熒光蛋白表達課件

熒光蛋白表達課件熒光蛋白表達課件1背景介紹背景介紹2綠色熒光蛋白GFP綠色熒光蛋白GFP3熒光蛋白表達課件4增強型GFP（EGFP）

野生型GFP折疊易受溫度影響，發(fā)光較弱，并且在某些細胞中不表達，因此人們運用定點突變等技術對野生型GFP進行了改造。目前應用較為廣泛的是增強型GFP（EGFP），它是將Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使GFP的熒光強度提高了35倍，而且激發(fā)后16~24h后仍可穩(wěn)定地檢測到熒光。增強型GFP（EGFP）野生型GFP折疊易受溫度影響，5GFP的熒光性質及應用優(yōu)點(1)易于檢測，靈敏度高。(2)熒光性質穩(wěn)定。(3)對細胞無毒害。(4)構建載體方便。(5)可直接用于活細胞測定。(6)不受假陽性干擾。(7)廣譜性。(8)易于得到突變體。GFP的熒光性質及應用優(yōu)點(1)易于檢測，靈敏度高。6熒光蛋白表達課件7EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結構。氨基酸序列：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的8綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代生物學的發(fā)展，應用前景廣闊。GFP及其突變體已被廣泛應用于基因表達調控、蛋白質空間定位、生物分子之間相互作用、轉基因動物等方面。基于新型功能熒光蛋白(如光激活熒光蛋白和光轉換熒光蛋白和氧化還原敏感的GFP等)的光學分子成像技術的發(fā)展，為在活細胞乃至活體動物內研究基因表達和蛋白質功能提供了更多的選擇空間。綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代生物學的發(fā)展，應9GFP用途1、作為轉基因植物和動物的篩選標記2、GFP在分子生物學研究中的應用2.1在生物學研究中的應用2.2在生態(tài)學上的應用2.3在醫(yī)學研究中的應用GFP用途1、作為轉基因植物和動物的篩選標記101、作為轉基因植物和動物的篩選標記

分子標記：作為一種新型的報告基因，GFP已在生物學的許多研究領域得到應用。利用綠色熒光蛋白獨特的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白質標簽(proteintagging)，即利用DNA重組術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察。1、作為轉基因植物和動物的篩選標記分子標記：作為一11GFP的相對分子質量小，能與多種不同的蛋白質N端或C端融合而保持其天然蛋白質的特性，可特異地進行蛋白質及細胞器的地位研究。大量實驗表明，GFP可定位到細胞核、細胞骨架、葉綠體、線粒體等細胞器中。另外、將GFP作為活細胞內蛋白質的標記分子，利用熒光共振能量轉移顯微技術可以研究細胞內的蛋白質之間的相互作用。GFP的相對分子質量小，能與多種不同的蛋白質N端或C端融合而122.1在生物學研究中的應用GFP可以作為標記分子，目前已被廣泛應用于基因標記、蛋白質標記、環(huán)境微生物研究、寄生蟲學研究以及發(fā)育生物學研究中基因表達模式的探索等方面，成為活細胞分子水平研究的工具。目前生物農藥的殺蟲效果往往得不到準確評估，而利用GFP標記，通過熒光觀察可以避免評估殺蟲劑殺蟲效果時僅僅記錄有典型感染癥狀的害蟲個體，而忽視無明顯感染癥狀但確實已經感染或正在感染的害蟲個體，同時無需進行分子生物學鑒定即可方便地區(qū)分殺蟲劑致死和天然病原致死，從而客觀準確地評價殺蟲劑的毒力。2.1在生物學研究中的應用GFP可以作為標記分子，目前132.2在生態(tài)學上的應用GFP在生態(tài)學中的應用將GFP基因直接導入目標生物或將GFP基因克隆到病毒、細菌或質粒上，通過它們的介導而間接標記目標生物，進行生態(tài)學規(guī)律研究。用GFP基因標記遺傳工程微生物以監(jiān)測其在水環(huán)境中的存活和去向。朱應等構建了帶GFP基因的重組棉鈴蟲病毒。該病毒一次感染棉鈴蟲后不再重復感染，室內飼養(yǎng)3代，各代均可見典型的發(fā)綠色熒光的棉鈴蟲，表明病毒可以介導GFP標記其宿主，預計將為研究棉鈴蟲的遷飛和暴發(fā)規(guī)律提供強有力的手段。跟蹤觀察微生物。傳統(tǒng)方法中，一般用熒光染料標記微生物，由于微生物的分裂，燃料被稀釋，因此長期以來未能觀察到微生物侵入活細胞的實時動態(tài)過程。GFP基因能克服上述的缺點，且在活細胞中能直接觀察到無需破壞原有細胞而阻止感染的繼續(xù)進行。2.2在生態(tài)學上的應用GFP在生態(tài)學中的應用將GFP基因142.3在醫(yī)學研究中的應用在組織工程的種子細胞研究中，有學者利用GFP示蹤證實了脂肪來源的干細胞的分化方向和分化能力；利用增強型GFP篩選合適的生物材料，如發(fā)現(xiàn)最合適的構建氣管軟骨的細胞來源是肋軟骨細胞。GFP還用于細胞因子作用的研究，如發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子的持續(xù)表達可以延緩成牙骨質細胞的鈣化過程；以及活體動態(tài)觀察的研究，為脊柱和椎間盤等部位的細胞治療或基因治療后的隨訪建立了新研究方法。在藥學研究中，用GFP對目的物進行標記，分析目的物在細胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而從眾多的化合物中篩選出與體內信號分子功能相似“潛力”化合物，這樣的方法簡便易行。因此，GFP成為了藥物篩選及藥物作用機制研究中的有力工具。2.3在醫(yī)學研究中的應用在組織工程的種子細胞研究中，有學15在眼科中，許多視網膜疾病如視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性、增生性玻璃體視網膜病變、糖尿病視網膜病變等由于遺傳缺陷或基因表達異常等導致視網膜神經細胞某些蛋白質結構異常、代謝紊亂或促進與抑制新生血管形成因子表達，從而嚴重危害視力。GFP也廣泛應用于視網膜的基因轉移系統(tǒng)、目的基因的調控及感光細胞凋亡保護的研究。在免疫學治療方面，應用GFP作為表皮生長因子受體研究的工具，并對第二信使蛋白進行亞細胞定位，這不僅可以揭示其在活細胞內作用，還可以觀察一些抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑等信號傳導抑制藥物的作用效應。在眼科中，許多視網膜疾病如視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性16紅色熒光蛋白RFP紅色熒光蛋白RFP17紅色熒光蛋白的來源

