植物熱激反應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

關(guān)于植物熱激反應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第一頁，共八十一頁，2022年，8月28日

第八章植物熱激反應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第一節(jié)植物的熱脅迫第二頁，共八十一頁，2022年，8月28日第一節(jié)植物的熱脅迫一、高溫逆境與植物外觀形態(tài)及生長發(fā)育的關(guān)系二、耐熱性與細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性及植物器官結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)的關(guān)系三、高溫對蛋白質(zhì)代謝與保護(hù)酶系統(tǒng)的影響四、與植物耐熱性相關(guān)的其它物質(zhì)五、高溫對光合、呼吸及蒸騰作用的影響第三頁，共八十一頁，2022年，8月28日第一節(jié)植物的熱脅迫

氣候預(yù)測表明，溫室效應(yīng)將導(dǎo)致全球性氣溫上升，整個種植業(yè)面臨高溫挑戰(zhàn)，因此有關(guān)植物抗熱性的研究變得日趨重要。通常情況下，將由高溫引起植物傷害的現(xiàn)象稱為熱害(heatinjury)。植物對高溫脅迫的適應(yīng)則稱為抗熱性(heatresistance)。但熱害的溫度很難定量，因為不同類型植物對高溫的忍耐程度有很大差異。根據(jù)植物對溫度的反應(yīng)可分為如下幾類：1）喜冷植物：如某些藻類、細(xì)菌和真菌，生長溫度在零上低溫(0～20℃)，當(dāng)溫度在15～20℃以上即受高溫傷害；2）中生植物：如水生和陰生的高等植物，地衣和苔蘚等，生長溫度為10～30℃，超過35℃就會受傷；3）喜溫植物：其中第四頁，共八十一頁，2022年，8月28日

有些植物在45℃以上才受傷害，稱為適度喜溫植物，例如陸生高等植物，某些隱花植物；有些植物則在65～100℃才受害，稱為極度喜溫植物，如藍(lán)綠藻、真菌和細(xì)菌等。發(fā)生熱害的溫度和作用時間有關(guān)，即致傷的高溫和暴露的時間成反比，暴露時間愈短，植物可忍耐的溫度愈高。下面主要介紹高溫脅迫下植物體外觀形態(tài)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及生理生化方面發(fā)生的變化。

一、高溫逆境與植物外觀形態(tài)及生長發(fā)育的關(guān)系高溫脅迫下，植物生長發(fā)育會受到不同程度的影響，外觀主要體現(xiàn)在形態(tài)結(jié)構(gòu)變化上。高溫下，植物保持龐大的根系和活力，與植物的抗熱第五頁，共八十一頁，2022年，8月28日

性有較緊密的聯(lián)系。Kuo等在大白菜上的研究發(fā)現(xiàn)耐熱材科的根生長旺盛，而高溫限制了熱敏材科根系的生長，并且耐熱材料在炎熱的夏季形成葉球的能力與其根系生長良好有關(guān)．葉是光合作用主要器官，面高溫下植物蒸騰失水也主要通過葉片進(jìn)行。熱脅迫常引起植物葉片茸毛、蠟質(zhì)、角質(zhì)層厚度、氣孔數(shù)量和開度以及柵欄細(xì)胞的排列發(fā)生變化。在獼猴桃上發(fā)現(xiàn)，抗熱品種熱脅邊下葉片和柵欄組織增厚，柵欄組織／海綿組織比值較高，避免了高溫高熱條件下水分的過皮蒸發(fā)。對于食用果實(shí)、種子的蔬菜作物來說，高溫下配子體能保持正常的授扮受精能力，是植物具有較強(qiáng)抗性的一個重要指標(biāo)。高溫能增加第六頁，共八十一頁，2022年，8月28日

花粉?？倲?shù)。而不耐熱基因型較耐熱基因型在高溫下產(chǎn)生更多的“畸形”花粉粒，“畸形”花粉粒在花藥開裂前已萌發(fā)，外形小，內(nèi)含物少，用TTC染色已喪失活力。植物的外觀形態(tài)也可作為鑒定植物耐熱性的指標(biāo)。二、耐熱性與細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性及植物器官結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)的關(guān)系細(xì)胞膜系統(tǒng)是熱損傷和抗熱的中心，細(xì)胞膜的熱穩(wěn)定性反映了植物耐熱能力。1977年Sullivan首次將電導(dǎo)法用于測定細(xì)胞膜熱穩(wěn)定性，此后該法被普遍應(yīng)用。目前人們大多將細(xì)胞膜熱穩(wěn)定性和高溫半致死溫度、時間作為植物抗熱性的鑒定指標(biāo)。但也有不同的報道，如第七頁，共八十一頁，2022年，8月28日

在對大白菜的研究中發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率與耐熱性的關(guān)系并不顯著；利用電導(dǎo)法測定黃瓜的耐熱性存在滯后性。細(xì)胞膜穩(wěn)定性與膜脂的脂肪酸飽和程度有關(guān)，植物體內(nèi)脂肪酸的高度飽和有利于提高膜的相變溫度。高溫會加劇膜脂過氧化作用，甚至?xí)p傷植物細(xì)胞膜系統(tǒng)，此過程的產(chǎn)物之一是丙二醛(MDA)，它常被作為膜脂過氧化作用的一個主要指標(biāo)，但對其能否作為一項耐熱性的篩選指標(biāo)尚未達(dá)成一致意見。通過對高溫下植物微觀結(jié)構(gòu)變化的觀測，可以為耐熱育種提供細(xì)胞學(xué)的理論依據(jù)。蘿卜耐熱品種比感熱品種葉表皮氣孔密度大，體積小，開度小，部分呈關(guān)閉狀態(tài)，葉片厚，葉肉細(xì)胞第八頁，共八十一頁，2022年，8月28日

排列緊密且很少出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象。耐熱品種葉柄內(nèi)維管束總面積是感熱品種的1.5倍以上且有發(fā)達(dá)的形成層和厚壁組織，故其保水能力強(qiáng)。耐熱品種葉片和柵欄組織較厚，柵欄組織/海綿組織比例及氣孔密度較大。盡管甘藍(lán)葉片的蠟粉密度及結(jié)構(gòu)與它對光的反射有關(guān)，但對其抗熱性無影響，通過掃描電鏡觀察到耐熱品種葉片表面蠟粉晶粒致密，故認(rèn)為耐熱性可能與蠟粉晶粒的結(jié)構(gòu)和數(shù)量有關(guān)，并進(jìn)而影響結(jié)球能力。在對甘藍(lán)的研究中發(fā)現(xiàn)高溫下核膜、核仁、核質(zhì)都會受到不同程度的破壞，特別是核仁逐漸消失，核內(nèi)聚集很多染色較深的纖維狀顆粒，細(xì)胞壁周圍和葉綠體內(nèi)也出現(xiàn)了這種第九頁，共八十一頁，2022年，8月28日

