFP用途1、作為轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的篩選標(biāo)記2、GFP在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用2.1在生物學(xué)研究中的應(yīng)用2.2在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用2.3在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用GFP用途1、作為轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的篩選標(biāo)記681、作為轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的篩選標(biāo)記

分子標(biāo)記：作為一種新型的報(bào)告基因，GFP已在生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用綠色熒光蛋白獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(proteintagging)，即利用DNA重組術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。1、作為轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的篩選標(biāo)記分子標(biāo)記：作為一69GFP的相對分子質(zhì)量小，能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而保持其天然蛋白質(zhì)的特性，可特異地進(jìn)行蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的地位研究。大量實(shí)驗(yàn)表明，GFP可定位到細(xì)胞核、細(xì)胞骨架、葉綠體、線粒體等細(xì)胞器中。另外、將GFP作為活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的標(biāo)記分子，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微技術(shù)可以研究細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用。GFP的相對分子質(zhì)量小，能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而702.1在生物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP可以作為標(biāo)記分子，目前已被廣泛應(yīng)用于基因標(biāo)記、蛋白質(zhì)標(biāo)記、環(huán)境微生物研究、寄生蟲學(xué)研究以及發(fā)育生物學(xué)研究中基因表達(dá)模式的探索等方面，成為活細(xì)胞分子水平研究的工具。目前生物農(nóng)藥的殺蟲效果往往得不到準(zhǔn)確評估，而利用GFP標(biāo)記，通過熒光觀察可以避免評估殺蟲劑殺蟲效果時(shí)僅僅記錄有典型感染癥狀的害蟲個(gè)體，而忽視無明顯感染癥狀但確實(shí)已經(jīng)感染或正在感染的害蟲個(gè)體，同時(shí)無需進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定即可方便地區(qū)分殺蟲劑致死和天然病原致死，從而客觀準(zhǔn)確地評價(jià)殺蟲劑的毒力。2.1在生物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP可以作為標(biāo)記分子，目前712.2在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用GFP在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用將GFP基因直接導(dǎo)入目標(biāo)生物或?qū)FP基因克隆到病毒、細(xì)菌或質(zhì)粒上，通過它們的介導(dǎo)而間接標(biāo)記目標(biāo)生物，進(jìn)行生態(tài)學(xué)規(guī)律研究。用GFP基因標(biāo)記遺傳工程微生物以監(jiān)測其在水環(huán)境中的存活和去向。朱應(yīng)等構(gòu)建了帶GFP基因的重組棉鈴蟲病毒。該病毒一次感染棉鈴蟲后不再重復(fù)感染，室內(nèi)飼養(yǎng)3代，各代均可見典型的發(fā)綠色熒光的棉鈴蟲，表明病毒可以介導(dǎo)GFP標(biāo)記其宿主，預(yù)計(jì)將為研究棉鈴蟲的遷飛和暴發(fā)規(guī)律提供強(qiáng)有力的手段。跟蹤觀察微生物。傳統(tǒng)方法中，一般用熒光染料標(biāo)記微生物，由于微生物的分裂，燃料被稀釋，因此長期以來未能觀察到微生物侵入活細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)過程。GFP基因能克服上述的缺點(diǎn)，且在活細(xì)胞中能直接觀察到無需破壞原有細(xì)胞而阻止感染的繼續(xù)進(jìn)行。2.2在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用GFP在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用將GFP基因722.3在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用在組織工程的種子細(xì)胞研究中，有學(xué)者利用GFP示蹤證實(shí)了脂肪來源的干細(xì)胞的分化方向和分化能力；利用增強(qiáng)型GFP篩選合適的生物材料，如發(fā)現(xiàn)最合適的構(gòu)建氣管軟骨的細(xì)胞來源是肋軟骨細(xì)胞。GFP還用于細(xì)胞因子作用的研究，如發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子的持續(xù)表達(dá)可以延緩成牙骨質(zhì)細(xì)胞的鈣化過程；以及活體動(dòng)態(tài)觀察的研究，為脊柱和椎間盤等部位的細(xì)胞治療或基因治療后的隨訪建立了新研究方法。在藥學(xué)研究中，用GFP對目的物進(jìn)行標(biāo)記，分析目的物在細(xì)胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而從眾多的化合物中篩選出與體內(nèi)信號分子功能相似“潛力”化合物，這樣的方法簡便易行。因此，GFP成為了藥物篩選及藥物作用機(jī)制研究中的有力工具。2.3在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用在組織工程的種子細(xì)胞研究中，有學(xué)73在眼科中，許多視網(wǎng)膜疾病如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變等由于遺傳缺陷或基因表達(dá)異常等導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常、代謝紊亂或促進(jìn)與抑制新生血管形成因子表達(dá)，從而嚴(yán)重危害視力。GFP也廣泛應(yīng)用于視網(wǎng)膜的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、目的基因的調(diào)控及感光細(xì)胞凋亡保護(hù)的研究。在免疫學(xué)治療方面，應(yīng)用GFP作為表皮生長因子受體研究的工具，并對第二信使蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，這不僅可以揭示其在活細(xì)胞內(nèi)作用，還可以觀察一些抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑等信號傳導(dǎo)抑制藥物的作用效應(yīng)。在眼科中，許多視網(wǎng)膜疾病如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性74紅色熒光蛋白RFP紅色熒光蛋白RFP75紅色熒光蛋白的來源