1999年,Matz等從印度洋2太平洋地區(qū)的珊瑚蟲中分離出6種與綠色熒光蛋白(greenfluorescentproteins,GFP)同源的熒光蛋白,并鑒定了它們的光譜性質。其中來源于Discosomasp.紅色熒光蛋白(drFP583)在紫外線的照射下可發(fā)射紅色熒光,其最大吸收波長為558nm,最大發(fā)射波長為583nm。其發(fā)射波長較長,靈敏度與信噪比均比GFP高,為基于GFP的體內研究提供了一個很好的互補工具。紅色熒光蛋白的來源1999年,Matz18紅色熒光蛋白的演變drFP583具有自身的缺點,如寡聚化、成熟過程緩慢和對細胞有毒性等限制了它的應用。因此,人們對其進行各種修飾和改進,以得到不同發(fā)光特性、不同聚集狀態(tài)及適于不同細胞的突變體。最先進行突變實驗的是drFP583,而Clontech公司已將它的一個低毒、低寡聚化及成熟快的突變體E572NA商業(yè)化,商品名為DsRed。第二代DsRed，即大家所熟知的DsRed2，它的多肽氨基末端已經進行了一些突變改造，這樣就可以使組織蛋白凝

集和降低毒性。

在第三代DsRed的突變體中，成熟時間

更短，熒光強度也增強。紅色熒光蛋白的演變drFP583具有自19熒光蛋白表達課件20紅色熒光蛋白序列紅色熒光蛋白序列21紅色熒光蛋白的應用

紅色熒光蛋白極大的豐富了細胞內或體內光學成像的熒光探針，使其能夠與生物體內多種物質聯(lián)合，實現(xiàn)對生物體內生命物質活動的監(jiān)視，紅色熒光蛋白在繼綠色熒光蛋白后，在某種定義下可以說是革新了生物學研究——運用紅色熒光蛋白可以檢測到細胞的活動，可以標記表達蛋白，可以進行深入的蛋白質組學實驗等。特別是在癌癥的研究過程中，由于紅色熒光蛋白的出現(xiàn)使得科學家們能夠觀測到腫瘤細胞的具體活動，比如腫瘤細胞的成長、入侵、轉移和新生等，應用前景廣泛。紅色熒光蛋白的應用紅色熒光蛋白極大的豐富22紅色熒光蛋白的應用

在活細胞及動物全身成像中需要表現(xiàn)較好的紅色熒光蛋白，主要是由于在多種顏色成像實驗中需要紅色探針，另外基于較長的激發(fā)波長產生的光毒性較小，可以用來探測較深的生物組織。紅色熒光蛋白的應用在活細胞及動物全身成23黃色熒光蛋白YFP黃色熒光蛋白YFP24

黃色熒光蛋白（YellowFluorescentProtein，YFP）可以看做GFP一種突變體，最初來源于維多利亞多管水母（Aequoreavictoria）。相對于綠色熒光蛋白，其熒光向紅色光譜偏移，而這主要是由于蛋白203位蘇氨酸變?yōu)槔野彼帷Ｆ渥畲蠹ぐl(fā)波長為514nm，最大發(fā)射波長為527nm。黃色熒光蛋白（YellowFluorescentPr25熒光蛋白表達課件26YFP序列1atgaagttcgttgtacgggccctgaccgcgaccgccgtggcggcggcggtcgccgccctc61gccggatgctcggcgacctcgccggcccccggctccgccgagggctcctcagcggggacg121aagctcgtcgtctacacgccgcagggcgaccccgtgcgcgggggctacatcaccaagcac181gccaaatcggacctcggcctggacgtaaagctggtcaacggggcgggcggagatctcgcc241acccgcctcatcgccgagaagaacaacccgcaggcggacgtcgtcgtcgtcctcggggca301ccgcagctcaaccggatcgaccaggcgggtgtgctccagcctttcgctccagactgggcc361ggcaagatcccgtccgccttcgcgtccggaagcaaggacttcacactgctgacgcagacc421ccgatcgcgatcgcctacaacgcgtccacgatgacggcggcccaggcgccgagcagttgg481acggacctggccaagccggagtacaaggacaagttcgccttcccggccctcaccagccag541acgggccaggcggcagccgtgggaatcctgtggcgctacgccgatcacacgaccggcacg601gtgtcgcagaaaggctgggacacgctcgccgcgatcctccacaacgccaagcagaccgcc661gccggcgcgccgttcgactgggcacaggtgaggtccggcgttcagccgatcgtggtgagc721tggctgggcggcattcaaaccggcacctccgacaacaccatcgacctcaggatcgtcgac781gccgtcggcgggagcccgttcgtcaacggcggcgtcggcatggtcaaggacacgaagaac841gcagccgcggcccgcaagttcatcgactggttcggctccgacagcttccaggtcgggttc901gtcaccgcgacgaagaacgatacccccctcaacccggatgcggtcaagcggctccccggg961gccgagcagggactgcgccaggtcaccccgcagaagatcgactggggcgtggtgtcccag1021cgcctctcggactggttgcagaagatccagctcgatgtgcagggctgaYFP序列1atgaagttcgttgta27