物質(zhì)，這可能是細(xì)胞受高溫脅迫的重要標(biāo)志之一，同時他指出葉片中不同細(xì)胞器對高溫的敏感程度不同。高溫引起的植物體結(jié)構(gòu)上的變化必然會使植物體的某些功能發(fā)生改變，從這些變化中找出與耐熱性相關(guān)的結(jié)構(gòu)特征，既可以為耐熱育種提供理論依據(jù)又可以從生物物理學(xué)的角度來對植物耐熱性進(jìn)行深層次的探討。但目前這方面的研究大多僅限于對高溫逆境下植株結(jié)構(gòu)變化的觀察，而對于這些變化發(fā)生的原因及產(chǎn)生的后果均未見報道。第十頁，共八十一頁，2022年，8月28日三、高溫對蛋白質(zhì)代謝與保護(hù)酶系統(tǒng)的影響高溫脅迫使蛋白質(zhì)降解，游離氨基酸含量增加，特別是引起脯氨酸大量積累。由于各種脅迫都可引起脯氨酸積累，所以有人認(rèn)為可將其作為逆境脅迫的一個鑒定指標(biāo)。高溫脅迫引起的膜脂過氧化過程中O-２、H２O２等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生速度與保護(hù)酶系統(tǒng)在高溫下的活性共同決定著植物的耐熱性。熱脅迫時過氧化物酶(POD)活性先下降后升高，且耐熱品種無論在高溫或是常溫條件下POD活性均較感熱品種高，這可能與POD具有很好的熱穩(wěn)定性有關(guān)。甘藍(lán)的POD在38℃下熱激10min仍能保持較高活性，在研究大白菜時發(fā)現(xiàn)熱激后POD活性下降，過氧化氫酶第十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日(CAT)活性提高，超氧化物歧化酶(SOD)活性先提高后下降。盡管SOD可清除Oˉ2，減輕膜脂過氧化對細(xì)胞內(nèi)其它部位的傷害，但這種保護(hù)作用是有限的；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性過低造成的H２O２過量積累，不僅抑制了SOD的活性，而且使膜脂過氧化，蛋白質(zhì)交聯(lián)，DNA降解。植物中的H２O２主要是由APX清除的，而CAT的作用不大，其原因可能是CAT酶促反應(yīng)具有較高的Km值而無法使H２O２濃度降到不足以傷害細(xì)胞的閾值以下。從以上研究可知，高溫條件下植物體內(nèi)生化代謝變化復(fù)雜，常因研究者采用的材料、方法不同而得出不同的結(jié)果，這一現(xiàn)象還有待于進(jìn)一步研究。第十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日四、與植物耐熱性相關(guān)的其它物質(zhì)乙烯的產(chǎn)生可以提高植物對熱脅迫的抵抗能力。高溫脅迫可使辣椒中乙烯含量發(fā)生變化，花對乙烯的敏感性以及花內(nèi)的乙烯含量與抗熱性有關(guān)，但前者可能對異常落花的影響更大；脫落酸(ABA)在提高植物的抗性方面作用顯著，但蔓生菜豆中高溫脅迫與ABA并無相關(guān)性，同時他發(fā)現(xiàn)吲哚乙酸(IAA)從花芽內(nèi)的輸出量與植物耐熱性有關(guān)，但ABA在高溫條件下可使葉溫升到抑制蒸騰作用的程度，從而加重高溫傷害。水楊酸(SA)可抑制CAT的活性，使POD活性提高，促進(jìn)SOD基因的表達(dá)。植物可以通過改變SA的含量來傳遞逆境信息，使未遭受逆境的部位獲得第十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日

抗性。泛肽可以通過產(chǎn)生熱激蛋白(HSPs)對細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，但在40℃以上高溫條件下的蛋白質(zhì)代謝過程中泛肽并沒有參與。此外，由于多胺與植物逆境脅迫反應(yīng)關(guān)系密切，高等植物也可通過多胺來調(diào)節(jié)一系列生理反應(yīng)，以適應(yīng)熱脅迫，但這方面研究較少。激素等植物內(nèi)源次生化合物在蔬菜作物抵御逆境脅迫中具有十分重要的作用，但由于其含量甚微，目前仍有許多問題尚待研究和探討，尤其對其發(fā)生作用的分子機(jī)理應(yīng)加以深入研究。第十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日五、高溫對光合、呼吸及蒸騰作用的影響高溫會損傷葉綠體、線粒體的結(jié)構(gòu)，使光合色素降解，抑制光合作用，促進(jìn)呼吸作用。高溫下氣孔導(dǎo)度、氣孔限制值、表觀量子效率及羧化效率均下降，細(xì)胞間隙CO２濃度上升。由此可知，葉片光合機(jī)構(gòu)遭破壞的非氣孔因素是凈光合速率降低的主要原因，而且，高溫處理初期凈光合率下降以氣孔限制因素為主，隨著時間的延長，則以非氣孔限制為主。氣孔開放被抑制可能是礦質(zhì)元素間的拮抗作用所致。熱激導(dǎo)致的凈光合率下降的原因可能是光合磷酸化受阻，盡管RuBP羧化酶本身是熱穩(wěn)定的，但隨光合磷酸化下降它對光能的活性也下降。第十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日

同時，他認(rèn)為光合器官的熱穩(wěn)定性與類囊體膜超微結(jié)構(gòu)有關(guān)，甘藍(lán)熱敏品種在38～39℃高溫脅迫下葉綠體膜斷裂、解體，類囊體片層松散、排列紊亂、基質(zhì)片層模糊不清，說明熱脅迫下微觀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性同抗熱性是密切相關(guān)的。番茄、茄子、馬鈴薯等在高溫脅迫下光合系統(tǒng)I(PSI)發(fā)生不可逆性抑制，而光合系統(tǒng)II(PSII)對熱脅迫有較強(qiáng)的抵抗力。高溫脅迫對PS中心除了瞬時鈍化作用外，還存在間接的、較為緩慢的鈍化作用。其原因可能是高溫脅迫激活了類囊體膜上的脂肪酶，使富含不飽和脂肪酸的類囊體膜脂降解，形成自由的不飽和脂肪酸，從而鈍化反應(yīng)中心。第十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日

高溫對光合、呼吸、蒸騰作用的影響目前已經(jīng)基本清楚，且三者間存在著相互作用，但對于其作用機(jī)理仍存在爭議，因為各種生理過程均涉及到復(fù)雜的生化變化，并與細(xì)胞及各種細(xì)胞器的物理結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。從上述可以看出，高溫對植物造成的傷害是多方面的，但最主要的是對胞內(nèi)酶的破壞，造成細(xì)胞正常的代謝受阻，導(dǎo)致生長發(fā)育中止或者引起細(xì)胞死亡。但是植物體對高溫脅迫的響應(yīng)并不是完全被動的，會發(fā)生相應(yīng)的適應(yīng)反應(yīng)來降低脅迫造成的傷害，以維持基本的生理代謝；甚至通過開啟某些基因的表達(dá)對高溫產(chǎn)生抗性。這一過程中最顯著的生理變化是：第十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日

正常的蛋白合成受到抑制，細(xì)胞轉(zhuǎn)向合成熱激蛋白。大量的研究工作業(yè)已證實(shí)主要的熱激蛋白都具有“分子監(jiān)護(hù)蛋白”(molecularchaperone，CPN)的功能，這從一個側(cè)面解釋了為什么熱激蛋白的合成可以賦予生物體耐高溫的能力，從另一角度講，大部分監(jiān)護(hù)蛋白具有熱激誘導(dǎo)特征。因此熱激蛋白和監(jiān)護(hù)蛋白是從不同角度對同一類蛋白的描述。

Ritossa于1962年首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，十幾年后Tissieres發(fā)現(xiàn)熱激蛋白。現(xiàn)已證明，從細(xì)菌到人，所有生物都可對熱激產(chǎn)生反應(yīng)，而且除溫度外，其它許多因子例如氨基酸類似物、高鹽濃度、厭氧、水分脅迫、低溫、第十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日