1999年,Matz等從印度洋2太平洋地區(qū)的珊瑚蟲中分離出6種與綠色熒光蛋白(greenfluorescentproteins,GFP)同源的熒光蛋白,并鑒定了它們的光譜性質(zhì)。其中來源于Discosomasp.紅色熒光蛋白(drFP583)在紫外線的照射下可發(fā)射紅色熒光,其最大吸收波長為558nm,最大發(fā)射波長為583nm。其發(fā)射波長較長,靈敏度與信噪比均比GFP高,為基于GFP的體內(nèi)研究提供了一個(gè)很好的互補(bǔ)工具。紅色熒光蛋白的來源1999年,Matz76紅色熒光蛋白的演變drFP583具有自身的缺點(diǎn),如寡聚化、成熟過程緩慢和對細(xì)胞有毒性等限制了它的應(yīng)用。因此,人們對其進(jìn)行各種修飾和改進(jìn),以得到不同發(fā)光特性、不同聚集狀態(tài)及適于不同細(xì)胞的突變體。最先進(jìn)行突變實(shí)驗(yàn)的是drFP583,而Clontech公司已將它的一個(gè)低毒、低寡聚化及成熟快的突變體E572NA商業(yè)化,商品名為DsRed。第二代DsRed，即大家所熟知的DsRed2，它的多肽氨基末端已經(jīng)進(jìn)行了一些突變改造，這樣就可以使組織蛋白凝

集和降低毒性。

在第三代DsRed的突變體中，成熟時(shí)間

更短，熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)。紅色熒光蛋白的演變drFP583具有自77熒光蛋白表達(dá)課件78紅色熒光蛋白序列紅色熒光蛋白序列79紅色熒光蛋白的應(yīng)用

紅色熒光蛋白極大的豐富了細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)光學(xué)成像的熒光探針，使其能夠與生物體內(nèi)多種物質(zhì)聯(lián)合，實(shí)現(xiàn)對生物體內(nèi)生命物質(zhì)活動(dòng)的監(jiān)視，紅色熒光蛋白在繼綠色熒光蛋白后，在某種定義下可以說是革新了生物學(xué)研究——運(yùn)用紅色熒光蛋白可以檢測到細(xì)胞的活動(dòng)，可以標(biāo)記表達(dá)蛋白，可以進(jìn)行深入的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)等。特別是在癌癥的研究過程中，由于紅色熒光蛋白的出現(xiàn)使得科學(xué)家們能夠觀測到腫瘤細(xì)胞的具體活動(dòng)，比如腫瘤細(xì)胞的成長、入侵、轉(zhuǎn)移和新生等，應(yīng)用前景廣泛。紅色熒光蛋白的應(yīng)用紅色熒光蛋白極大的豐富80紅色熒光蛋白的應(yīng)用

