第六章分子發(fā)光分析課件

(MolecularLuminescenceAnalysis)第6章分子發(fā)光分析法(MolecularLuminescenceAnalys1第6章紅外吸收光譜法6.1熒光分析法6.2磷光分析法6.3化學發(fā)光分析法MolecularFluorescenceAnalysisMolecularphosphorescenceAnalysis第6章紅外吸收光譜法6.1熒光分析法6.22

分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量(電、熱、化學和光能等)被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光。

發(fā)光分析包括熒光、磷光、化學發(fā)光、生物發(fā)光等。物質吸收光能后所產生的光輻射稱之為熒光和磷光。分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量(電、熱、化學和光能3MolecularFluorescenceAnalysis

一、概述

分子熒光分析法是根據(jù)物質的分子熒光光譜進行定性，以熒光強度進行定量的一種分析方法。6.1熒光分法MolecularFluorescenceAnalysi4分子發(fā)光光譜

分子發(fā)光光譜包括熒光光譜、磷光光譜和化學發(fā)光光譜。

熒光和磷光為光致發(fā)光，是物質的基態(tài)分子吸收一定波長范圍的光輻射激發(fā)至單重激發(fā)態(tài)，當其由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時產生的二次輻射。

熒光由單重激發(fā)態(tài)向基態(tài)躍遷產生。

磷光由單重激發(fā)態(tài)先過渡到三重激發(fā)態(tài)，然后由三重激發(fā)態(tài)向基態(tài)躍遷向基態(tài)躍遷產生。

化學發(fā)光是化學反應物或反應產物受反應釋放的化學能激發(fā)而產生的光輻射。分子發(fā)光光譜5當n,L,S三個量子數(shù)確定之后，原子能級就基本確定了。用n、L、S三個量子數(shù)描述原子能級的光譜項（n2S+1L）。L與S相互作用，可產生2S+1個能級稍微不同的分裂，是產生光譜多重線的原因。M=2S+1叫做譜線的多重性。習慣上將多重性為1、2、3的光譜項分別稱為單重態(tài)、雙重態(tài)、三重態(tài)。光譜項與光譜支項當n,L,S三個量子數(shù)確定之后，原子能級就基本確定了。光6熒光分析的特點：靈敏度高：視不同物質，檢測下限在0.10.001g/mL之間。比UV-Vis的靈敏度高得多。

選擇性好：可同時用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。結構信息量多：包括物質激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強、熒光量子效率、熒光壽命等。應用不廣泛：主要是因為能發(fā)熒光的物質不具普遍性、增強熒光的方法有限、外界環(huán)境對熒光量子效率影響大、干擾測量的因素較多。熒光分析的特點：7紫外可見分光光度法的特點(一)靈敏度高

吸光光度法測定物質的濃度下限(最低濃度)一般可達1~10-3%的微量組分。對固體試樣一般可測到10-4~10-5%的痕量組分。如果對被測組分事先加以富集，靈敏度還可以提高1-2個數(shù)量級。紫外可見分光光度法的特點(一)靈敏度高吸光8二、基本原理

(一)分子熒光的產生

處于分子基態(tài)單重態(tài)中的電子對，其自旋方向相反，當其中一個電子被激發(fā)時，通常躍遷至第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)軌道上，也可能躍遷至能級更高的單重態(tài)上。這種躍遷是符合光譜選律的，如果躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)軌道上，則屬于禁阻躍遷。單重態(tài)與三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)具有較低能級。在單重激發(fā)態(tài)中，兩個電子平行自旋，單重態(tài)分子具有抗磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命大約為10-8s;而三重態(tài)分子具有順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4~1s以上(通常用S和T分別表示單重態(tài)和三重態(tài))。二、基本原理9

根據(jù)量子力學的原理，電子的躍遷不能在任意兩個能級之間進行，而必須遵循一定的“選擇定則”，這個定則是①△L=±1，②△S=0，③△J=0，±1，但當J=0時，△J=0的躍遷是不允許的。不符合光譜選擇定則的躍遷叫禁戒躍遷。若兩光譜項之間為禁戒躍遷，處于較高能級的原子具有較長的壽命，原子的這種狀態(tài)稱為亞穩(wěn)態(tài)。光譜選擇定則根據(jù)量子力學的原理，電子的躍遷不能在任意兩個10基態(tài)：電子自旋配對，多重度=2s+1=1，為單重態(tài)，以S0表示。激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對，為單重態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2…表示激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對，為三重態(tài)，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2….表示。三重態(tài)能級低于單重態(tài)(Hund規(guī)則)圖6.1分子內的光物理過程基態(tài)：電子自旋配對，激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能激發(fā)三重態(tài)：分子吸11

處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式再回到基態(tài)。輻射躍遷主要涉及到熒光、延遲熒光或磷光的發(fā)射；無輻射躍遷則是指以熱的形式輻射其多余的能量，包括振動弛豫(VR)、內部轉移(IR)、系間竄躍(IX)及外部轉移(EC)等，各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質本身的結構及激發(fā)時的物理和化學環(huán)境等因素有關。（二）去活化過程(Deactivation)