重金屬離子、亞砷酸鹽、乙醇、營養(yǎng)饑餓、2,4-D、ABA等都可以誘導(dǎo)熱激反應(yīng)，合成的HSPs參與生物的許多代謝過程。目前對HSPs的功能、結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)的調(diào)控等都進(jìn)行了許多研究，積累了大量的資料。第十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日

第八章植物熱激反應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第一節(jié)植物的熱脅迫第二節(jié)植物的熱激蛋白家族第二十頁，共八十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)植物的熱激蛋白家族一、HSPs的分類和定位二、熱激反應(yīng)的特點(diǎn)三、熱激蛋白的功能第二十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)植物的熱激蛋白家族在高于正常生長溫度5℃以上時，生物體大部分正常蛋白質(zhì)的合成和mRNA的轉(zhuǎn)錄被抑制，同時迅速合成一些新的蛋白質(zhì)稱之為熱激蛋白(heatshockproteins，HSPs)，這種現(xiàn)象叫做熱激反應(yīng)(heatshockresponse，HSR)。一、HSPs的分類和定位按照SDS電泳的表觀分子量大小可以把植物HSPs分為五大類：HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子量熱激蛋白smHSPs。第二十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日HSP60以上的又統(tǒng)稱HMWHSPs(highmolecularweightHSPs)或laHSPs(largeHSPs)。smHSPs包括細(xì)胞質(zhì)Ⅰ類smHSPs、細(xì)胞質(zhì)Ⅱ類smHSPs、葉綠體smHSPs、線粒體smHSPs和內(nèi)膜smHSPs等。除熱激外，正常生活的細(xì)胞中也有HSPs，這類HSPs是組成型表達(dá)的，稱為HSC(heatshockcognateprotein)。HSC和誘導(dǎo)型HSP在結(jié)構(gòu)和功能上都很難區(qū)分，統(tǒng)稱HSP。Ubi(Ubiquitin，遍在蛋白)是一種依賴ATP促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)水解的小分子量熱激蛋白。PDI(proteindisulphide2isomerase，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶)也被認(rèn)為是一種熱激蛋白。每一類HSPs在結(jié)構(gòu)上都具有不同程度的保守性，它們第二十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日

在生物體正常的生理代謝或脅迫響應(yīng)中擔(dān)負(fù)不同的功能。一種植物體一般含有幾類HSPs，但在脅迫條件下可能只有一種HSPs起主導(dǎo)作用。目前發(fā)現(xiàn)熱激蛋白定位于細(xì)胞的多種細(xì)胞器，包括細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和內(nèi)膜系統(tǒng)。二、熱激反應(yīng)的特點(diǎn)（一）HSPs的保守性

HSP是目前發(fā)現(xiàn)的最保守的蛋白質(zhì)之一。首先，親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的原核生物和真核生物，他們的HSP有很高的同源性，例如真核生物HSP70s和大腸桿菌的HSP70即DnaK蛋白的同源性大于65%。其次，不同物種相同細(xì)胞器如細(xì)胞質(zhì)HSP70之間的同源性比同一物種不同細(xì)胞器第二十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日

的HSP70之間的同源性高，玉米、矮牽牛、擬南芥、大豆、豌豆、綠藻等細(xì)胞質(zhì)HSP70氨基酸的同源性達(dá)75.0%，但如和番茄HSP70(定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng))一起比較，則同源性只有54.9%。同樣，豌豆、大豆、擬南芥、小麥4種細(xì)胞質(zhì)I類smHSPs氨基酸之間的同源性也較高，為68.2%～85.1%。這似乎反應(yīng)了不同細(xì)胞器HSP70之間很早的分歧(divergence)。第三，同種植物不同類型的HSPs的同源性較低，例如豌豆HSP18.1、HSP17.7、HSP22.7和HSP21分別屬于不同類型，它們之間的同源性低于50%。HSPs的高度保守性說明他們在生物生命活動中具有重要的作用。第二十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日（二）熱激反應(yīng)的短時性

Northern雜交分析表明，熱激時3～5min就可檢測到大豆幼苗HSPmRNAs的積累，1～2h達(dá)到高峰，6h后顯著下降，12h就檢測不出了。放射性標(biāo)記顯示，氨基酸滲入HSPs在4h達(dá)到高峰，隨后下降。但28℃和40℃加入Aze(三甲叉亞胺甲酸，氨基酸類似物)12h后HSPs合成仍不變，似乎Aze和高溫誘導(dǎo)HSP合成的機(jī)理不同。植物HSP110比其它HSPs合成的時間更短，主要在熱激的第一小時合成。第二十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日（三）熱激蛋白的多樣性

HSPs的種類很多，分子量從15kD～110kD或更高，定位于多種細(xì)胞器。如前所述，通常根據(jù)分子量的大小分為laHSPs和smHSPs兩類。laHSPs在動物中較多，而植物中較少，大多數(shù)植物常見的laHSPs為68、70、83、92kD等。此外，分子量更大的如番茄的HSP95、大麥的HSP99、小麥的HSP103、棉花的HSP100、煙草的HSP100和120、以及大豆的HSP110等。植物熱激蛋白的顯著特點(diǎn)是smHSPs相當(dāng)多，如大豆有27種分子量在15～25kD之間的smHSPs，其中6種是增加合成，21種是誘導(dǎo)合成。已研究過的植物大多smHSPs都在20種左右。第二十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日三、熱激蛋白的功能（一）熱激蛋白具有分子伴侶作用分子伴侶(molecularchaperones)是指與新生肽鏈的折疊，寡聚蛋白質(zhì)的組裝和蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸有關(guān)的一類特殊蛋白質(zhì)分子。HSP60最早被稱為分子伴侶，目前已經(jīng)證明HSP90、HSP70、smHSPs都具有分子伴侶作用。哺乳動物HSP90具有改變或保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用，主要在于使甾類激素受體保持一種特殊的構(gòu)象，以便接受合適的受體信號。所有HSP70都和ATP結(jié)合，可以用ATP親和層析分離，具有微弱的ATP酶活性。HSP70最保守的區(qū)域在N末端(1～305AA)，也是和ATP結(jié)合的部位。推測HSP70第二十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日

在依賴ATP的蛋白質(zhì)的折疊和裝配中起作用。酵母和HSP70即SSA蛋白可以促進(jìn)跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜運(yùn)輸。體外裝配的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體蛋白運(yùn)輸系統(tǒng)加入HSP70或HSC70則運(yùn)輸能力增強(qiáng)，其原因是HSP70使新生蛋白質(zhì)處于非折疊狀態(tài)或保持適合運(yùn)輸?shù)男问?。HSC70和新生肽結(jié)合，促進(jìn)許多蛋白質(zhì)的正確折疊。熱激誘導(dǎo)的HSP70的量比細(xì)胞中原有的少得多。熱激時HSP70和熱變性蛋白結(jié)合，當(dāng)熱激恢復(fù)時，通過水解ATP促使蛋白質(zhì)的折疊和組裝，從而恢復(fù)活性。所有高等真核生物高溫脅迫時產(chǎn)生的HSP70主要定位于核仁，恢復(fù)時再從新分布于細(xì)胞質(zhì)中。第二十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日