在活細(xì)胞及動(dòng)物全身成像中需要表現(xiàn)較好的紅色熒光蛋白，主要是由于在多種顏色成像實(shí)驗(yàn)中需要紅色探針，另外基于較長的激發(fā)波長產(chǎn)生的光毒性較小，可以用來探測較深的生物組織。紅色熒光蛋白的應(yīng)用在活細(xì)胞及動(dòng)物全身成81黃色熒光蛋白YFP黃色熒光蛋白YFP82

黃色熒光蛋白（YellowFluorescentProtein，YFP）可以看做GFP一種突變體，最初來源于維多利亞多管水母（Aequoreavictoria）。相對于綠色熒光蛋白，其熒光向紅色光譜偏移，而這主要是由于蛋白203位蘇氨酸變?yōu)槔野彼?。其最大激發(fā)波長為514nm，最大發(fā)射波長為527nm。黃色熒光蛋白（YellowFluorescentPr83熒光蛋白表達(dá)課件84YFP序列1atgaagttcgttgtacgggccctgaccgcgaccgccgtggcggcggcggtcgccgccctc61gccggatgctcggcgacctcgccggcccccggctccgccgagggctcctcagcggggacg121aagctcgtcgtctacacgccgcagggcgaccccgtgcgcgggggctacatcaccaagcac181gccaaatcggacctcggcctggacgtaaagctggtcaacggggcgggcggagatctcgcc241acccgcctcatcgccgagaagaacaacccgcaggcggacgtcgtcgtcgtcctcggggca301ccgcagctcaaccggatcgaccaggcgggtgtgctccagcctttcgctccagactgggcc361ggcaagatcccgtccgccttcgcgtccggaagcaaggacttcacactgctgacgcagacc421ccgatcgcgatcgcctacaacgcgtccacgatgacggcggcccaggcgccgagcagttgg481acggacctggccaagccggagtacaaggacaagttcgccttcccggccctcaccagccag541acgggccaggcggcagccgtgggaatcctgtggcgctacgccgatcacacgaccggcacg601gtgtcgcagaaaggctgggacacgctcgccgcgatcctccacaacgccaagcagaccgcc661gccggcgcgccgttcgactgggcacaggtgaggtccggcgttcagccgatcgtggtgagc721tggctgggcggcattcaaaccggcacctccgacaacaccatcgacctcaggatcgtcgac781gccgtcggcgggagcccgttcgtcaacggcggcgtcggcatggtcaaggacacgaagaac841gcagccgcggcccgcaagttcatcgactggttcggctccgacagcttccaggtcgggttc901gtcaccgcgacgaagaacgatacccccctcaacccggatgcggtcaagcggctccccggg961gccgagcagggactgcgccaggtcaccccgcagaagatcgactggggcgtggtgtcccag1021cgcctctcggactggttgcagaagatccagctcgatgtgcagggctgaYFP序列1atgaagttcgttgta85

像綠色熒光蛋白一樣，YFP是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中一種非常常用的報(bào)告基因。目前，有三種改良的黃色熒光蛋白：Citrine,Venus,andYpet。這三種改良的蛋白熒光更亮，更穩(wěn)定，而且成熟更快，因此應(yīng)用廣泛。黃色熒光蛋白最常用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，作為熒光能量的接受體（acceptor）。像綠色熒光蛋白一樣，YFP是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中一種862.所用質(zhì)粒介紹PUC19質(zhì)粒

大腸桿菌克隆用質(zhì)粒pUC19,簡稱pUC19，是質(zhì)粒載體的一種。在由限制性核酸內(nèi)切酶修飾過的質(zhì)粒DNA序列中插入外源的目的基因，以質(zhì)粒為載體，將目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法導(dǎo)進(jìn)宿主細(xì)胞，pUC19常用于DNA片段克隆、DNA測序、外源基因表達(dá)等。

pUC19大小只有2686bp，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的DNA片段，GenBank注冊號為L08752(pUC18)和X02514(pUC19)。由pBR322改造而來，其中l(wèi)acZ(MSC)來自M13mp18/19圖3-4是其質(zhì)粒圖譜。pUC系列載體含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細(xì)胞中可表現(xiàn)α-互補(bǔ)作用。因此在多克隆位點(diǎn)中插入了外源片段后，可通過α-互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。

