新城疫抗體測定技術(shù)課件

國標(biāo)ND抗體測定技術(shù)山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院朱明恩國標(biāo)ND抗體測定技術(shù)山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院朱明恩1國標(biāo)：新城疫診斷技術(shù)（GB/T16525-2008）2009-05-01實施本技術(shù)依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)制定國標(biāo)：新城疫診斷技術(shù)（GB/T16525-20082是開設(shè)畜牧獸醫(yī)類專業(yè)學(xué)校學(xué)生的必會技能是新城疫抗體監(jiān)測和診斷的重要手段是2011和2012年全國農(nóng)業(yè)技能大賽的比賽項目，據(jù)說還將是2014年全國農(nóng)業(yè)技能大賽的比賽項目安排本內(nèi)容的原因是開設(shè)畜牧獸醫(yī)類專業(yè)學(xué)校學(xué)生的必會技能安排本內(nèi)容的原因3新城疫抗體測定基本操作規(guī)程制備被檢血清制備1%RBC懸液HA試驗，測病毒的血凝價配制4單位病毒HI試驗，測血清的抗體滴度抗體滴度報告，以nlog2形式報告新城疫抗體測定基本操作規(guī)程制備被檢血清制備1%RBC懸液HA4儀器及材料

非免疫公雞、pH7.2生理鹽水、新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原、新城標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、新城標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、3.8%的枸櫞酸鈉、96孔V型板、微量移液器、吸頭、微型振蕩器、溫箱、離心機、天平、采血器等。儀器及材料非免疫公雞、pH7.5

心臟或靜脈采血2-3mL（不加抗凝劑），采血后使血液在采血器或滅菌干凈青霉素小瓶中凝固成斜面，室溫下2-3小時或4℃冰箱中過夜使血清析出，也可通過離心加快血清析出。血清為淡黃色透明液體。一、制備被檢血清心臟或靜脈采血2-3mL（不加抗凝劑），采血后使血液在一6翅靜脈采血

針頭在靜脈血管一側(cè)傾斜刺入皮膚，再與血管平行進針后刺入血管，見有少量回血即可采集血液，采血完成后馬上用手壓迫止血。翅靜脈采血針頭在靜脈血管一側(cè)傾斜刺入皮膚，再與血管7心臟采血雞右側(cè)臥保定，上腿自然踡曲，在上腿膝關(guān)節(jié)稍前下方約1cm處（心臟搏動最明顯的部位）垂直地面進針采血。

心臟采血雞右側(cè)臥保定，上腿自然踡曲，在上腿膝關(guān)節(jié)稍前8二、制備1％RBC懸液

1.制備抗凝血

在采血器（注射器）中吸入抗凝劑（3.8%的枸櫞酸鈉，抗凝比例為1：10），心臟或靜脈采血3-4mL，顛倒采血器使血液與抗凝劑充分混勻，然后將血液注入離心管中，用天平配平。二、制備1％RBC懸液1.制備抗凝血91．離心管、離心套管和管中液體作為一個整體進行配平2．離心管中液體不能太滿配平注意事項1．離心管、離心套管和管中液體作為一個整體進行配平2．離心管102.離心洗滌紅細(xì)胞（1）共洗滌3次，轉(zhuǎn)速和時間均為：2000r/min、5min。（2）第1次離心時間到，用移液器吸取并棄掉上清液、白細(xì)胞和血小板，加生理鹽水，吹打混勻紅細(xì)胞，配平后進行第2次離心，依此進行第3次離心。（3）第3次離心時間到，吸取并棄掉上清液、白細(xì)胞和血小板后，讀出離心管中紅細(xì)胞的體積。

注意：吹打混勻紅細(xì)胞時不要太用力，以免破壞紅細(xì)胞。2.離心洗滌紅細(xì)胞11新城疫抗體測定技術(shù)課件12離心機的使用離心機放置平穩(wěn)離心管對稱放入離心機，使其處于平衡狀態(tài)按檔位依次升高轉(zhuǎn)速至所需速度。離心時間到，將轉(zhuǎn)速調(diào)為零，離心機停轉(zhuǎn)后方可取出離心管。離心機的使用離心機放置平穩(wěn)13