線粒體HSP60主要參與核編碼的運(yùn)輸入線粒體的蛋白質(zhì)的加工、定位和裝配。研究表明HSP60影響線粒體膜上F12-ATP酶復(fù)合體的裝配和線粒體蛋白FieskeFe/S和cytob2的正確加工和定位。在酵母中進(jìn)一步研究了HSP60和新運(yùn)進(jìn)的線粒體未裝配的蛋白質(zhì)的相互作用模式：首先未折疊的蛋白質(zhì)和高分子量的HSP60連接，蛋白質(zhì)的折疊在復(fù)合體的表面進(jìn)行并需要ATP，然后在另外線粒體蛋白組分(很可能是GroES同源物)參與下并水解ATP把折疊的蛋白質(zhì)釋放出來。葉綠體HSP60同源物最初稱為Rubisco連接蛋白，由核基因編碼，在非熱激條件下含量很高，目前尚未有熱激誘導(dǎo)其表達(dá)的報道。第三十頁，共八十一頁，2022年，8月28日

豌豆離體HSP60由分子量約61kD和60kD的兩種亞基組成720kD的復(fù)合體，主要參與Rubisco全酶的裝配。植物Rubisco全酶由2類16個亞基組成：8個由葉綠體基因編碼的大亞基和8個由核基因編碼的小亞基，新合成的大亞基首先和HSP60結(jié)合才能裝配成全酶。應(yīng)用突變體研究證明GroEL參與細(xì)胞蛋白質(zhì)的折疊和裝配。酵母HSP60基因位點(diǎn)缺失(defectivelocus)條件致死突變體的線粒體蛋白不能正確裝配。在熱激和熱激恢復(fù)時，15～18kD的HSPs在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器之間穿梭(shuttle)，起著分子伴侶的作用，具有保護(hù)細(xì)胞不受高溫傷害，修補(bǔ)被損傷的蛋白質(zhì)的作用。第三十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日（二）熱激蛋白與生物的耐熱性許多研究表明smHSPs的表達(dá)和耐熱性有關(guān)。熱激條件下，大豆中I類smHSPs的含量可達(dá)到總細(xì)胞蛋白的1%以上，并且和耐熱性的獲得一致。用生物工程技術(shù)使擬南芥的熱激轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)I類smHSPs組成型表達(dá)，同時耐熱力提高。熱激時，大豆、酵母、番茄及其它植物形成熱激顆粒(heatshockgranules，HSGs)。熱激下大豆細(xì)胞形成高度有序的結(jié)構(gòu)復(fù)合體，至少由15種15～18kD的I類smHSPs組成。盡管水稻、豌豆、綠豆合成的smHSPs的數(shù)量不同，pI和分子量不一樣，但都形成大小相近的270～第三十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日310kD的復(fù)合體。這種復(fù)合體有高度的熱穩(wěn)定性、不受高鹽濃度和去垢劑的影響，和耐熱性有密切關(guān)系。

HSPs的抗熱性和細(xì)胞內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有關(guān)。大豆、綠豆和水稻細(xì)胞內(nèi)富含smHSPs的組分具有維持蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定的作用，而且不同種類的植物含HSPs組分的這種熱穩(wěn)定作用可以互相替代。從大豆富含HSPs的組分中除去15～18kD的HSPs，則熱穩(wěn)定性喪失，加入純化的280kD的I類smHSPs復(fù)合體，這種保護(hù)作用又恢復(fù)。HSPs是熱激時形成約40nm的大顆粒結(jié)構(gòu)的前體顆粒的組成部分，這些顆粒由5～10%HSP70和50～80%的smHSPs組成。大豆幼苗的HSGs密度約1.20～1.21g/cm3。高溫?zé)峒r第三十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日

形成HSGs顆粒，在非熱激條件下(28℃時)，亞砷酸鹽或氨基酸類似物誘導(dǎo)HSPs合成的同時，也形成I類smHSPs復(fù)合物。當(dāng)熱激恢復(fù)時，細(xì)胞質(zhì)中的HSGs(含有變性或凝聚蛋白，熱激時形成)解聚成280kD的I類smHSPs復(fù)合物，這種凝集與解聚和酵母HSP104的情況相似，使熱失活蛋白從不溶性凝聚體中恢復(fù)活性。含有HSPs的離體線粒體在熱激時可進(jìn)行氧化磷酸化，定位于內(nèi)膜、線粒體的smHSPs有保護(hù)其免受熱傷害的作用。變性/凝聚蛋白周圍常有線粒體，表明凝聚蛋白的解聚可能受線粒體提供的能量調(diào)節(jié)，同時HSP的從新定位也需要能量。值得注意的是離體I類smHSPs的分子伴侶活性不依賴能量。酵母第三十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日HSP90s包括HSP82和HSC82，如兩種基因都突變則是致死的，任意一種發(fā)生突變在高溫時生長受到破壞，表明HSC在熱激時也有保護(hù)作用。酵母HSP104缺失突變體不能形成耐熱性，其實(shí)HSP在耐熱性方面的作用的遺傳學(xué)證據(jù)首先來自酵母HSP104。(三)熱激蛋白在植物種子發(fā)育中的作用

HSPs在種子發(fā)育中的作用日益受到重視。發(fā)育小麥種子中分離的HSC70是BiP同源物。BiP在所有植物中含量豐富，受熱激誘導(dǎo)不明顯，主要受營養(yǎng)(葡萄糖饑餓)調(diào)節(jié)，和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的束縛核糖體合成蛋白質(zhì)有密切關(guān)系，可能參與種子貯藏蛋白的合成。碗豆種子在發(fā)育過程中，第三十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日I類和II類smHSPs受發(fā)育調(diào)控，干種子中也檢測到HSP17.4和HSP17.6，在小麥胚中也發(fā)現(xiàn)有發(fā)育依賴的HSPs，它們可能與種子耐脫水性、胚發(fā)育、休眠、萌發(fā)、耐熱性、壽命形成及維持都有密切關(guān)系。（四）熱激蛋白在植物減數(shù)分裂中的作用和雌性組織不同，成熟花粉沒有熱激反應(yīng)。玉米受精時對熱敏感，高溫時導(dǎo)致減產(chǎn)，部分原因可能是成熟花粉不能合成HSPs。但也有一些研究表明玉米花粉萌發(fā)對高溫敏感存在遺傳差異。Frova等(1989)證明在花粉萌發(fā)過程中，合成HSP的能力是逐漸喪失的，單核花粉粒熱激反應(yīng)最強(qiáng)。Gagliardi等(1995)研究顯示HSP合第三十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日

成能力逐漸喪失是由于沒有HSPsmRNA的積累。所以，玉米花粉的熱敏感性可能是從單核到雙核花粉粒的轉(zhuǎn)變開始，合成HSPs的能力逐漸下降，花粉成熟時完全喪失。從單核到雙核花粉粒的轉(zhuǎn)變是花粉發(fā)育的一個重要階段，其特征是“早期”花粉基因表達(dá)關(guān)閉，“晚期”花粉基因開始表達(dá)(Magnard等，1996)，因此HSP合成能力的變化尤為值得注意。人們在研究眾多植物的HSPs時，發(fā)現(xiàn)雄性不育植株的熱激反應(yīng)更有其特殊的表現(xiàn)。雄性不育株對溫度有劇烈的反應(yīng)，熱激(40℃)可誘導(dǎo)雄性不育態(tài)在當(dāng)代就轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌钥捎龖B(tài)。對其HSPs的電泳分析表明，逐漸升溫到46～49℃第三十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日