處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態(tài)。這些過程包括：處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射121)振動弛豫(VibrationalRelaxation，VR)

在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動能層失活至低振動能層的過程，稱為振動弛豫。1)振動弛豫13熒光、磷光能級圖

→振動弛豫S0S1S2T1吸光1吸光2振動弛豫在同一電子能級中，電子由高振動能級轉至低振動能級，而將多余的能量以熱的形式發(fā)出。熒光、磷光能級圖142)內轉化(

InternalConversion，IC)

對于具有相同多重度的分子，若較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動耦合產生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。2)內轉化15S0S1S2T1吸光1吸光2內轉移熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光1吸光2內轉移熒光、磷光能級圖163)熒光發(fā)射

處于第一激發(fā)單重態(tài)(S1)的電子躍遷至基態(tài)各振動能級(S0)時，將得到最大波長為3的熒光。

注意：

基態(tài)中也有振動馳豫躍遷。很明顯，3的波長較激發(fā)波長1或2都長，而且不論電子開始被激發(fā)至什么高能級，最終將只發(fā)射出波長為3的熒光。熒光的產生在10-7-10-9s內完成。3)熒光發(fā)射17熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3熒光熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光184)系間竄躍

指不同多重態(tài)間的無輻射躍遷，例如S1→T1就是一種系間竄躍。通常，發(fā)生系間竄躍時，電子由S1的較低振動能級轉移至T1的較高振動能級處。

有時，通過熱激發(fā)，有可能發(fā)生T1→S1，然后由S1發(fā)生熒光。這是產生延遲熒光的機理。4)系間竄躍19熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3系間竄躍熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光205)外轉換(ExternalConversion，EC)

受激分子與溶劑或其它溶質分子相互作用發(fā)生能量轉換而使熒光或磷光強度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅”或“猝滅”。5)外轉換21第六章分子發(fā)光分析課件22S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2內轉換振動弛豫S2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間竄越內轉換振動弛豫能l2l1l23（三）熒光效率及其影響因素

熒光量子產率(熒光效率或量子效率)，它表示物質發(fā)射熒光的能力，常用下式表示?；?發(fā)射熒光量子數(shù)/吸收熒光量子數(shù)。

在產生熒光的過程中，涉及到許多輻射和無輻射躍遷過程，如熒光發(fā)射、內轉移、系間竄躍和外轉移等。很明顯，熒光的量子產率，將與上述每一個過程的速率常數(shù)有關。（三）熒光效率及其影響因素熒光量子產率(熒24若用數(shù)學式來表達這些關系，得到

=kf

/(kf+ki)

式中:

kf為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，ki為其它有關過程的速率常數(shù)的總和。

凡是能使kf值升高而使其它ki值降低的因素，都可增強熒光。

實際上，對于高熒光分子，例如熒光素，其量子產率在某些情況下接近1，說明ki很小，可以忽略不計。

一般來說，kf主要取決于化學結構，而ki則主要取決于化學環(huán)境，同時也與化學結構有關。磷光的量子產率與此類似。若用數(shù)學式來表達這些關系，得到25

分子產生熒光必須具備兩個條件：

①分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應的結構，才能吸收激發(fā)光；②吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產率。分子產生熒光必須具備兩個條件：26(1)躍遷類型

對于大多數(shù)熒光物質：

首先，經(jīng)歷或n激發(fā)，然后經(jīng)過振動弛豫或其他無輻射躍遷，再發(fā)生或n躍遷而得到熒光。在這兩種躍遷類型中，躍遷常能發(fā)出較強的熒光(較大)。這是由于躍遷具有較大的(一般比n大100-1000倍)。(1)躍遷類型27其次，躍遷的壽命約為10-7~10-9s，比n躍遷的壽命10-5—10-7s要短。在各種躍遷過程的競爭中，它是有利于發(fā)射熒光的。此外，在躍遷過程中，通過系間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較小。(S1T1能級差較大)，這也有利于熒光的發(fā)射。

總之，躍遷是產生熒光的主要躍遷類型。其次，躍遷的壽命約為10-7~10-928(2)共軛效應

容易實現(xiàn)激發(fā)的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少(僅少數(shù)高度共軛體系化合物除外)。此外，增加體系的共軛度，熒光效率一般也將增大。

例如：在多烯結構中，Ph(CH=CH)3Ph和Ph(CH=CH)2Ph在苯中的分別為0.68和0.28。

共軛效應使熒光增強的原因：

主要是由于增大熒光物質的

，有利于產生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的發(fā)生。(2)共軛效應29(3)剛性平面結構

多數(shù)具有剛性平面結構的有機分子具有強烈的熒光。因為這種結構可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。(3)剛性平面結構30(4)取代基效應

芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對該化合物的熒光強度和熒光光譜有很大的影響。給電子基團，如-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等，使熒光增強。因為產生了p-共軛作用，增強了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。吸電子基團，如-COOH、-NO、-CO、鹵素等，會減弱甚至會猝滅熒光。(4)取代基效應芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代31

鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低。這可能是由所謂“重原子效應”使系間竄躍速率增加所致。在重原子中，能級之間的交叉現(xiàn)象比較嚴重，因此容易發(fā)生自旋軌道的相互作用，增加了由單重態(tài)轉化為三重態(tài)的概率。

取代基的空間障礙對熒光也有影響。

立體異構現(xiàn)象對熒光強度有顯著的影響。鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低。這可32四、金屬螯合物的熒光

除過渡元素的順磁性原子會發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無機鹽類金屬離子，在溶液中只能發(fā)生無輻射躍遷，因而不產生熒光。但是，在某些情況下，金屬螯合物卻能產生很強的熒光，并可用于痕量金屬元素分析。四、金屬螯合物的熒光除過渡元素的順磁性原子33(1)螯合物中配位體的發(fā)光

不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結構，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強，平面結構的增大，常會發(fā)生熒光。

如8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強的熒光。(2)螯合物中金屬離子的特征熒光

這類發(fā)光過程通常是螯合物首先通過配位體的躍遷激發(fā)，接著配位體把能量轉給金屬離子，導致dd*躍遷和ff*躍遷，最終發(fā)射的是dd*躍遷和ff*躍遷光譜。(1)螯合物中配位體的發(fā)光34353535例1，2-二苯乙烯反式：平面構型強熒光體順式：非平面構型非熒光體例1，2-二苯乙烯反式：平面構型36不產生熒光產生熒光產生熒光不產生熒光F=0.92萘VAF(萘)=5F(VA)

熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯不產生熒光產生熒光產生熒光不產生熒光F=0.92萘VAF37五、影響熒光強度的因素(環(huán)境因素）①溶劑對熒光強度的影響

溶劑的影響可分為一般溶劑效應和特殊溶劑效應。

一般溶劑效應指的是溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響。特殊溶劑效應指的是熒光體和溶劑分子間的特殊化學作用，如氫鍵的生成和化合作用。五、影響熒光強度的因素(環(huán)境因素）38

一般溶劑效應是普遍的，而特殊溶劑效應則決定于溶劑和熒光體的化學結構。特殊溶劑效應所引起熒光光譜的移動值，往往大于一般溶劑效應所引起的影響。由于溶質分子與溶劑分子間的作用，使同一種熒光物質在不同的溶劑中的熒光光譜可能會有顯著不同。有的情況，增大溶劑的極性，將使n躍遷的能量增大，躍遷的能量減小，而導致熒光增強，熒光峰紅移。一般溶劑效應是普遍的，而特殊溶劑效應則決定于39

但也有相反的情況，例如，苯胺、萘磺酸類化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，隨著醇的極性增大，熒光強度減小，熒光峰藍移。因此熒光光譜的位置和強度與溶劑極性之間的關系，應根據(jù)熒光物質與溶劑的不同而異。

如果溶劑和熒光物質形成了化合物，或溶劑使熒光物質的電力狀態(tài)改變，則熒光峰位和強度都會發(fā)生較大的變化。但也有相反的情況，例如，苯胺、萘磺酸類化合物40②溫度對熒光強度的影響

溫度上升使熒光強度下降。其中一個原因是分子的內部能量轉化作用。當激發(fā)分子接受額外熱能時，有可能使激發(fā)能轉換為基態(tài)的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量。另一個原因是碰撞頻率增加，使外轉換的去活幾率增加。②溫度對熒光強度的影響41③溶液pH值對熒光強度的影響

帶有酸性或堿性官能團的大多數(shù)芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關。

具有酸性或堿性基團的有機物質，在不同pH值時，其結構可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變；對無機熒光物質，因pH值會影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強度發(fā)生改變。

對于金屬離子與有機試劑形成的發(fā)光螯合物，一方面pH會影響合螯物的形成，另一方面還會影響螯合物的組成，從而影響它們的熒光性質。③溶液pH值對熒光強度的影響42④內濾光作用和自吸收現(xiàn)象

溶液中若存在能吸收激發(fā)或熒光物質所發(fā)射光能的物質，就會使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為“內濾光作用”。

內濾光作用的另一種情況是熒光物質的熒光發(fā)射光譜的短波長的一端與該物質的吸收光譜的長波長一端有重疊。

在溶液濃度較大時，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產生“自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強度。④內濾光作用和自吸收現(xiàn)象43

⑤順磁性物質的存在，使激發(fā)單重態(tài)的體系間竄越速率增大，因而會使熒光效率降低。⑤順磁性物質的存在，使激發(fā)單重態(tài)的體系間竄越442、影響熒光強度的環(huán)境因素因素溶劑一般溶劑效應折射率和介電常數(shù)的影響特殊溶劑效應熒光體和溶劑分子間的特殊化學作用如氫鍵的生成同一種熒光物質在不同的溶劑中的熒光光譜不同溫度溫度上升使熒光強度下降內部能量轉化作用增大碰撞頻率增加，使外轉換的幾率增加酸度化合物所處狀態(tài)不同電子構型上有所不同熒光強度和熒光光譜不同2、影響熒光強度的環(huán)境因素因素溶劑一般溶劑效應折射率和介電45464646第六章分子發(fā)光分析課件47（三）熒光強度與熒光物質濃度的關系根據(jù)熒光強度的定義式：=If/Ia