2.所用質(zhì)粒介紹PUC19質(zhì)粒大腸桿菌克隆用質(zhì)粒pUC187熒光蛋白表達(dá)課件88pET-28a載體

pET-28a-c(+)載體帶有一個(gè)N端的His/Thrombin/T7蛋白標(biāo)簽，同時(shí)含有一個(gè)可以選擇的C端His標(biāo)簽。pET28a載體的單一的多克隆位點(diǎn)見上面的環(huán)狀質(zhì)粒圖譜。注意：載體序列是以pBR322質(zhì)粒的編碼規(guī)矩進(jìn)行編碼的，所以T7蛋白表達(dá)區(qū)在質(zhì)粒圖譜上面是反向的。

T7RNA聚合酶啟動(dòng)的克隆和表達(dá)區(qū)域在質(zhì)粒圖譜中也被標(biāo)注了出來。質(zhì)粒的F1復(fù)制子是被定向的，所以在T7噬菌體聚合酶的作用下，包含有蛋白編碼序列的病毒粒子能夠產(chǎn)生，并啟動(dòng)蛋白表達(dá)，同時(shí)蛋白表達(dá)將被T7終止子序列(Cat.No.69337-3)的作用下終止蛋白翻譯。pET-28a載體

pET-28a-c(+)載體帶有一個(gè)89熒光蛋白表達(dá)課件90兩種菌株差異

克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因表達(dá)相關(guān)的酶，

不能夠表達(dá)出目的基因，轉(zhuǎn)入的載體在其中大量復(fù)制；表達(dá)宿主：E.coliBL21（DE3）則可以表達(dá)出目的基因，即得到綠色、黃色、紅色的熒光蛋白。兩種菌株差異克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因91兩種載體差異克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細(xì)菌，將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接，再導(dǎo)入原核細(xì)菌內(nèi)，質(zhì)粒會(huì)在原核細(xì)菌內(nèi)大量復(fù)制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定會(huì)表達(dá)，但一定被大量復(fù)制。表達(dá)載體：就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動(dòng)子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達(dá)的載體?？寺≥d體目的在于復(fù)制足夠多的目標(biāo)質(zhì)粒，所以常帶有較強(qiáng)的自我復(fù)制元件，如復(fù)制起始位點(diǎn)等，往往在菌體內(nèi)存在多拷貝，所以抽質(zhì)粒會(huì)抽出一大堆，但不具備表達(dá)元件。而表達(dá)質(zhì)粒有復(fù)雜的構(gòu)成，為的是控制目標(biāo)蛋白的表達(dá)，如各種啟動(dòng)子（T7），調(diào)節(jié)子（LacZ）等，而且以pET為代表的表達(dá)載體在菌體內(nèi)都是低拷貝的，防止?jié)B漏表達(dá)。

是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子--核糖體結(jié)合位點(diǎn)--克隆位點(diǎn)--轉(zhuǎn)錄終止信號，這是用來區(qū)別克隆載體和表達(dá)載體的標(biāo)志。兩種載體差異克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細(xì)菌，將923.大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因工程中常用的工具。雖然它不能像真核系統(tǒng)一樣進(jìn)行翻譯后加工，但由于其遺傳背景相對比較清楚，使用安全、操作簡便、周期短、經(jīng)濟(jì)，因此仍然是使用最廣泛的、也是不可被替代的系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)的核心是表達(dá)載體。用來在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的載體有很多種。構(gòu)建有效的表達(dá)載體是表達(dá)目的基因的基本要求，同時(shí)也是影響基因表達(dá)水平以及蛋白活性的總要因素。標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌表達(dá)載體的主要組成包括：啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始區(qū)、多克隆位點(diǎn)、終止子、復(fù)制起點(diǎn)以及抗性篩選因子等。3.大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因工933.大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)一般來說,這些載體應(yīng)滿足以下要求:重組質(zhì)?？截悢?shù)高，表達(dá)量高適用范圍廣表達(dá)產(chǎn)物容易純化在菌體內(nèi)穩(wěn)定性好目前已知的應(yīng)用較廣的大腸桿菌表達(dá)載體有非融合表達(dá)載體、融合表達(dá)載體、分泌型表達(dá)載體和表面呈現(xiàn)表達(dá)載體等。3.大腸桿菌表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)一般來說,這些載體應(yīng)滿足94