溫度區(qū)間，高粱(3197A)雄性不育株幼穗的蛋白質(zhì)電泳圖譜中，出現(xiàn)特異性HSP80，可育的保持系高粱(3197B)沒有。表明此蛋白質(zhì)與雄性不育有關(guān)。高粱不育系花粉母細(xì)胞線粒體中缺少HSP70，當(dāng)溫度升高(40～45℃)后，線粒體中出現(xiàn)了HSP70，線粒體數(shù)目增加了8倍(與可育系相近)，保證了花粉發(fā)育的能量供應(yīng)，不育系由不育變成了可育，這說明高粱不育系線粒體中缺少HSP70很可能是造成雄性不育的原因。熱激處理能使水稻珍汕97A不育系與其珍汕97B保持系花藥Pox和Est的表達(dá)發(fā)生改變，導(dǎo)致不育系和保持系這兩種同工酶組成上的原有差異縮小。蛋白質(zhì)SDS圖譜表明，熱激(30℃)第三十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日

處理的溫敏不育水稻二九青S花藥蛋白質(zhì)組分，比原種二九青少了3條區(qū)帶；安農(nóng)S21水稻比25℃處理者少了1條區(qū)帶。可以認(rèn)為，溫敏雄性核不育水稻二九青S和安農(nóng)S21的花粉敗育，可能與這些HSPs組分不能轉(zhuǎn)譯有關(guān)。熱激(38℃)處理的溫敏雄性核不育水稻培矮64S花藥中的Pox同工酶和Est同工酶比常規(guī)稻湘晚秈二號各增加了1條熱激酶帶，其花藥中可溶性蛋白質(zhì)組分比常規(guī)稻湘晚秈二號少了3條蛋白質(zhì)區(qū)帶。由此看來，植物雄性不育的育性轉(zhuǎn)變現(xiàn)象，以及不育系對熱激的反應(yīng)，可能存在某種特殊的聯(lián)系。其機(jī)理還有待于從發(fā)育生理和分子生物學(xué)方面作更深入的研究。第三十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日（五）熱激蛋白與植物的抗冷性冷脅迫可以誘導(dǎo)植物HSC70mRNA和特異蛋白質(zhì)合成，但也有耐冷性和非耐冷性植物都有HSP70的積累的報道。高溫?zé)峒ず突瘜W(xué)物質(zhì)處理可增強(qiáng)冷敏感植物和組織的耐冷性已有不少報道。HSP和耐冷性具有直接關(guān)系。熱激(40℃，3h)誘導(dǎo)綠豆下胚軸HSP70和HSP79從頭合成，減輕隨后的冷脅迫(2.5℃)對膜的損喪，使溶質(zhì)滲漏減少，增強(qiáng)了組織的抗冷性。在2.5℃下6～9d，熱激誘導(dǎo)的耐冷性消失，同時HSP70和HSP79也降至對照(20℃)水平。如綠熟(maturegreen)的番茄在36、38或40℃的培養(yǎng)箱中放置3d后，在2℃下貯藏21d未發(fā)生冷害，但未經(jīng)熱處理的果實(shí)卻表現(xiàn)出的第四十頁，共八十一頁，2022年，8月28日

嚴(yán)重冷害癥狀。。38℃熱處理3d不但減輕了冷害，并且從低溫放回常溫后果實(shí)仍能正常轉(zhuǎn)紅成熟，而對照果實(shí)冷害嚴(yán)重，不能正常成熟。用39～45℃的熱水處理綠熟番茄1h也能有效減輕冷害。再如油梨在37～38℃下處理17～18h顯著增強(qiáng)了抗冷性。在38℃下處理3、6、12h以及40℃處理0.5h后，可明顯減輕油梨在2℃貯藏期間的冷害；而且具有延遲成熟，延長貯后貨架壽命的效果。還在許多其它采后果蔬上觀察到類似效果，如熱水處理柑橘，熱空氣或熱水處理芒果，熱空氣或熱水處理黃瓜，熱空氣處理甜椒，熱空氣處理柿子等均可有效地減輕冷害的發(fā)生。研究表明，熱激處理對植物第四十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日

組織的影響是多方面的。在生理上，熱處理減少乙烯釋放量，這與熱處理降低1-胺基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)氧化酶基因的表達(dá)水平并抑制ACC合成酶和ACC氧化酶活性有關(guān)。熱處理期間，果實(shí)內(nèi)源乙烯釋放量減少的同時，對外源乙烯的敏感性也降低。這表明高溫使乙烯受體失活，從而阻礙了乙烯的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。熱處理還減少離子滲漏，這與其對膜脂成分的影響有關(guān)。蘋果經(jīng)38℃處理4d再在0℃貯藏4個月后，質(zhì)膜的磷脂含量和脂肪酸不飽和程度高于未經(jīng)熱處理的果實(shí)。此外，熱處理還減慢果實(shí)軟化和果膠可溶化的速度，因為熱處理影響多聚半乳糖第四十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日

醛酸酶(PG酶)和半乳糖苷酶的活性。另外，熱處理還引起膜系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)的變化，包括核仁，線粒體，核糖體，以及細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。熱處理減輕植物冷害的效應(yīng)可能與上述的某些生理反應(yīng)或超微結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。但是，進(jìn)一步的研究表明，這些反應(yīng)和變化與熱激過程中新蛋白的合成有關(guān)。比如，40℃處理可降低離體綠豆下胚軸的溶質(zhì)滲漏，增強(qiáng)其抗冷性；但熱激處理時加入50mmol/L的亞胺環(huán)己酮(cycloheximide，CHX)可抵消熱處理的效應(yīng)。這說明，熱激處理降低膜透性，提高組織抗冷性，與熱激誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成有關(guān)。因此，深入了解HSP及其與抗冷性的關(guān)系，是全面理解植物抗冷機(jī)理的一個重要方面。第四十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日

第八章植物熱激反應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第一節(jié)植物的熱脅迫第二節(jié)植物的熱激蛋白家族第三節(jié)熱激反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)第四十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日第三節(jié)熱激反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)一、熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上游的Ca2+-CaM信號系統(tǒng)二、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的熱激基因表達(dá)第四十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日第三節(jié)熱激反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

熱刺激能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生熱激響應(yīng)。在熱激基因(編碼熱激蛋白的基因，heatshockgene，HSgene)表達(dá)之前許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分已經(jīng)發(fā)生了改變。已有一些直接或間接的證據(jù)表明Ca2+及CaM參與了植物HSR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。真核生物中熱激基因的表達(dá)被熱激轉(zhuǎn)錄因子(heatshocktranscriptionfactor，HSF)所介導(dǎo)。熱脅迫時，HSF被激活并結(jié)合到熱激元件(heatshockelement，HSE)上。本文主要介紹與植物熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(包括基因調(diào)控過程)中上游的Ca2+＿CaM信號系統(tǒng)及下游的熱激基因表達(dá)調(diào)控。第四十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日一、熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上游的Ca2+-CaM信號系統(tǒng)

Ca2+是植物細(xì)胞中被證實(shí)的胞內(nèi)信使之一，Ca2+＿CaM信號系統(tǒng)調(diào)控胞內(nèi)許多生理過程。目前已知許多種脅迫刺激都可引起Ca2+和CaM水平的升高。近些年來，Ca2+-CaM信號系統(tǒng)在熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用也越來越多地受到人們的重視。盡管熱激后完整的上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑目前還不清楚，但已有一些直接或間接的證據(jù)表明Ca2+和CaM可能是熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的主要上游組分。（一）熱激時胞內(nèi)Ca2+、CaM濃度及CaM基因表達(dá)的變化第四十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日