像綠色熒光蛋白一樣，YFP是細胞生物學和分子生物學中一種非常常用的報告基因。目前，有三種改良的黃色熒光蛋白：Citrine,Venus,andYpet。這三種改良的蛋白熒光更亮，更穩(wěn)定，而且成熟更快，因此應用廣泛。黃色熒光蛋白最常用于熒光共振能量轉移，作為熒光能量的接受體（acceptor）。像綠色熒光蛋白一樣，YFP是細胞生物學和分子生物學中一種282.所用質粒介紹PUC19質粒

大腸桿菌克隆用質粒pUC19,簡稱pUC19，是質粒載體的一種。在由限制性核酸內切酶修飾過的質粒DNA序列中插入外源的目的基因，以質粒為載體，將目的基因通過轉化或轉導的方法導進宿主細胞，pUC19常用于DNA片段克隆、DNA測序、外源基因表達等。

pUC19大小只有2686bp，是最常用的質粒載體，其結構組成緊湊，幾乎不含多余的DNA片段，GenBank注冊號為L08752(pUC18)和X02514(pUC19)。由pBR322改造而來，其中l(wèi)acZ(MSC)來自M13mp18/19圖3-4是其質粒圖譜。pUC系列載體含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細胞中可表現(xiàn)α-互補作用。因此在多克隆位點中插入了外源片段后，可通過α-互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質粒。

2.所用質粒介紹PUC19質粒大腸桿菌克隆用質粒pUC129熒光蛋白表達課件30pET-28a載體

pET-28a-c(+)載體帶有一個N端的His/Thrombin/T7蛋白標簽，同時含有一個可以選擇的C端His標簽。pET28a載體的單一的多克隆位點見上面的環(huán)狀質粒圖譜。注意：載體序列是以pBR322質粒的編碼規(guī)矩進行編碼的，所以T7蛋白表達區(qū)在質粒圖譜上面是反向的。

T7RNA聚合酶啟動的克隆和表達區(qū)域在質粒圖譜中也被標注了出來。質粒的F1復制子是被定向的，所以在T7噬菌體聚合酶的作用下，包含有蛋白編碼序列的病毒粒子能夠產生，并啟動蛋白表達，同時蛋白表達將被T7終止子序列(Cat.No.69337-3)的作用下終止蛋白翻譯。pET-28a載體

pET-28a-c(+)載體帶有一個31熒光蛋白表達課件32兩種菌株差異

克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因表達相關的酶，

不能夠表達出目的基因，轉入的載體在其中大量復制；表達宿主：E.coliBL21（DE3）則可以表達出目的基因，即得到綠色、黃色、紅色的熒光蛋白。兩種菌株差異克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因33兩種載體差異克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細菌，將需要克隆的基因與克隆載體的質粒相連接，再導入原核細菌內，質粒會在原核細菌內大量復制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定會表達，但一定被大量復制。表達載體：就是在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件（如啟動子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達的載體?？寺≥d體目的在于復制足夠多的目標質粒，所以常帶有較強的自我復制元件，如復制起始位點等，往往在菌體內存在多拷貝，所以抽質粒會抽出一大堆，但不具備表達元件。而表達質粒有復雜的構成，為的是控制目標蛋白的表達，如各種啟動子（T7），調節(jié)子（LacZ）等，而且以pET為代表的表達載體在菌體內都是低拷貝的，防止?jié)B漏表達。

是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子--核糖體結合位點--克隆位點--轉錄終止信號，這是用來區(qū)別克隆載體和表達載體的標志。兩種載體差異克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細菌，將343.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因工程中常用的工具。雖然它不能像真核系統(tǒng)一樣進行翻譯后加工，但由于其遺傳背景相對比較清楚，使用安全、操作簡便、周期短、經濟，因此仍然是使用最廣泛的、也是不可被替代的系統(tǒng)。表達系統(tǒng)的核心是表達載體。用來在大腸桿菌中表達外源基因的載體有很多種。構建有效的表達載體是表達目的基因的基本要求，同時也是影響基因表達水平以及蛋白活性的總要因素。標準的大腸桿菌表達載體的主要組成包括：啟動子、操縱子、核糖體結合位點、翻譯起始區(qū)、多克隆位點、終止子、復制起點以及抗性篩選因子等。3.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因工353.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)一般來說,這些載體應滿足以下要求:重組質?？截悢?shù)高，表達量高適用范圍廣表達產物容易純化在菌體內穩(wěn)定性好目前已知的應用較廣的大腸桿菌表達載體有非融合表達載體、融合表達載體、分泌型表達載體和表面呈現(xiàn)表達載體等。3.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)一般來說,這些載體應滿足36

pET表達系統(tǒng)簡介pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強大系統(tǒng),它是最初由Studier等利用與啟動子配套能高效轉錄特定基因的外源RNA聚合酶構建的T7RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng),可以從各種基因(包括原核、真核細胞)生產大量的目的蛋白,pET表達系統(tǒng)的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在以下幾個方面:

※優(yōu)化靶蛋白表達:pET系統(tǒng)以其獨特的優(yōu)勢和載體、宿主之間重組的“協(xié)調”而優(yōu)化特異靶蛋白表達。

※嚴格控制基礎表達水平:

pET表達系統(tǒng)能嚴格控制誘導劑缺失時的基礎表達水平,許多難用其他E1coli表達系統(tǒng)表達的基因可在pET系統(tǒng)中高效穩(wěn)定地克隆和表達。

※宿主菌的最佳背景:pET系統(tǒng)有11種不同DE3溶原化宿主菌,其中使用最廣泛的為BL21及其衍生菌株,它的優(yōu)點在于缺失lon和ompT蛋白酶。

pET表達系統(tǒng)簡介374.SDS原理及蛋白分離與檢測

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS，polyacrylamidegelelectrophoresis）方法可對蛋白質的組分進行分離，并可精確測得蛋白質的分子量。常用的方法為SDS不連續(xù)系統(tǒng)。4.SDS原理及蛋白分離與檢測38

SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。熒光蛋白表達課件39

SDS首次由Shapiro等提出后,已成為廣泛應用于蛋白質分離的一種方法。由于SDS是一種陰離子去污劑,在還原劑(β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇,DTT)存在下,能破壞蛋白質亞基之間的非共價鍵,使其解離成單個的亞基,能按照一定比例與蛋白質分子結合成帶負電荷的復合物,其負電荷遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷,也就消除或降低不同蛋白質之間原有的電荷差別,這樣就使電泳遷移率只取決于相對分子量大小這一因素。由于SDS儀器簡單、操作方便、重復性好、可靠性強,除了測定蛋白質分子量外,還可以作為一種分離、純化的工具,此方法對于其他方法難溶的復合酶、病毒、及膜蛋白都可通過其解離作用而進行分析,而且對于某些變性蛋白質也能很方便直觀的分離出來。SDS首次由S40實驗設計實驗設計416.重組蛋白的SDS檢測1.獲得目的基因5.EGFP基因的原核表達及檢測3.質粒轉化克隆宿主E.coliDH5α2.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上4.質粒轉化表達宿主E.coliBL216.重組蛋白的SDS檢測1.獲得目的基因5.42詳細實驗流程詳細實驗流程43一、實驗試劑上、下游引物,ddH2O,10XBuffer,dNTP,質粒pEGFP-N3&pET-28a(+),TaqDNA聚合酶,限制性核酸內切酶HindⅢ&EcoRⅠ,T4DNA連接酶,CaCl2溶液,膠回收試劑盒(BindingBuffer,洗脫緩沖液,SPWWashbuffer),質粒小提試劑盒(含有RnaseA的溶液I,溶液II,溶液III,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer),LB培養(yǎng)基(LP0042TRYRTONE1%,LP0021YEASTEXTRACT0.5%,NaCl1%),麥康凱培養(yǎng)基(蛋白胨17g,脙胨3g,豬膽鹽5g,NaCl5g,瓊脂17g,ddH2O1000mL,乳糖10g,0.01%結晶紫水溶液10mL,0.5%中性紅水溶液5mL),卡那霉素,TAE,EB溶液;30%丙烯酰胺(Acr);10%SDS;1.5mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.9);1.0mol/LTris-HCl緩沖液(pH6.8);0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0);TEMED;樣品溶解液;固定液;染色液;脫色液。一、實驗試劑44二、實驗儀器PCR儀、1.5ml離心管、PCR管、移液槍、酒精燈、槍尖、Ep管、培養(yǎng)皿、牙簽、試管、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、離心機、旋渦振蕩器、微波爐、電泳儀、制膠槽、電泳槽、梳子、錐形瓶、電子天平、手套、接種環(huán)、玻璃板、制膠板、模具、電吹風、SDS電泳儀二、實驗儀器451.獲得目的基因1.獲得目的基因46熒光蛋白表達課件472.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上2.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上483.質粒轉化克隆宿主E.coliDH5α3.質粒轉化克隆宿主E.coliDH5α494.質粒轉化表達宿主E.coliBL214.質粒轉化表達宿主E.coliBL21505.EGFP基因的原核表達及檢測5.EGFP基因的原核表達及檢測516.重組蛋白的SDS檢測6.重組蛋白的SDS檢測52預期實驗結果預期實驗結果53pET-28a：5369bp左右EGFP：6.1kb左右ERFP：6kb左右EYFP：6.5kb1.目的基因和pET-28a質粒雙酶切電泳結果：pET-28a：5369bp左右1.目的基因和pET-28a54SDS：樣品在26KD存在條帶，對照1和對照2沒有；自然光下菌落呈綠色可說明pET28a-EGFP能夠在原核系統(tǒng)中得到高效表達,并且表達效果較好。2.熒光蛋白誘導表達與檢測：SDS：樣品在26KD存在條帶，對照1和對照2沒有55參考文獻參考文獻56[1]ShimomuraO,JohnsonFH,SaigaY.Extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea[J].J.Cell.Comp.Physiol.,1962,59(3):223239.[2]吳沛橋,巴曉革,胡海,等.綠色熒光蛋白GFP的研究進展及應用[J].生物醫(yī)學工程研究,2009,28(1):8386.[3]馬金石.綠色熒光蛋白[J].化學通報,2009,72(3):243250.[4]代文杰,呂曉穎,周保國,等.人源化綠色熒光蛋白基因真核表達載體的構建與表達檢測[J].肝膽胰外科雜志,2002,14(4):213214.[5]ParkKW,CheongHT,LaiL,etal.Productionofnucleartransferderivedswinethatexpresstheenhancedgreenfluorescentprotein[J].AniBiotech,2001,12(2):173181.[6]SkadsenRW,HohnTM.UseofFusariumgraminearumtransformedwithgfptofollowinfectionpatternsinbarleyandArabidopsis[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology,2004,64(1):4553.[7]張國增,王強.熒光染料在植物細胞Ca2+濃度測定中的應用[J].中國農學通報,2010,26(9):198201.[8]郝鋼躍,張維東,張月英,等.穩(wěn)定高表達增強型綠色熒光蛋白基因膀胱癌細胞株的構建[J].山東醫(yī)藥,2009,49(46):13.[9]王婧,李昌,李林溪,等.反轉錄病毒介導的穩(wěn)定表達HIV1Gag蛋白和增強型綠色熒光蛋白細胞系的建立[J].畜牧獸醫(yī)學報,2011,42(2):203209.[1]ShimomuraO,JohnsonFH,57【10】曲萍，隋延仿等.增強型綠色熒光蛋白的基因克隆、表達及蛋白純化.陜西醫(yī)學雜志,2006;35:10.【11】吳沛橋，巴曉革等.綠色熒光蛋白GFP的研究進展及應用.生物醫(yī)學工程研究，2009,28（1）：83~86.【12】戎晶晶,刁振宇,周國華.大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展.藥物生物技術,2005,12(6):416~420.【13】柴玉波，陳蘇民.大腸桿菌表達系統(tǒng)表達載體的類型及其研究進展.國外醫(yī)學分子生物學分冊1997年第19卷第4期.【14】解庭波.大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展.長江大學學報（自然科學版），2008年9月第5卷第3期.【15】高艷利，楊思文等.SDS電泳技術分析蛋白質的研究.遼寧化工，2007年7月第36卷第7期?！?0】曲萍，隋延仿等.增強型綠色熒光蛋白的基因克隆、表達及58熒光蛋白表達課件熒光蛋白表達課件59背景介紹背景介紹60綠色熒光蛋白GFP綠色熒光蛋白GFP61熒光蛋白表達課件62增強型GFP（EGFP）