熒光強度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產率(熒光量子效率)。

If=Ia=f（I0-I）Ia：吸收的輻射強度I0：入射光強度熒光池I0IIf熒光強度檢測器If=f（I0-I010-A）=fI0

（1-10-A）I=I010-A將上式展開（三）熒光強度與熒光物質濃度的關系根據(jù)熒光強度的定義式：48

在熒光濃度很稀(A<0.05)時，方括號中除第一項之外的其他項均可忽略，可得：

If=2.3I0A

=2.3I0bc

當入射光強度I0和激發(fā)光一定時，上式為：

If=Kc

即，熒光強度與熒光物質的濃度成正比，但這種線性關系只有在極稀的溶液中，當A0.05時才成立。對于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度和濃度不呈線性關系。熒光定量分析依據(jù)在熒光濃度很稀(A<0.05)時，方括號中49熒光猝滅

熒光物質與溶劑或其它物質之間發(fā)生化學反應，或發(fā)生碰撞后使熒光強度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅。

使熒光強度降低的物質稱為熒光猝滅劑。氧分子及產生重原子效應的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑。碰撞猝滅——是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞，使激發(fā)單重態(tài)的熒光分子以無輻射躍遷的方式躍遷，熒光效率降低。

M+激→M*M*+Q→M+Q+熱自熄滅——熒光物質發(fā)射的熒光被熒光物質的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。熒光猝滅50

任何熒(磷)光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒(磷)光定性分析的基礎。1)激發(fā)光譜

改變激發(fā)波長，測量在最強熒(磷)光發(fā)射波長處的強度變化，以激發(fā)波長對熒光強度作圖可得到熒光激發(fā)光譜。

激發(fā)光譜實質上就是熒光物質的吸收光譜。(四)熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜任何熒(磷)光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與51

激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質；在定量時，用于選擇最適宜的激發(fā)波長。

2)發(fā)射光譜

發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長和強度的激發(fā)波長輻照熒光物質，產生不同波長和強度的熒光，以熒光強度對其波長作圖可得熒光發(fā)射光譜。

由于不同物質具有不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質。

激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質；在定量時，用于選52圖6.2熒光發(fā)射光譜萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜圖6.2熒光發(fā)射光譜萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜53光源氙燈和高壓汞燈激發(fā)單色器光柵掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長液槽I0

IIf發(fā)射單色器掃描發(fā)射光譜消除其它光線的干擾，獲得所需的熒光檢測器顯示器光電倍增管三、熒光分析儀器與分光光度計有兩點不同

①兩個單色器②檢測器與激發(fā)光互成直角光源氙燈和高壓汞燈激發(fā)單色器光柵掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長液541、光源

激發(fā)光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強度；適用波長范圍寬

熒光計中，常使用鹵鎢燈作光源

熒光光度計中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強應用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強的連續(xù)光源1、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測量中552、單色器

熒光計用濾光片作單色器，熒光計只能用于定量分析，不能獲得光譜

大多數(shù)熒光光度計一般采用兩個光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜。

第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長ex，用此激發(fā)光激發(fā)液池內的熒光物質ex。

第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質所發(fā)射的干擾光，用來選擇測定用的熒光波長em。在選定的em下測定熒光強度，定量分析。2、單色器熒光計用濾光片作單色器，熒光計只563、液槽（樣品池）

盛放測定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊。4、檢測器

把光信號轉化成電信號,放大,直接轉成熒光強度。熒光的強度一般較弱，要求檢測器有較高的靈敏度，熒光光度計采用光電倍增管。熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因為熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度可大大提高熒光強度。5、讀出裝置（顯示器）

記錄儀記錄或打印機打印出結果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。3、液槽（樣品池）盛放測定溶液，通常是石英材料的57(一)無機化合物的分析

大多數(shù)無機離子與溶劑之間的相互作用很強，其激發(fā)態(tài)多以非輻射躍遷方式返回基態(tài)，發(fā)熒光者甚少。但很多無機離子可以與一些有機化合物形成有熒光的絡合物，利用這一性質可對其進行熒光測定。

能夠同金屬離子形成熒光絡合物的有機試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物，通常含有兩個或兩個以上的官能團，能與金屬離子形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物。由于螯合物的生成，分子的剛性平面結構增大，使原來不發(fā)熒光或熒光較弱的化合物轉變?yōu)閺姛晒饣衔?。四、熒光分析法的應?一)無機化合物的分析大多數(shù)無機離子與溶劑之間58

另一類絡合物是三元離子締合物。

羅明丹B為陽離子熒光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等陽離子首先與Cl-、Br-等X-形成二元絡陰離子，再與羅明丹B締合成熒光化合物。