3.配制1%RBC懸液根據(jù)紅細(xì)胞的體積，計算所需生理鹽水量，用所需生理鹽水將紅細(xì)胞泥全部沖入小燒杯中，搖勻即可。

注意：搖勻時動作要輕柔，以防紅細(xì)胞破碎或液體外溢。3.配制1%RBC懸液14紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBC血凝性病毒有相應(yīng)受體的紅細(xì)胞RBC血凝素纖突受體v血凝素纖突三、血凝試驗（HA）1．基本原理紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRB15孔號123456789101112病毒稀釋倍數(shù)生理鹽水標(biāo)準(zhǔn)抗原生理鹽水1%RBC懸液

212223242526272829210211對照2525252525252525252525252525252525252525252525棄25252525252525252525252525252525252525252525252525

振蕩混勻，室溫即20℃～25℃下靜置40min后觀察結(jié)果。若環(huán)境溫度太高，放4℃靜置60min。生理鹽水對照孔紅細(xì)胞成明顯鈕扣狀沉到孔底時判定結(jié)果。2．操作術(shù)式（微量法，單位ul）

新的操作方法和舊版有哪些不同？生理鹽水、劑量、反應(yīng)條件孔號123456789101112病毒稀釋倍數(shù)2116HA試驗結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全凝集：紅細(xì)胞呈傘狀均勻分布于孔底不完全凝集：介于兩者之間HA試驗結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全17新城疫抗體測定技術(shù)課件18

病毒的HA價（血凝滴度）：能使紅細(xì)胞發(fā)生完全凝集的病毒最大稀釋倍數(shù)稱為病毒的血凝價，常用nlog2或1：xxx表示。HA試驗成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（HI同）正確使用微量移液器（吸頭固定緊，每次都要排空）；吸頭不能混用；懸滴加樣；混勻要徹底；時間和溫度合適。病毒的HA價（血凝滴度）：能使紅細(xì)胞發(fā)生完全19四、4單位病毒的配制HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)

用生理鹽水稀釋HA試驗的NDV液4單位病毒液HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)用生理鹽水稀釋HA試驗的NDV液HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)4單位病毒液用生理鹽水稀釋HA試驗的NDV液HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)介紹：回歸試驗四、4單位病毒的配制HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝20回歸試驗用4V進行的HA試驗（用4個孔），用于檢驗4V配制是否正確。4V配制正確的判定標(biāo)準(zhǔn)：

前2個孔完全凝集，后2個孔不完全凝集，如下圖：回歸試驗用4V進行的HA試驗（用4個孔），用于檢驗4V配21

五、血凝抑制試驗（HI）當(dāng)病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合后，病毒凝集紅細(xì)胞的能力受到抑制，稱為病毒的血凝抑制。新城疫抗體測定技術(shù)課件22Ag、Ab不對應(yīng)RBC抗體紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBCRBCv血凝性病毒血凝素纖突RBC有其受體的紅細(xì)胞血凝素纖突受體RBCv血凝性病毒血凝素纖突vvvvAg、Ab對應(yīng)HAHIRBC紅細(xì)胞不凝集（HI現(xiàn)象）RBCvvRBCRBC1．反應(yīng)原理Ag、Ab不對應(yīng)RBC抗體紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvv23孔號123456789101112生理鹽水被檢血清血清稀釋倍數(shù)4V25252525252525252525255025252525252525252525－－

棄25

212223242526272829210

病毒鹽水對照對照2525252525252525252525－輕叩反應(yīng)板使反應(yīng)物混合均勻，室溫即20℃～25℃下靜置不少于30min，4℃靜置不少于60min。1%RBC懸液252525252525252525252525

振蕩混勻，室溫即20℃～25℃下靜置40min后觀察結(jié)果。若環(huán)境溫度太高，放4℃靜置60min。生理鹽水對照孔紅細(xì)胞成明顯鈕扣狀沉到孔底時判定結(jié)果。２．HI試驗操作術(shù)式（微量法，單位ul）注意：除被檢血清外，標(biāo)準(zhǔn)陽性和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各做一排?？滋?23456789101112生理鹽水2524HI試驗結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全凝集：紅細(xì)胞呈傘狀均勻分布于孔底不完全凝集：介于兩者之間HI試驗結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全25