pET表達(dá)系統(tǒng)簡介pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng),它是最初由Studier等利用與啟動(dòng)子配套能高效轉(zhuǎn)錄特定基因的外源RNA聚合酶構(gòu)建的T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng),可以從各種基因(包括原核、真核細(xì)胞)生產(chǎn)大量的目的蛋白,pET表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:

※優(yōu)化靶蛋白表達(dá):pET系統(tǒng)以其獨(dú)特的優(yōu)勢和載體、宿主之間重組的“協(xié)調(diào)”而優(yōu)化特異靶蛋白表達(dá)。

※嚴(yán)格控制基礎(chǔ)表達(dá)水平:

pET表達(dá)系統(tǒng)能嚴(yán)格控制誘導(dǎo)劑缺失時(shí)的基礎(chǔ)表達(dá)水平,許多難用其他E1coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的基因可在pET系統(tǒng)中高效穩(wěn)定地克隆和表達(dá)。

※宿主菌的最佳背景:pET系統(tǒng)有11種不同DE3溶原化宿主菌,其中使用最廣泛的為BL21及其衍生菌株,它的優(yōu)點(diǎn)在于缺失lon和ompT蛋白酶。

pET表達(dá)系統(tǒng)簡介954.SDS原理及蛋白分離與檢測

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS，polyacrylamidegelelectrophoresis）方法可對蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離，并可精確測得蛋白質(zhì)的分子量。常用的方法為SDS不連續(xù)系統(tǒng)。4.SDS原理及蛋白分離與檢測96

SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。熒光蛋白表達(dá)課件97

SDS首次由Shapiro等提出后,已成為廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離的一種方法。由于SDS是一種陰離子去污劑,在還原劑(β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇,DTT)存在下,能破壞蛋白質(zhì)亞基之間的非共價(jià)鍵,使其解離成單個(gè)的亞基,能按照一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物,其負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷,也就消除或降低不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別,這樣就使電泳遷移率只取決于相對分子量大小這一因素。由于SDS儀器簡單、操作方便、重復(fù)性好、可靠性強(qiáng),除了測定蛋白質(zhì)分子量外,還可以作為一種分離、純化的工具,此方法對于其他方法難溶的復(fù)合酶、病毒、及膜蛋白都可通過其解離作用而進(jìn)行分析,而且對于某些變性蛋白質(zhì)也能很方便直觀的分離出來。SDS首次由S98實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)996.重組蛋白的SDS檢測1.獲得目的基因5.EGFP基因的原核表達(dá)及檢測3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coliDH5α2.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliBL216.重組蛋白的SDS檢測1.獲得目的基因5.100詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程101一、實(shí)驗(yàn)試劑上、下游引物,ddH2O,10XBuffer,dNTP,質(zhì)粒pEGFP-N3&pET-28a(+),TaqDNA聚合酶,限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ&EcoRⅠ,T4DNA連接酶,CaCl2溶液,膠回收試劑盒(BindingBuffer,洗脫緩沖液,SPWWashbuffer),質(zhì)粒小提試劑盒(含有RnaseA的溶液I,溶液II,溶液III,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer),LB培養(yǎng)基(LP0042TRYRTONE1%,LP0021YEASTEXTRACT0.5%,NaCl1%),麥康凱培養(yǎng)基(蛋白胨17g,脙胨3g,豬膽鹽5g,NaCl5g,瓊脂17g,ddH2O1000mL,乳糖10g,0.01%結(jié)晶