野生型GFP折疊易受溫度影響，發(fā)光較弱，并且在某些細胞中不表達，因此人們運用定點突變等技術對野生型GFP進行了改造。目前應用較為廣泛的是增強型GFP（EGFP），它是將Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使GFP的熒光強度提高了35倍，而且激發(fā)后16~24h后仍可穩(wěn)定地檢測到熒光。增強型GFP（EGFP）野生型GFP折疊易受溫度影響，63GFP的熒光性質及應用優(yōu)點(1)易于檢測，靈敏度高。(2)熒光性質穩(wěn)定。(3)對細胞無毒害。(4)構建載體方便。(5)可直接用于活細胞測定。(6)不受假陽性干擾。(7)廣譜性。(8)易于得到突變體。GFP的熒光性質及應用優(yōu)點(1)易于檢測，靈敏度高。64熒光蛋白表達課件65EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結構。氨基酸序列：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的66綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代生物學的發(fā)展，應用前景廣闊。GFP及其突變體已被廣泛應用于基因表達調控、蛋白質空間定位、生物分子之間相互作用、轉基因動物等方面?；谛滦凸δ軣晒獾鞍?如光激活熒光蛋白和光轉換熒光蛋白和氧化還原敏感的GFP等)的光學分子成像技術的發(fā)展，為在活細胞乃至活體動物內研究基因表達和蛋白質功能提供了更多的選擇空間。綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代生物學的發(fā)展，應67GFP用途1、作為轉基因植物和動物的篩選標記2、GFP在分子生物學研究中的應用2.1在生物學研究中的應用2.2在生態(tài)學上的應用2.3在醫(yī)學研究中的應用GFP用途1、作為轉基因植物和動物的篩選標記681、作為轉基因植物和動物的篩選標記