血清的血凝抑制價：能使4V凝集紅細(xì)胞的能力受到完全抑制的血清最大稀釋倍數(shù)稱該血清的血凝抑效價（HI價、抗體滴度、抗體效價）。請對左側(cè)的結(jié)果進行抗體滴度報告血清的血凝抑制價：能使4V凝集紅細(xì)胞的能力受到完全抑26結(jié)果判定（新城疫抗體測定）在生理鹽水對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果（紅細(xì)胞完全流下）的情況下，將反應(yīng)板傾斜，從背側(cè)觀察，正確判讀被檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的HI效價，以nLog2方式報告結(jié)果，并填寫結(jié)果報告單。只有當(dāng)陰性血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原對照的HI滴度不大于2log2，陽性血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原對照的HI滴度與已知滴度相差在1個稀釋度范圍內(nèi)，并且所用陰、陽性血清都不發(fā)生自凝的情況下，HI試驗結(jié)果方判定有效。HI滴度可以作為強毒感染和免疫監(jiān)測驗重要依據(jù)。當(dāng)HI滴度≥9log2或HI滴度明顯高低不齊，可懷疑為新城疫強毒感染。結(jié)果判定（新城疫抗體測定）在生理鹽水對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果（紅細(xì)27細(xì)節(jié)決定成敗細(xì)節(jié)決定成敗28不當(dāng)之處，敬請批評指正謝謝不當(dāng)之處，敬請批評指正29國標(biāo)ND抗體測定技術(shù)山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院朱明恩國標(biāo)ND抗體測定技術(shù)山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院朱明恩30國標(biāo)：新城疫診斷技術(shù)（GB/T16525-2008）2009-05-01實施本技術(shù)依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)制定國標(biāo)：新城疫診斷技術(shù)（GB/T16525-200831是開設(shè)畜牧獸醫(yī)類專業(yè)學(xué)校學(xué)生的必會技能是新城疫抗體監(jiān)測和診斷的重要手段是2011和2012年全國農(nóng)業(yè)技能大賽的比賽項目，據(jù)說還將是2014年全國農(nóng)業(yè)技能大賽的比賽項目安排本內(nèi)容的原因是開設(shè)畜牧獸醫(yī)類專業(yè)學(xué)校學(xué)生的必會技能安排本內(nèi)容的原因32新城疫抗體測定基本操作規(guī)程制備被檢血清制備1%RBC懸液HA試驗，測病毒的血凝價配制4單位病毒HI試驗，測血清的抗體滴度抗體滴度報告，以nlog2形式報告新城疫抗體測定基本操作規(guī)程制備被檢血清制備1%RBC懸液HA33儀器及材料

非免疫公雞、pH7.2生理鹽水、新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原、新城標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、新城標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、3.8%的枸櫞酸鈉、96孔V型板、微量移液器、吸頭、微型振蕩器、溫箱、離心機、天平、采血器等。儀器及材料非免疫公雞、pH7.34

心臟或靜脈采血2-3mL（不加抗凝劑），采血后使血液在采血器或滅菌干凈青霉素小瓶中凝固成斜面，室溫下2-3小時或4℃冰箱中過夜使血清析出，也可通過離心加快血清析出。血清為淡黃色透明液體。一、制備被檢血清心臟或靜脈采血2-3mL（不加抗凝劑），采血后使血液在一35翅靜脈采血

針頭在靜脈血管一側(cè)傾斜刺入皮膚，再與血管平行進針后刺入血管，見有少量回血即可采集血液，采血完成后馬上用手壓迫止血。翅靜脈采血針頭在靜脈血管一側(cè)傾斜刺入皮膚，再與血管36心臟采血雞右側(cè)臥保定，上腿自然踡曲，在上腿膝關(guān)節(jié)稍前下方約1cm處（心臟搏動最明顯的部位）垂直地面進針采血。

心臟采血雞右側(cè)臥保定，上腿自然踡曲，在上腿膝關(guān)節(jié)稍前37二、制備1％RBC懸液

1.制備抗凝血

在采血器（注射器）中吸入抗凝劑（3.8%的枸櫞酸鈉，抗凝比例為1：10），心臟或靜脈采血3-4mL，顛倒采血器使血液與抗凝劑充分混勻，然后將血液注入離心管中，用天平配平。二、制備1％RBC懸液1.制備抗凝血381．離心管、離心套管和管中液體作為一個整體進行配平2．離心管中液體不能太滿配平注意事項1．離心管、離心套管和管中液體作為一個整體進行配平2．離心管392.離心洗滌紅細(xì)胞（1）共洗滌3次，轉(zhuǎn)速和時間均為：2000r/min、5min。（2）第1次離心時間到，用移液器吸取并棄掉上清液、白細(xì)胞和血小板，加生理鹽水，吹打混勻紅細(xì)胞，配平后進行第2次離心，依此進行第3次離心。（3）第3次離心時間到，吸取并棄掉上清液、白細(xì)胞和血小板后，讀出離心管中紅細(xì)胞的體積。