署紅為陰離子染料，Ag+與鄰菲咯啉形成二元絡陽離子，再與署紅締合后可使其熒光猝滅，由熒光降低的程度也可對Ag+進行分析。另一類絡合物是三元離子締合物。59(二)有機化合物的分析

脂肪族有機化合物的分子結構較為簡單，本身能發(fā)生熒光的很少，一般需要與某些試劑反應后才能進行熒光分析，如丙三醇與苯胺在濃硫酸介質中反應生成發(fā)射藍色熒光的喹啉，據(jù)此可以測定0.1~2μg?mL?1的丙三醇。

芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光，可直接用熒光法測定。(二)有機化合物的分析脂肪族有機化合物的分子60激發(fā)光譜和熒光光譜熒光強度I波長

(nm)300400500硫酸奎寧的兩個光譜ex,maxfl,max激發(fā)光譜和熒光光譜熒光強度波長(nm)30040050061可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時變化時的熒(磷)光光譜圖可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光62三維熒光光譜IF

∝f(ex、em)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長、掃描激發(fā)波長三維熒光光譜IF∝f(ex、em)蒽的激發(fā)光63IF

∝f(

ex、em)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長、掃描發(fā)射波長IF∝f(ex、em)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長、64蒽的三維等高線光譜圖蒽的三維等高線光譜圖65蒽的三維等熒光強度光譜蒽的三維等熒光強度光譜66一、概述

磷光分析法是以分子磷光光譜來鑒別有機化合物和進行定量分析的一種方法。磷光分析法在藥物分析，臨床分析等領域的應用日益發(fā)展。6.2磷光分析法一、概述6.2磷光分析法67二、基本原理(一)磷光的產生和磷光強度

磷光是處于激發(fā)三重態(tài)的分子躍遷返回基態(tài)時所產生的輻射。1.磷光的特點：磷光波長比熒光的長(T1<S1)；磷光壽命比熒光的長(磷光為禁阻躍遷產生，速率常數(shù)小)；磷光壽命和強度對重原子和氧敏感(自旋軌道耦合，使kISC增加)。二、基本原理(一)磷光的產生和磷光強度682.磷光強度:

IP=2.3PI0bc

式中，

IP：磷光強度，P：磷光效率，

I0：激發(fā)光的強度，b：試樣池的光程，

：磷光物質的摩爾吸收系數(shù)，c：磷光物質的濃度。

在一定的條件下，p、Ip、k、b均為常數(shù)，因此上式可寫成：

Ip=Kc2.磷光強度:69(二)溫度對磷光強度的影響1.隨著溫度降低，分子熱運動速率減慢，磷光逐漸增強。2.低溫磷光(液氮)

由于磷光壽命長，T1的非輻射躍遷(內轉換)幾率增加，碰撞失活(振動弛豫)的幾率、光化學反應幾率都增加，從而降低磷光強度。因此有必要在低溫下測量磷光。同時要求溶劑：

易提純且在分析波長區(qū)無強吸收和發(fā)射；低溫下形成具有足夠粘度的透明的剛性玻璃體。常用的溶劑：

EPA——乙醇+異戊烷+二乙醚(2+2+5)IEPA——CH3I+EPA(1+10)。(二)溫度對磷光強度的影響70(三)重原子效應

使用含有重原子的溶劑(碘乙烷、溴乙烷)或在磷光物質中引入重原子取代基，都可以提高磷光物質的磷光強度，這種效應稱為重原子效應。前者稱為外部重原子效應，后者稱為內部重原子效應。

機理：重原子的高核電荷使得磷光分子的電子能級交錯，容易引起或增強磷光分子的自旋軌道偶合作用，從而使S1→T1的體系間竄躍概率增大，有利于增大磷光效率。(三)重原子效應71(四)室溫磷光

低溫磷光需低溫實驗裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發(fā)展了室溫磷光(RTP)。1)固體基質：在室溫下以固體基質(如纖維素等)吸附磷光體，可增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。2)膠束增穩(wěn)：利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內轉換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。

利用膠束增穩(wěn)、重原子效應和溶液除氧是該法的三要素。(四)室溫磷光72三、磷光儀器

在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。如右圖所示。斬光片的作用是利用其分子受激所產生的熒光與磷光的壽命不同獲取磷光輻射。轉筒式轉盤式圖6.7磷光分析儀器示意圖盛放液氮測定低溫磷光在熒光分光光度計上配上磷光配件后，即可用于磷光測定。三、磷光儀器轉筒式轉盤式圖6.7磷光分析儀器示意圖盛放液氮73磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室

試樣需在液氮溫度（77K，-196℃）下測定低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶內）固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡

有些物質既可產生熒光，又能產生磷光。用機械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長消除熒光干擾。磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下74關于磷光分析儀注意：

在熒光分光光度計上配上磷光配件后，即可用于磷光測定。1.液槽：將樣品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶內，即可用于低溫磷光測定。2.斬波片：分別測熒光和磷光；測出不同壽命的磷光。關于磷光分析儀注意：75四、應用