分子標記：作為一種新型的報告基因，GFP已在生物學的許多研究領域得到應用。利用綠色熒光蛋白獨特的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白質標簽(proteintagging)，即利用DNA重組術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察。1、作為轉基因植物和動物的篩選標記分子標記：作為一69GFP的相對分子質量小，能與多種不同的蛋白質N端或C端融合而保持其天然蛋白質的特性，可特異地進行蛋白質及細胞器的地位研究。大量實驗表明，GFP可定位到細胞核、細胞骨架、葉綠體、線粒體等細胞器中。另外、將GFP作為活細胞內蛋白質的標記分子，利用熒光共振能量轉移顯微技術可以研究細胞內的蛋白質之間的相互作用。GFP的相對分子質量小，能與多種不同的蛋白質N端或C端融合而702.1在生物學研究中的應用GFP可以作為標記分子，目前已被廣泛應用于基因標記、蛋白質標記、環(huán)境微生物研究、寄生蟲學研究以及發(fā)育生物學研究中基因表達模式的探索等方面，成為活細胞分子水平研究的工具。目前生物農藥的殺蟲效果往往得不到準確評估，而利用GFP標記，通過熒光觀察可以避免評估殺蟲劑殺蟲效果時僅僅記錄有典型感染癥狀的害蟲個體，而忽視無明顯感染癥狀但確實已經感染或正在感染的害蟲個體，同時無需進行分子生物學鑒定即可方便地區(qū)分殺蟲劑致死和天然病原致死，從而客觀準確地評價殺蟲劑的毒力。2.1在生物學研究中的應用GFP可以作為標記分子，目前712.2在生態(tài)學上的應用GFP在生態(tài)學中的應用將GFP基因直接導入目標生物或將GFP基因克隆到病毒、細菌或質粒上，通過它們的介導而間接標記目標生物，進行生態(tài)學規(guī)律研究。用GFP基因標記遺傳工程微生物以監(jiān)測其在水環(huán)境中的存活和去向。朱應等構建了帶GFP基因的重組棉鈴蟲病毒。該病毒一次感染棉鈴蟲后不再重復感染，室內飼養(yǎng)3代，各代均可見典型的發(fā)綠色熒光的棉鈴蟲，表明病毒可以介導GFP標記其宿主，預計將為研究棉鈴蟲的遷飛和暴發(fā)規(guī)律提供強有力的手段。跟蹤觀察微生物。傳統(tǒng)方法中，一般用熒光染料標記微生物，由于微生物的分裂，燃料被稀釋，因此長期以來未能觀察到微生物侵入活細胞的實時動態(tài)過程。GFP基因能克服上述的缺點，且在活細胞中能直接觀察到無需破壞原有細胞而阻止感染的繼續(xù)進行。2.2在生態(tài)學上的應用GFP在生態(tài)學中的應用將GFP基因722.3在醫(yī)學研究中的應用在組織工程的種子細胞研究中，有學者利用GFP示蹤證實了脂肪來源的干細胞的分化方向和分化能力；利用增強型GFP篩選合適的生物材料，如發(fā)現(xiàn)最合適的構建氣管軟骨的細胞來源是肋軟骨細胞。GFP還用于細胞因子作用的研究，如發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子的持續(xù)表達可以延緩成牙骨質細胞的鈣化過程；以及活體動態(tài)觀察的研究，為脊柱和椎間盤等部位的細胞治療或基因治療后的隨訪建立了新研究方法。在藥學研究中，用GFP對目的物進行標記，分析目的物在細胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而從眾多的化合物中篩選出與體內信號分子功能相似“潛力”化合物，這樣的方法簡便易行。因此，GFP成為了藥物篩選及藥物作用機制研究中的有力工具。2.3在醫(yī)學研究中的應用在組織工程的種子細胞研究中，有學73在眼科中，許多視網膜疾病如視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性、增生性玻璃體視網膜病變、糖尿病視網膜病變等由于遺傳缺陷或基因表達異常等導致視網膜神經細胞某些蛋白質結構異常、代謝紊亂或促進與抑制新生血管形成因子表達，從而嚴重危害視力。GFP也廣泛應用于視網膜的基因轉移系統(tǒng)、目的基因的調控及感光細胞凋亡保護的研究。在免疫學治療方面，應用GFP作為表皮生長因子受體研究的工具，并對第二信使蛋白進行亞細胞定位，這不僅可以揭示其在活細胞內作用，還可以觀察一些抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑等信號傳導抑制藥物的作用效應。在眼科中，許多視網膜疾病如視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性74紅色熒光蛋白RFP紅色熒光蛋白RFP75紅色熒光蛋白的來源

1999年,Matz等從印度洋2太平洋地區(qū)的珊瑚蟲中分離出6種與綠色熒光蛋白(greenfluorescentproteins,GFP)同源的熒光蛋白,并鑒定了它們的光譜性質。其中來源于Discosomasp.紅色熒光蛋白(drFP583)在紫外線的照射下可發(fā)射紅色熒光,其最大吸收波長為558nm,最大發(fā)射波長為583nm。其發(fā)射波長較長,靈敏度與信噪比均比GFP高,為基于GFP的體內研究提供了一個很好的互補工具。紅色熒光蛋白的來源1999年,Matz76紅色熒光蛋白的演變drFP583具有自身的缺點,如寡聚化、成熟過程緩慢和對細胞有毒性等限制了它的應用。因此,人們對其進行各種修飾和改進,以得到不同發(fā)光特性、不同聚集狀態(tài)及適于不同細胞的突變體。最先進行突變實驗的是drFP583,而Clontech公司已將它的一個低毒、低寡聚化及成熟快的突變體E572NA商業(yè)化,商品名為DsRed。第二代DsRed，即大家所熟知的DsRed2，它的多肽氨基末端已經進行了一些突變改造，這樣就可以使組織蛋白凝

集和降低毒性。

在第三代DsRed的突變體中，成熟時間

更短，熒光強度也增強。紅色熒光蛋白的演變drFP583具有自77熒光蛋白表達課件78紅色熒光蛋白序列紅色熒光蛋白序列79紅色熒光蛋白的應用

紅色熒光蛋白極大的豐富了細胞內或體內光學成像的熒光探針，使其能夠與生物體內多種物質聯(lián)合，實現(xiàn)對生物體內生命物質活動的監(jiān)視，紅色熒光蛋白在繼綠色熒光蛋白后，在某種定義下可以說是革新了生物學研究——運用紅色熒光蛋白可以檢測到細胞的活動，可以標記表達蛋白，可以進行深入的蛋白質組學實驗等。特別是在癌癥的研究過程中，由于紅色熒光蛋白的出現(xiàn)使得科學家們能夠觀測到腫瘤細胞的具體活動，比如腫瘤細胞的成長、入侵、轉移和新生等，應用前景廣泛。紅色熒光蛋白的應用紅色熒光蛋白極大的豐富80紅色熒光蛋白的應用