在果蠅、中國倉鼠、HeLa(子宮頸癌組織細(xì)胞株)等細(xì)胞中，熱激誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+濃度升高。隨后，植物方面的研究也證明了這一點(diǎn)。例如熱激時懸浮培養(yǎng)的梨細(xì)胞或原生質(zhì)體對Ca2+的吸收大大增加；用熒光染料方法測定到熱激能使豌豆葉原生質(zhì)體胞質(zhì)Ca2+濃度增加4倍；熱激時胞質(zhì)中Ca2+水平迅速而短暫地升高。用質(zhì)膜鈣通道阻斷劑LaCl3和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道阻斷劑新霉素處理均可明顯抑制熱激后胞質(zhì)Ca2+濃度的升高，表明熱激既動員質(zhì)外體中的鈣向胞質(zhì)中流動又可動員胞內(nèi)鈣庫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣向胞質(zhì)中流動。葉綠體中的Ca2+濃度在熱激時沒有明顯的變化。單一的熱刺激可引起一個不應(yīng)期，在不應(yīng)期內(nèi)，另加一次熱刺激不能引起胞質(zhì)Ca2+水平的升高。第四十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日

然而在這段不應(yīng)期內(nèi)，煙草植株對機(jī)械刺激和冷刺激仍然能夠做出Ca2+濃度升高的響應(yīng)。這種現(xiàn)象可能說明由熱激引起的Ca2+流動是專一的，或者表明不應(yīng)期是由于在熱刺激的感受或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面存在暫時的障礙。熱激在使植物胞質(zhì)Ca2+濃度升高的同時，也使細(xì)胞中CaM濃度升高。例如，對玉米所做的實(shí)驗表明，熱激時CaM水平增加，并且這種增加是依賴Ca2+的。對小麥懸浮細(xì)胞或幼苗以34℃熱激處理可引起CaM的積累，而Ca2+螯合劑EGTA對CaM的積累具有抑制作用。熱激也可誘導(dǎo)TCH基因(編碼CaM同源蛋白)的表達(dá)。我們進(jìn)一步以小麥CaM122基因為探針，通過Northern雜交方法第四十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日

表明，小麥幼苗經(jīng)37℃熱激10min，CaMmRNA的表達(dá)已明顯高于基礎(chǔ)表達(dá)，20min達(dá)到最高值，30min后開始下降，最終回到基礎(chǔ)水平。這一工作進(jìn)一步說明，熱激時CaM活性的增加可能不僅是因為Ca2+

激活CaM，而且還由于促進(jìn)CaM基因的表達(dá)。（二）Ca2+及CaM對熱激基因表達(dá)的影響在動物中，Ca2+能激活HSF與DNA的結(jié)合能力，并可促進(jìn)熱激基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成。植物方面Ca2+對熱激基因表達(dá)影響的報告很少，僅Trofimova等在甜菜上觀察到，CaCl2和鈣載體A23187預(yù)處理可促進(jìn)HSP的合成，而EGTA則抑制HSP的合成，即在蛋白合成水平上表明了Ca2+的影響。在轉(zhuǎn)錄水平上研究，觀察到CaCl2和第五十頁，共八十一頁，2022年，8月28日A23187可促進(jìn)Hsp26及Hsp70的mRNA合成；相反，用EGTA、質(zhì)膜Ca2+通道阻斷劑LaCl3和異博定處理則抑制小麥Hsp26及Hsp70的mRNA合成。此外，以番茄為材料的研究還表明Ca2+可提高HSF與DNA的結(jié)合能力。初步表明，Ca2+可能在HSF激活、熱激基因轉(zhuǎn)錄和HSP合成這三種不同水平上參與植物熱激基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。

Ca2+是否通過CaM進(jìn)一步調(diào)節(jié)熱激基因表達(dá)此前在動植物中均未見報告。本實(shí)驗室用CaM的拮抗劑CPZ、TFP預(yù)處理小麥種子和幼苗后，觀察到34℃熱激時HSP的合成明顯減少；進(jìn)而發(fā)現(xiàn)CPZ和另一種CaM的拮抗劑W7也可降低37℃熱激第五十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日

時hsp26、hsp70基因的轉(zhuǎn)錄水平；CaM還可提高HSF與DNA的結(jié)合能力。小麥幼苗在經(jīng)熱激10min后CaM基因表達(dá)已明顯高于基礎(chǔ)表達(dá)，而熱激20min后hsp26基因才開始有少量表達(dá)，表明熱誘導(dǎo)的CaM基因的轉(zhuǎn)錄先于hsp26基因的轉(zhuǎn)錄；但是如果只熱激5min，然后給予一定的恢復(fù)時間，則hsp26基因也可以表達(dá)，說明hsp26基因轉(zhuǎn)錄其實(shí)并不需要持續(xù)20min的熱刺激，較短時間(5min)的熱刺激即能啟動胞內(nèi)某一關(guān)鍵因子，隨后引起一系列生理生化反應(yīng)(在恢復(fù)時間內(nèi)完成)，到20min時才導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄。以小麥葉鞘表皮為材料，利用鈣離子熒光指示劑fluo23第五十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日AM染色，通過激光共聚焦顯微技術(shù)，觀察到熱激處理過程中胞質(zhì)Ca2+濃度快速升高，1.5min時Ca2+濃度開始上升，4min時已達(dá)到最高值。在22℃下用CaCl2和A23187處理小麥幼芽，看到可增加CaM基因的轉(zhuǎn)錄水平，表明Ca2+不僅可激活CaM，而且還可促進(jìn)CaM基因的表達(dá)。因此我們認(rèn)為Ca2+可能是短暫熱激啟動的胞內(nèi)關(guān)鍵因子，熱激后胞質(zhì)Ca2+濃度升高既激活已有的CaM，也引起CaM基因表達(dá)量的提高，形成更多的CaM，從而激活熱激基因的轉(zhuǎn)錄。（三）CaM與HSP結(jié)合

90年代以來，動物方面不斷有CaM與HSP結(jié)合的報告。Evans等(1990)首先發(fā)現(xiàn)在Ca2+存在時，第五十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日Hsp90、Hsp70、Hsp68、Hsp32、Hsp26等與CaM-瓊脂糖柱結(jié)合，而已結(jié)合的HSP可被含W7的緩沖液洗脫下來，說明CaM能與一些HSP結(jié)合，這些結(jié)合是依賴Ca2+的。Stevenson和Calderwood(1990)證明大鼠細(xì)胞Hsc70能與CaM結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)Hsc70內(nèi)有一段21個氨基酸組成的CaM結(jié)合序列。植物方面，關(guān)于CaM能與HSP結(jié)合的研究至今僅有兩例報告。Lu等(1995)報告，從熱激后懸浮培養(yǎng)的煙草細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫中篩選到一個編碼與CaM結(jié)合的HSP的cDNA，該cDNA編碼分子量為50kD的蛋白，用凝膠覆蓋技術(shù)證明這個蛋白可與35S標(biāo)記的CaM結(jié)合。以玉米為材料的研究表明，熱激蛋白家族中最重要的成員之一，純化的細(xì)胞質(zhì)Hsc70能與CaM第五十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日