磷光分析主要用于測定有機化合物，如石油產品、多環(huán)芳烴、農藥、藥物等方面。

四、應用

磷光分析主要用于測定有機化合物，76（1）相同點：

1.都是電子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)時放出的輻射，波長一般都不同于入射光的波長。

2.溫度均低于白灼光，一般在800K以下，故稱為化學冷光。熒光與磷光的異同點（1）相同點：熒光與磷光的異同點77

（2）不同點：1.躍遷時重度不同熒光：S1→S0重度未變。

磷光：T1→S0重度改變。2.輻射強度不同熒光：強度較大，因從S0→S1是自旋允許的，處于S1，S2態(tài)電子多，因而熒光亦強。

磷光：很弱，因為S0→T1是自旋禁阻的，處于T1態(tài)電子少。3.壽命不同熒光：10-9~10-6s，壽命短。

磷光：10-4~10-2s，壽命稍長。（2）不同點：78一、概述

某些物質在進行化學反應時，由于吸收了反應時產生的化學能，而使反應產物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便發(fā)出一定波長的光。這種吸收化學能使分子發(fā)光的過程稱為化學發(fā)光。利用化學發(fā)光反應而建立起來的分析方法稱為化學發(fā)光分析法?；瘜W發(fā)光也發(fā)生于生命體系，這種發(fā)光稱為生物發(fā)光。6.2化學發(fā)光分析法一、概述6.2化學發(fā)光分析法7980

生物發(fā)光是化學發(fā)光中的一類，特指在生物體內通過化學反應產生的發(fā)光現(xiàn)象，主要由酶來催化產生的。

多種細菌、昆蟲、魚類等均能發(fā)光80生物發(fā)光是化學發(fā)光中的一類，特指在生物體80化學發(fā)光分析具有以下突出特點

靈敏度高——例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學發(fā)光反應，可測定低至2×10-17mol·L-1ATP

線性范圍寬——一般有5~6個數(shù)量級

儀器設備簡單，成本低廉分析速度快，易實現(xiàn)自動化局限性：可供發(fā)光用的試劑有限發(fā)光機理有待進一步研究化學發(fā)光分析具有以下突出特點靈敏度高——例：81二、化學發(fā)光分析的基本原理

化學發(fā)光是吸收化學反應過程產生的化學能，而使反應產物分子激發(fā)所發(fā)射的光。（一）化學發(fā)光反應的條件

任何一個化學發(fā)光反應都應包括化學激發(fā)和發(fā)光兩個步驟：

化學發(fā)光基于化學反應提供足夠的能量

A+B→C*+D

產物接受反應能被激發(fā)C*→C+hv二、化學發(fā)光分析的基本原理化學發(fā)光是吸收化學82能夠產生化學發(fā)光必須滿足如下條件：（1）能夠快速地釋放出足夠的能量

在可見光區(qū)觀察化學發(fā)光，需170~300kJ·mol-1激發(fā)能。具有過氧化物中間產物的氧化還原反應可滿足要求?；瘜W反應多是在有O3、H2O2等參加的高能反應中。（2）反應途徑有利于激發(fā)態(tài)產物的形成（3）處于激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)，或能夠將其能量轉移給可以產生輻射躍遷的其他分子。能夠產生化學發(fā)光必須滿足如下條件：83(二)化學發(fā)光效率和發(fā)光強度

化學發(fā)光反應效率CL，又稱化學發(fā)光的總量子產率。它等于生成激發(fā)態(tài)產物分子的化學激發(fā)效率r和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率f。r

取決于發(fā)光所依據(jù)的化學反應本身f

與熒光效率的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結構和性質，也受環(huán)境的影響。激發(fā)態(tài)分子的化學效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率(二)化學發(fā)光效率和發(fā)光強度r取決于發(fā)光所依據(jù)的化學反應84

具有高效率的化學發(fā)光是生物體中。亦稱生物發(fā)光。如：螢火蟲發(fā)光反應的效率幾乎接近100%。非生物體的化學發(fā)光效率一般不超過1%

化學發(fā)光強度ICL(t)與反應速度、化學發(fā)光效率有如下關系對下列化學發(fā)光反應

A+B→C*+D

C+hICL隨時間和反應物消耗的變化逐漸減小。具有高效率的化學發(fā)光是生物體中。亦稱生物發(fā)85A+B→C*+D

A：待測物質，C：發(fā)光物質

當反應物B的濃度遠遠過量于待測物濃度時，B的濃度可認為是常數(shù)。因此，發(fā)光反應可視為一級反應。t時刻的發(fā)光強度與該時刻的分析物濃度成正比。化學發(fā)光總強度與分析物濃度呈線性關系。常用發(fā)光總強度來定量分析。發(fā)光總強度A+B→C*+DA：待測物質，C：86（三）化學發(fā)光反應類型1.液相化學發(fā)光——研究和應用較廣的有魯米諾（Luminol）、光澤精、沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。魯米諾是最常用的發(fā)光試劑，它可以測定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，產生化學發(fā)光反應時量子效率為0.01~0.05。（三）化學發(fā)光反應類型1.液相化學發(fā)光87氧化劑425nm反應產生的化學能被產物氨基鄰苯二甲酸根吸收，處于激發(fā)狀態(tài)，返回基態(tài)時發(fā)射熒光，可檢測低至10-9mol·L-1的H2O2。氧化劑425nm反應產生的化學能被產物氨基882.氣相化學發(fā)光——廣泛應用于大氣污染監(jiān)測、可監(jiān)測空氣中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。