在活細胞及動物全身成像中需要表現(xiàn)較好的紅色熒光蛋白，主要是由于在多種顏色成像實驗中需要紅色探針，另外基于較長的激發(fā)波長產生的光毒性較小，可以用來探測較深的生物組織。紅色熒光蛋白的應用在活細胞及動物全身成81黃色熒光蛋白YFP黃色熒光蛋白YFP82

黃色熒光蛋白（YellowFluorescentProtein，YFP）可以看做GFP一種突變體，最初來源于維多利亞多管水母（Aequoreavictoria）。相對于綠色熒光蛋白，其熒光向紅色光譜偏移，而這主要是由于蛋白203位蘇氨酸變?yōu)槔野彼?。其最大激發(fā)波長為514nm，最大發(fā)射波長為527nm。黃色熒光蛋白（YellowFluorescentPr83熒光蛋白表達課件84YFP序列1atgaagttcgttgtacgggccctgaccgcgaccgccgtggcggcggcggtcgccgccctc61gccggatgctcggcgacctcgccggcccccggctccgccgagggctcctcagcggggacg121aagctcgtcgtctacacgccgcagggcgaccccgtgcgcgggggctacatcaccaagcac181gccaaatcggacctcggcctggacgtaaagctggtcaacggggcgggcggagatctcgcc241acccgcctcatcgccgagaagaacaacccgcaggcggacgtcgtcgtcgtcctcggggca301ccgcagctcaaccggatcgaccaggcgggtgtgctccagcctttcgctccagactgggcc361ggcaagatcccgtccgccttcgcgtccggaagcaaggacttcacactgctgacgcagacc421ccgatcgcgatcgcctacaacgcgtccacgatgacggcggcccaggcgccgagcagttgg481acggacctggccaagccggagtacaaggacaagttcgccttcccggccctcaccagccag541acgggccaggcggcagccgtgggaatcctgtggcgctacgccgatcacacgaccggcacg601gtgtcgcagaaaggctgggacacgctcgccgcgatcctccacaacgccaagcagaccgcc661gccggcgcgccgttcgactgggcacaggtgaggtccggcgttcagccgatcgtggtgagc721tggctgggcggcattcaaaccggcacctccgacaacaccatcgacctcaggatcgtcgac781gccgtcggcgggagcccgttcgtcaacggcggcgtcggcatggtcaaggacacgaagaac841gcagccgcggcccgcaagttcatcgactggttcggctccgacagcttccaggtcgggttc901gtcaccgcgacgaagaacgatacccccctcaacccggatgcggtcaagcggctccccggg961gccgagcagggactgcgccaggtcaccccgcagaagatcgactggggcgtggtgtcccag1021cgcctctcggactggttgcagaagatccagctcgatgtgcagggctgaYFP序列1atgaagttcgttgta85

像綠色熒光蛋白一樣，YFP是細胞生物學和分子生物學中一種非常常用的報告基因。目前，有三種改良的黃色熒光蛋白：Citrine,Venus,andYpet。這三種改良的蛋白熒光更亮，更穩(wěn)定，而且成熟更快，因此應用廣泛。黃色熒光蛋白最常用于熒光共振能量轉移，作為熒光能量的接受體（acceptor）。像綠色熒光蛋白一樣，YFP是細胞生物學和分子生物學中一種862.所用質粒介紹PUC19質粒

大腸桿菌克隆用質粒pUC19,簡稱pUC19，是質粒載體的一種。在由限制性核酸內切酶修飾過的質粒DNA序列中插入外源的目的基因，以質粒為載體，將目的基因通過轉化或轉導的方法導進宿主細胞，pUC19常用于DNA片段克隆、DNA測序、外源基因表達等。

pUC19大小只有2686bp，是最常用的質粒載體，其結構組成緊湊，幾乎不含多余的DNA片段，GenBank注冊號為L08752(pUC18)和X02514(pUC19)。由pBR322改造而來，其中l(wèi)acZ(MSC)來自M13mp18/19圖3-4是其質粒圖譜。pUC系列載體含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細胞中可表現(xiàn)α-互補作用。因此在多克隆位點中插入了外源片段后，可通過α-互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質粒。

2.所用質粒介紹PUC19質粒大腸桿菌克隆用質粒pUC187熒光蛋白表達課件88pET-28a載體

pET-28a-c(+)載體帶有一個N端的His/Thrombin/T7蛋白標簽，同時含有一個可以選擇的C端His標簽。pET28a載體的單一的多克隆位點見上面的環(huán)狀質粒圖譜。注意：載體序列是以pBR322質粒的編碼規(guī)矩進行編碼的，所以T7蛋白表達區(qū)在質粒圖譜上面是反向的。