注意：吹打混勻紅細(xì)胞時不要太用力，以免破壞紅細(xì)胞。2.離心洗滌紅細(xì)胞40新城疫抗體測定技術(shù)課件41離心機的使用離心機放置平穩(wěn)離心管對稱放入離心機，使其處于平衡狀態(tài)按檔位依次升高轉(zhuǎn)速至所需速度。離心時間到，將轉(zhuǎn)速調(diào)為零，離心機停轉(zhuǎn)后方可取出離心管。離心機的使用離心機放置平穩(wěn)42

3.配制1%RBC懸液根據(jù)紅細(xì)胞的體積，計算所需生理鹽水量，用所需生理鹽水將紅細(xì)胞泥全部沖入小燒杯中，搖勻即可。

注意：搖勻時動作要輕柔，以防紅細(xì)胞破碎或液體外溢。3.配制1%RBC懸液43紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBC血凝性病毒有相應(yīng)受體的紅細(xì)胞RBC血凝素纖突受體v血凝素纖突三、血凝試驗（HA）1．基本原理紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRB44孔號123456789101112病毒稀釋倍數(shù)生理鹽水標(biāo)準(zhǔn)抗原生理鹽水1%RBC懸液

212223242526272829210211對照2525252525252525252525252525252525252525252525棄25252525252525252525252525252525252525252525252525

振蕩混勻，室溫即20℃～25℃下靜置40min后觀察結(jié)果。若環(huán)境溫度太高，放4℃靜置60min。生理鹽水對照孔紅細(xì)胞成明顯鈕扣狀沉到孔底時判定結(jié)果。2．操作術(shù)式（微量法，單位ul）

新的操作方法和舊版有哪些不同？生理鹽水、劑量、反應(yīng)條件孔號123456789101112病毒稀釋倍數(shù)2145HA試驗結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全凝集：紅細(xì)胞呈傘狀均勻分布于孔底不完全凝集：介于兩者之間HA試驗結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全46新城疫抗體測定技術(shù)課件47

病毒的HA價（血凝滴度）：能使紅細(xì)胞發(fā)生完全凝集的病毒最大稀釋倍數(shù)稱為病毒的血凝價，常用nlog2或1：xxx表示。HA試驗成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（HI同）正確使用微量移液器（吸頭固定緊，每次都要排空）；吸頭不能混用；懸滴加樣；混勻要徹底；時間和溫度合適。病毒的HA價（血凝滴度）：能使紅細(xì)胞發(fā)生完全48四、4單位病毒的配制HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)

用生理鹽水稀釋HA試驗的NDV液4單位病毒液HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)用生理鹽水稀釋HA試驗的NDV液HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)4單位病毒液用生理鹽水稀釋HA試驗的NDV液HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)介紹：回歸試驗四、4單位病毒的配制HA試驗，測定做NDV病毒的血凝效價血凝49回歸試驗用4V進行的HA試驗（用4個孔），用于檢驗4V配制是否正確。4V配制正確的判定標(biāo)準(zhǔn)：

前2個孔完全凝集，后2個孔不完全凝集，如下圖：回歸試驗用4V進行的HA試驗（用4個孔），用于檢驗4V配50

五、血凝抑制試驗（HI）當(dāng)病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合后，病毒凝集紅細(xì)胞的能力受到抑制，稱為病毒的血凝抑制。新城疫抗體測定技術(shù)課件51Ag、Ab不對應(yīng)RBC抗體紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBCRBCv血凝性病毒血凝素纖突RBC有其受體的紅細(xì)胞血凝素纖突受體RBCv血凝性病毒血凝素纖突vvvvAg、Ab對應(yīng)HAHIRBC紅細(xì)胞不凝集（HI現(xiàn)象）RBCvvRBCRBC1．反應(yīng)原理Ag、Ab不對應(yīng)RBC抗體紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvv52孔號123456789101112生理鹽水被檢血清血清稀釋倍數(shù)4V25252525252525252525255025252525252525252525－－

棄25

212223242526272829210

病毒鹽