結(jié)合，并且玉米Hsc70中也有一個非常保守的21個氨基酸組成的CaM結(jié)合序列(序列同源性達(dá)86%)。這種高度的保守性意味著這一CaM結(jié)合序列可能在完整的Hsc70中具有重要的功能，從而首次在植物中證實(shí)Hsc70是CaM的靶蛋白，為進(jìn)一步研究CaM調(diào)節(jié)熱激基因表達(dá)的方式和途徑提供了重要的線索。（四）Ca2+和CaM在植物耐熱性獲得中的作用在玉米和轉(zhuǎn)基因煙草中以幼苗生活力(TTC法)以及細(xì)胞膜穩(wěn)定性作為耐熱性研究的2個指標(biāo)所做的研究中觀察到，CaCl2

預(yù)處理明顯增加幼苗的耐熱性，而MgCl2處理無此作用。相反，EGTA、LaCl3或異博定處理均妨礙了熱誘導(dǎo)的第五十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日

耐熱性的獲得。W7預(yù)處理玉米幼苗明顯妨礙了熱誘導(dǎo)的耐熱性的獲得。熱激通過誘導(dǎo)熱激蛋白的合成使生物獲得耐熱性，Ca2+-CaM信號系統(tǒng)與熱激誘導(dǎo)的耐熱性獲得的關(guān)系表明Ca2+-CaM信號系統(tǒng)可促進(jìn)熱激蛋白的表達(dá)。總之，多方面的研究表明，Ca2+-CaM介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與熱激反應(yīng)的調(diào)控。IP3/DG、cAMP和pH與熱激反應(yīng)的關(guān)系問題在動物和微生物方面有一些研究，但植物方面還未見報告。Stevenson等(1986)用中國倉鼠實(shí)驗觀察到，45℃熱激可誘導(dǎo)IP3水平迅速而明顯的升高，隨后緊跟著一個持續(xù)時間較長的胞外Ca2+內(nèi)流，同時發(fā)現(xiàn)Ca2+內(nèi)流與膜上磷脂酸(PA)的積累呈正相關(guān)，由此提出了一個熱激引起胞內(nèi)游離Ca2+水平升高的第五十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日一個可能的機(jī)制：熱信號首先刺激膜上的受體改變構(gòu)象，受體與G蛋白結(jié)合并激活G蛋白，后者激活磷脂酶，在磷脂酶作用下，PIP2分解為IP3和DG。IP3刺激胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+

，而DG轉(zhuǎn)化成PA，后者活化膜上的Ca2+通道，使胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)。第五十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日二、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的熱激基因表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)有一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在熱激條件下可激活熱激基因的表達(dá)，被稱為熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)。在熱激基因中，啟動子中有一小段特異的DNA序列，是HSF的結(jié)合位點(diǎn)，稱為熱激元件(HSE)，HSF與HSE結(jié)合激活熱激基因的表達(dá)。熱激基因表達(dá)的調(diào)節(jié)包括選擇性轉(zhuǎn)錄和選擇性翻譯，以前者為主。（一）熱激基因啟動子植物與其它真核生物一樣，熱激專一的mRNA的快速積累主要是由于轉(zhuǎn)錄速度的提高。實(shí)驗表明，熱激基因啟動子中，TATAbox、HSE及其它一些元件，在熱激基因的充分轉(zhuǎn)錄激活中都有不同程度的作用。第五十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日HSE在熱激基因表達(dá)中起重要作用。大多數(shù)真核生物的熱激基因5'端非翻譯區(qū)的幾百個堿基對內(nèi)都存在多個HSE。真核生物HSE共有序列(核心重復(fù)單位)為5'-nGAAn-3'。在植物中，最適的HSE共有序列為5'-aGAAg-3'。HSE是HSF結(jié)合位點(diǎn)，HSF三聚體要能有效結(jié)合到DNA上至少需要2～3個HSE的核心重復(fù)單位，形成5'-nGAAnnTTCnnGAAn-3'。然而，并非總是形成這種標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合位點(diǎn)，天然存在的熱激基因啟動子中，經(jīng)常是中心有2個完整的核心重復(fù)單位，兩側(cè)各與一個不完整的核心重復(fù)單位相鄰，構(gòu)成2個HSF三聚體的結(jié)合位點(diǎn)(如：5'-CTnGAAnnTTCnAG-3')植物中HSE對熱激依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的重要性已經(jīng)通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C實(shí)。第五十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日

在轉(zhuǎn)基因煙草中的大豆Gmhsp17.3-B基因5'端做一系列啟動子缺失處理，發(fā)現(xiàn)-155與-298之間有多個HSE，其中-181至-154這段DNA對誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄起決定性作用。

HSE包括近TATAbox的HSE和遠(yuǎn)上游的HSE。TATAbox上游約20個bp處常存在2個部分重疊的HSE。另外，缺失分析實(shí)驗表明，在近TATAbox域內(nèi)可能存在2個包含HSE的位點(diǎn)(位點(diǎn)1和位點(diǎn)2)。位點(diǎn)1與HSF的結(jié)合能力較強(qiáng)，而位點(diǎn)2與HSF的結(jié)合能力較弱。實(shí)驗表明，在遠(yuǎn)上游的不同位置也可能存在HSE，但遠(yuǎn)上游HSE的作用似乎較小。第六十頁，共八十一頁，2022年，8月28日（二）熱激轉(zhuǎn)錄因子在所有已研究的植物中，都存在多種類型的HSF，如番茄和玉米中存在3種HSF，擬南芥中有4種，大豆中有6種，煙草中有2種。植物HSF的分子量在31.2至57.5kD之間。HSF蛋白質(zhì)家族至少存在3類成員：HSF1、HSF2、HSF3。不同種類的HSF成員可同時在細(xì)胞中存在，經(jīng)免疫反應(yīng)得知，3類HSF免疫原性不同，表明它們在功能上可能存在差異。實(shí)驗表明，不同種類的HSF受到激活的信號不同，但其中的機(jī)制還有待研究。以人類為材料的研究表明，HSF1是脅迫誘導(dǎo)的熱激基因轉(zhuǎn)錄的中介子，它顯示了一種熱激誘導(dǎo)的DNA結(jié)合活性、寡聚化和核定位特性。盡管HSF2對典型的脅迫刺激不起反應(yīng)，但在第六十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日

某個特定的發(fā)育階段，它結(jié)合DNA的能力能夠?qū)Ｒ坏丶せ?，表明HSF2可能在發(fā)育過程中熱激蛋白產(chǎn)生時起調(diào)節(jié)作用。目前發(fā)育過程中熱激蛋白表達(dá)的研究受到人們越來越多的重視HSF3可能代表一種特定細(xì)胞中的HSF1的變異。在番茄中，熱激時3種HSF基因的激活程度不同(0～5倍)，并且具有啟動子專一性，也表明這3種HSF功能上的差異?？傊?，不同種類HSF可能在細(xì)胞不同部位、不同發(fā)育階段行使不同的功能，細(xì)節(jié)有待進(jìn)一步研究。所有已研究的HSF都包含以下幾個重要的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域、寡聚域、核定位信號、C-端的7元重復(fù)域及激活域(圖8-1)。其中DNA結(jié)合域第六十二頁，共八十一頁，2022年，8月28日