T7RNA聚合酶啟動的克隆和表達區(qū)域在質粒圖譜中也被標注了出來。質粒的F1復制子是被定向的，所以在T7噬菌體聚合酶的作用下，包含有蛋白編碼序列的病毒粒子能夠產生，并啟動蛋白表達，同時蛋白表達將被T7終止子序列(Cat.No.69337-3)的作用下終止蛋白翻譯。pET-28a載體

pET-28a-c(+)載體帶有一個89熒光蛋白表達課件90兩種菌株差異

克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因表達相關的酶，

不能夠表達出目的基因，轉入的載體在其中大量復制；表達宿主：E.coliBL21（DE3）則可以表達出目的基因，即得到綠色、黃色、紅色的熒光蛋白。兩種菌株差異克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因91兩種載體差異克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細菌，將需要克隆的基因與克隆載體的質粒相連接，再導入原核細菌內，質粒會在原核細菌內大量復制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定會表達，但一定被大量復制。表達載體：就是在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件（如啟動子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達的載體?？寺≥d體目的在于復制足夠多的目標質粒，所以常帶有較強的自我復制元件，如復制起始位點等，往往在菌體內存在多拷貝，所以抽質粒會抽出一大堆，但不具備表達元件。而表達質粒有復雜的構成，為的是控制目標蛋白的表達，如各種啟動子（T7），調節(jié)子（LacZ）等，而且以pET為代表的表達載體在菌體內都是低拷貝的，防止?jié)B漏表達。

是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子--核糖體結合位點--克隆位點--轉錄終止信號，這是用來區(qū)別克隆載體和表達載體的標志。兩種載體差異克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細菌，將923.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因工程中常用的工具。雖然它不能像真核系統(tǒng)一樣進行翻譯后加工，但由于其遺傳背景相對比較清楚，使用安全、操作簡便、周期短、經濟，因此仍然是使用最廣泛的、也是不可被替代的系統(tǒng)。表達系統(tǒng)的核心是表達載體。用來在大腸桿菌中表達外源基因的載體有很多種。構建有效的表達載體是表達目的基因的基本要求，同時也是影響基因表達水平以及蛋白活性的總要因素。標準的大腸桿菌表達載體的主要組成包括：啟動子、操縱子、核糖體結合位點、翻譯起始區(qū)、多克隆位點、終止子、復制起點以及抗性篩選因子等。3.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因工933.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)一般來說,這些載體應滿足以下要求:重組質?？截悢?shù)高，表達量高適用范圍廣表達產物容易純化在菌體內穩(wěn)定性好目前已知的應用較廣的大腸桿菌表達載體有非融合表達載體、融合表達載體、分泌型表達載體和表面呈現(xiàn)表達載體等。3.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)一般來說,這些載體應滿足94

pET表達系統(tǒng)簡介pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強大系統(tǒng),它是最初由Studier等利用與啟動子配套能高效轉錄特定基因的外源RNA聚合酶構建的T7RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng),可以從各種基因(包括原核、真核細胞)生產大量的目的蛋白,pET表達系統(tǒng)的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在以下幾個方面:

※優(yōu)化靶蛋白表達:pET系統(tǒng)以其獨特的優(yōu)勢和載體、宿主之間重組的“協(xié)調”而優(yōu)化特異靶蛋白表達。

※嚴格控制基礎表達水平:

pET表達系統(tǒng)能嚴格控制誘導劑缺失時的基礎表達水平,許多難用其他E1coli表達系統(tǒng)表達的基因可在pET系統(tǒng)中高效穩(wěn)定地克隆和表達。

※宿主菌的最佳背景:pET系統(tǒng)有11種不同DE3溶原化宿主菌,其中使用最廣泛的為BL21及其衍生菌株,它的優(yōu)點在于缺失lon和ompT蛋白酶。

pET表達系統(tǒng)簡介954.SDS原理及蛋白分離與檢測

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS，polyacrylamidegelelectrophoresis）方法可對蛋白質的組分進行分離，并可精確測得蛋白質的分子量。常用的方法為SDS不連續(xù)系統(tǒng)。4.SDS原理及蛋白分離與檢測96

SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。熒光蛋白表達課件97

SDS首次由Shapiro等提出后,已成為廣泛應用于蛋白質分離的一種方法。由于SDS是一種陰離子去污劑,在還原劑(β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇,DTT)存在下,能破壞蛋白質亞基之間的非共價鍵,使其解離成單個的亞基,能按照一定比例與蛋白質分子結合成帶負電荷的復合物,其負電荷遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷,也就消除或降低不同蛋白質之間原有的電荷差別,這樣就使電泳遷移率只取決于相對分子量大小這一因素。由于SDS儀器簡單、操作方便、重復性好、可靠性強,除了測定蛋白質分子量外,還可以作為一種分離、純化的工具,此方法對于其他方法難溶的復合酶、病毒、及膜蛋白都可通過其解離作用而進行分析,而且對于某些變性蛋白質也能很方便直觀的分離出來。SDS首次由S98實驗設計實驗設計996.重組蛋白的SDS檢測1.獲得目的基因5.EGFP基因的原核表達及檢測3.質粒轉化克隆宿主E.coliDH5α2.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上4.質粒轉化表達宿主E.coliBL216.重組蛋白的SDS檢測1.獲得目的基因5.100詳細實驗流程詳細實驗流程101一、實驗試劑上、下游引物,ddH2O,10XBuffer,dNTP,質粒pEGFP-N3&pET-28a(+),TaqDNA聚合酶,限制性核酸內切酶HindⅢ&EcoRⅠ,T4DNA連接酶,CaCl2溶液,膠回收試劑盒(BindingBuffer,洗脫緩沖液,SPWWashbuffer),質粒小提試劑盒(含有RnaseA的溶液I,溶液II,溶液III,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer),LB培養(yǎng)基(LP0042TRYRTONE1%,LP0021YEASTEXTRACT0.5%,NaCl1%),麥康凱培養(yǎng)基(蛋白胨17g,脙胨3g,豬膽鹽5g,NaCl5g,瓊脂17g,ddH2O1000mL,乳糖10g,0.01%結晶