在氣相中O3能氧化NO、乙烯等產生化學發(fā)光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等產生化學發(fā)光，例如：

NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+h

（≥600nm）

CO+O→CO2*CO2*→CO2+h

（=300~500nm）

常溫下產生化學發(fā)光，靈敏度可達1ng·mL-1測定范圍0.01~10000g·mL-1。2.氣相化學發(fā)光——廣泛應用于大氣污染監(jiān)測、可監(jiān)測空氣中的O89三、化學發(fā)光分析的儀器（自學）

化學發(fā)光分析法的測量儀器主要包括樣品室、光檢測器、放大器和信號輸出裝置?；瘜W發(fā)光反應在樣品室中進行，樣品和試劑混合的方式有不連續(xù)取樣體系，加樣是間歇的。將試劑先加到光電倍增管前面的反應池內，然后用進樣器加入分析物。另一種方法是連續(xù)流動體系，反應試劑和分析物是定時在樣品池中匯合反應，且在載流推動下向前移動，被檢測的光信號只是整個發(fā)光動力學曲線的一部分，而以峰高進行定量測量。三、化學發(fā)光分析的儀器（自學）90(一)分立取樣式儀器(一)分立取樣式儀器91(二)流動注射式儀器(二)流動注射式儀器92四、化學發(fā)光的應用1、可以用化學發(fā)光分析測定的物質化學發(fā)光分析測定的物質可以分為三類:A、化學發(fā)光反應中的反應物;B、化學發(fā)光反應中的催化劑、增敏劑或抑制劑C、偶合反應中的反應物、催化劑、增敏劑等。

這三類物質還可以通過標記方式用來測定人們感興趣的其他物質，進一步擴大了化學發(fā)光分析的應用范圍。2、可測定的對象：

無機物、有機物、生物物質等四、化學發(fā)光的應用93A、廣泛應用于大氣中O3、NO、NO2、H2O、SO2、CO等組分的檢測。B、魯米諾—H2O2體系3、目前應用的領域A、廣泛應用于大氣中O3、NO、NO2、H2O、SO2、CO94熒光與化學發(fā)光的異同點（1）相同點：

1.都是電子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)時放出的輻射，波長一般都不同于入射光的波長。

2.溫度均低于白灼光，一般在800K以下，故稱為化學冷光。（2）不同點：

獲得能量的途徑不同，熒光是靠吸收紫外-可見光，化學發(fā)光是吸收化學能。熒光與化學發(fā)光的異同點（1）相同點：

1.都是電子從95本章作業(yè)1、2、3、5、7本章作業(yè)1、2、3、5、796(MolecularLuminescenceAnalysis)第6章分子發(fā)光分析法(MolecularLuminescenceAnalys97第6章紅外吸收光譜法6.1熒光分析法6.2磷光分析法6.3化學發(fā)光分析法MolecularFluorescenceAnalysisMolecularphosphorescenceAnalysis第6章紅外吸收光譜法6.1熒光分析法6.298

分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量(電、熱、化學和光能等)被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為發(fā)光。

發(fā)光分析包括熒光、磷光、化學發(fā)光、生物發(fā)光等。物質吸收光能后所產生的光輻射稱之為熒光和磷光。分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量(電、熱、化學和光能99MolecularFluorescenceAnalysis

一、概述

分子熒光分析法是根據(jù)物質的分子熒光光譜進行定性，以熒光強度進行定量的一種分析方法。6.1熒光分法MolecularFluorescenceAnalysi100分子發(fā)光光譜

分子發(fā)光光譜包括熒光光譜、磷光光譜和化學發(fā)光光譜。

熒光和磷光為光致發(fā)光，是物質的基態(tài)分子吸收一定波長范圍的光輻射激發(fā)至單重激發(fā)態(tài)，當其由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時產生的二次輻射。

熒光由單重激發(fā)態(tài)向基態(tài)躍遷產生。

磷光由單重激發(fā)態(tài)先過渡到三重激發(fā)態(tài)，然后由三重激發(fā)態(tài)向基態(tài)躍遷向基態(tài)躍遷產生。

化學發(fā)光是化學反應物或反應產物受反應釋放的化學能激發(fā)而產生的光輻射。分子發(fā)光光譜101當n,L,S三個量子數(shù)確定之后，原子能級就基本確定了。用n、L、S三個量子數(shù)描述原子能級的光譜項（n2S+1L）。L與S相互作用，可產生2S+1個能級稍微不同的分裂，是產生光譜多重線的原因。M=2S+1叫做譜線的多重性。習慣上將多重性為1、2、3的光譜項分別稱為單重態(tài)、雙重態(tài)、三重態(tài)。光譜項與光譜支項當n,L,S三個量子數(shù)確定之后，原子能級就基本確定了。光102熒光分析的特點：靈敏度高：視不同物質，檢測下限在0.10.001g/mL之間。比UV-Vis的靈敏度高得多。