和寡聚域的主要結(jié)構(gòu)是保守的，其它區(qū)域只是在親緣關(guān)系相近的HSF中才表現(xiàn)出同源性。

DNA結(jié)合域(DNA-bindingdomain，DBD)是HSF分子中最保守的一個區(qū)域，由大約95個氨基酸組成，位于HSF的N端。該區(qū)域?qū)儆赼+類的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白?？臻g構(gòu)型是由3個a螺旋形成的螺旋2轉(zhuǎn)角2螺旋區(qū)域和一個4條反向平行的折疊片層區(qū)域構(gòu)成的一個致密的球形結(jié)構(gòu)。在第3和第4折疊之間形成了一個柔性的暴露在溶劑中的環(huán)。植物的HSF缺乏這個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。位于C-端的片層第4鏈?zhǔn)怯梢恍┓浅１Ｊ氐陌被釟埢M成，對HSF三聚體中DBD的定向有明顯的作用，并有助于HSF與HSE的高度親和。另外，已知螺旋3在與DNA結(jié)合時起識別作用。第六十三頁，共八十一頁，2022年，8月28日

寡聚域(oligomerizationdomain，OD)是由2個疏水7肽重復(fù)區(qū)域A和B(HR-A/B)組成。它的功能是允許HSF形成同源三聚體構(gòu)型。目前一些學(xué)者認(rèn)為，OD的功能是由3股a-螺旋通過卷曲螺旋型a-螺旋(a-helicalcoiledcoil)結(jié)構(gòu)使HSF形成同源三聚體形式。在HSF的C-端存在另一個疏水7肽重復(fù)(C-terminalheptadrepeats，HR-C)。這個區(qū)域與非熱激條件下HSF三聚化的抑制有關(guān)。HR-C突變可導(dǎo)致一種組成型的HSF三聚化和DNA結(jié)合活性。HR-C在動物HSF中非常保守，而在植物和酵母中不保守。在正常生長條件下，HR-A/B和C之間通過分子內(nèi)的卷曲螺旋型a-螺旋相互作用，抑制HSF三聚體的形成。第六十四頁，共八十一頁，2022年，8月28日HSF攜帶兩簇基本氨基酸序列，后者被認(rèn)為起核定位信號(nuclearlocalizationsignal，NLS)的功能。一簇高度保守的氨基酸位于DBD的C-端(N端NLS)，另一簇位于HR-A/B的C-端(C-端NLS)。在以轉(zhuǎn)基因煙草原生質(zhì)體為材料進(jìn)行的HSF功能研究中發(fā)現(xiàn)，番茄2種HSFN端的NLS與核轉(zhuǎn)位無關(guān)，而C-端NLS對HSF的核轉(zhuǎn)位更為重要。脊椎動物HSF的核轉(zhuǎn)位需要兩端的或只需要N端的NLS。HSF核轉(zhuǎn)位是脅迫調(diào)節(jié)HSF活性的一個環(huán)節(jié)。高等真核生物HSF的激活域(activatordomain，AD)位于HSF分子的C-端。該區(qū)域氨基酸序列不很保守。人類和果蠅HSF的AD顯示了第六十五頁，共八十一頁，2022年，8月28日

有限的序列同一性，并富含酸性氨基酸，疏水性較強(qiáng)。番茄HSF的AD氨基酸序列分析表明，芳香族的、大的疏水性和酸性氨基酸殘基可能在轉(zhuǎn)錄激活中起作用。番茄HSF的缺失分析表明，AD對轉(zhuǎn)錄激活具有重要作用。在3種番茄HSF中存在1至2個拷貝的色氨酸重復(fù)基元(Trpmotif)，認(rèn)為它們起轉(zhuǎn)錄激活子(transcriptionalactivator)基元的作用，定位于一個富含負(fù)電荷的區(qū)域。在大豆GmHSF29和GmHSF34中，存在單一拷貝的Trp基元，而在GmHSF和GmHSF1中不存在Trp基元。大豆HSF中Trp基元的重要性還沒有確定。第六十六頁，共八十一頁，2022年，8月28日（三）熱激基因表達(dá)的調(diào)控?zé)峒せ虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。熱激基因的轉(zhuǎn)錄需要HSF來介導(dǎo)。因此，HSF活性的調(diào)節(jié)是熱激基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的中心機(jī)制。真核生物中，與脅迫時HSP表達(dá)相關(guān)的HSF1編碼基因呈組成型表達(dá)，熱激時激活已存在的HSF1庫。熱激基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)主要包括HSF的三聚化、HSF的核轉(zhuǎn)位、HSF的磷酸化、HSP自身對HSF的反饋調(diào)節(jié)等幾方面。

HSF三聚化是HSF激活的必要條件。HSF有無活性的單體和具有DNA結(jié)合活性的同源三聚體兩種存在形式。熱激以前，HSF處于鈍化的單體狀態(tài)，熱激時，HSF發(fā)生從單體到三體的轉(zhuǎn)變。第六十七頁，共八十一頁，2022年，8月28日HSF的三體形式對HSE有高度的親和性，可結(jié)合到HSE上，激活熱激基因的轉(zhuǎn)錄。然而，熱激后恢復(fù)時，HSF三聚體又發(fā)生解聚，重新回到鈍化的單體狀態(tài)(圖8-1)。第六十八頁，共八十一頁，2022年，8月28日圖8-1熱激因子結(jié)構(gòu)及三聚化（李冰等，2002）

第六十九頁，共八十一頁，2022年，8月28日HSF轉(zhuǎn)位是脅迫激活HSF活性的一個環(huán)節(jié)。用HeLa細(xì)胞所做的研究表明，在無脅迫時，HSF1分散在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，熱脅迫時，HSF1主要分布于細(xì)胞核中。熱激時可觀察到HSF1在30s內(nèi)迅速轉(zhuǎn)移到核中并形成大的不規(guī)則的核顆粒(HSF1脅迫顆粒)，這種顆粒在3min內(nèi)的大小、數(shù)目和熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定。熱激恢復(fù)時，HSF1脅迫顆粒消散，分散于核質(zhì)中。HSF1的這種轉(zhuǎn)位是迅速且可逆的。HSF1脅迫顆粒可能作為一種核單位對HSF1活性起時間調(diào)節(jié)和空間組織作用。植物方面與HeLa細(xì)胞的研究結(jié)果一致，番茄的2種HSF在無脅迫時分散存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，熱激時主要存在于細(xì)胞核中，而熱激后恢復(fù)時相當(dāng)一部分HSF又返回到細(xì)胞質(zhì)中。第七十頁，共八十一頁，2022年，8月28日HSF活性也通過HSF的磷酸化來調(diào)節(jié)。最初的研究表明，HSF磷酸化后就具有活性，這一看法主要是基于酵母和人類HSF電泳遷移率在受到熱激時變化這一事實(shí)提出的，以后又受到32P標(biāo)記實(shí)驗支持。但也有一些實(shí)驗表明，HSF磷酸化后發(fā)生鈍化。HSF的活性調(diào)節(jié)涉及3種蛋白激酶的依次激活，NADK、糖原合成酶激酶及蛋白激酶C，分別促進(jìn)絲氨酸307、303和363位點(diǎn)的磷酸化，從而抑制HSF的活性。

HSF的磷酸化與其活性的關(guān)系可能是非常復(fù)雜的，在未受脅迫細(xì)胞中，HSF在絲氨酸和蘇氨酸殘基處磷酸化，熱激時發(fā)生超磷酸化，而熱激后恢復(fù)時又發(fā)生脫磷酸化。植物HSF的磷酸化第七十一頁，共八十一頁，2022年，8月28日

已經(jīng)在含有重組AtHSF1的擬南芥懸浮細(xì)胞提取液中得到證實(shí)。AtHSF1在絲氨