選擇性好：可同時用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。結構信息量多：包括物質激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強、熒光量子效率、熒光壽命等。應用不廣泛：主要是因為能發(fā)熒光的物質不具普遍性、增強熒光的方法有限、外界環(huán)境對熒光量子效率影響大、干擾測量的因素較多。熒光分析的特點：103紫外可見分光光度法的特點(一)靈敏度高

吸光光度法測定物質的濃度下限(最低濃度)一般可達1~10-3%的微量組分。對固體試樣一般可測到10-4~10-5%的痕量組分。如果對被測組分事先加以富集，靈敏度還可以提高1-2個數(shù)量級。紫外可見分光光度法的特點(一)靈敏度高吸光104二、基本原理

(一)分子熒光的產生

處于分子基態(tài)單重態(tài)中的電子對，其自旋方向相反，當其中一個電子被激發(fā)時，通常躍遷至第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)軌道上，也可能躍遷至能級更高的單重態(tài)上。這種躍遷是符合光譜選律的，如果躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)軌道上，則屬于禁阻躍遷。單重態(tài)與三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)具有較低能級。在單重激發(fā)態(tài)中，兩個電子平行自旋，單重態(tài)分子具有抗磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命大約為10-8s;而三重態(tài)分子具有順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4~1s以上(通常用S和T分別表示單重態(tài)和三重態(tài))。二、基本原理105

根據(jù)量子力學的原理，電子的躍遷不能在任意兩個能級之間進行，而必須遵循一定的“選擇定則”，這個定則是①△L=±1，②△S=0，③△J=0，±1，但當J=0時，△J=0的躍遷是不允許的。不符合光譜選擇定則的躍遷叫禁戒躍遷。若兩光譜項之間為禁戒躍遷，處于較高能級的原子具有較長的壽命，原子的這種狀態(tài)稱為亞穩(wěn)態(tài)。光譜選擇定則根據(jù)量子力學的原理，電子的躍遷不能在任意兩個106基態(tài)：電子自旋配對，多重度=2s+1=1，為單重態(tài)，以S0表示。激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對，為單重態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2…表示激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對，為三重態(tài)，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2….表示。三重態(tài)能級低于單重態(tài)(Hund規(guī)則)圖6.1分子內的光物理過程基態(tài)：電子自旋配對，激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能激發(fā)三重態(tài)：分子吸107

處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式再回到基態(tài)。輻射躍遷主要涉及到熒光、延遲熒光或磷光的發(fā)射；無輻射躍遷則是指以熱的形式輻射其多余的能量，包括振動弛豫(VR)、內部轉移(IR)、系間竄躍(IX)及外部轉移(EC)等，各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質本身的結構及激發(fā)時的物理和化學環(huán)境等因素有關。（二）去活化過程(Deactivation)

處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態(tài)。這些過程包括：處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射1081)振動弛豫(VibrationalRelaxation，VR)

在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動能層失活至低振動能層的過程，稱為振動弛豫。1)振動弛豫109熒光、磷光能級圖

→振動弛豫S0S1S2T1吸光1吸光2振動弛豫在同一電子能級中，電子由高振動能級轉至低振動能級，而將多余的能量以熱的形式發(fā)出。熒光、磷光能級圖1102)內轉化(

InternalConversion，IC)

對于具有相同多重度的分子，若較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動耦合產生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。2)內轉化111S0S1S2T1吸光1吸光2內轉移熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光1吸光2內轉移熒光、磷光能級圖1123)熒光發(fā)射

處于第一激發(fā)單重態(tài)(S1)的電子躍遷至基態(tài)各振動能級(S0)時，將得到最大波長為3的熒光。

注意：

基態(tài)中也有振動馳豫躍遷。很明顯，3的波長較激發(fā)波長1或2都長，而且不論電子開始被激發(fā)至什么高能級，最終將只發(fā)射出波長為3的熒光。熒光的產生在10-7-10-9s內完成。3)熒光發(fā)射113熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3熒光熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光1144)系間竄躍

指不同多重態(tài)間的無輻射躍遷，例如S1→T1就是一種系間竄躍。通常，發(fā)生系間竄躍時，電子由S1的較低振動能級轉移至T1的較高振動能級處。

有時，通過熱激發(fā)，有可能發(fā)生T1→S1，然后由S1發(fā)生熒光。這是產生延遲熒光的機理。4)系間竄躍115熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3系間竄躍熒光、磷光能級圖S0S1S2T1吸光1165)外轉換(ExternalConversion，EC)

受激分子與溶劑或其它溶質分子相互作用發(fā)生能量轉換而使熒光或磷光強度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅”或“猝滅”。5)外轉換117第六章分子發(fā)光分析課件118S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2內轉換振動弛豫S2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間竄越內轉換振動弛豫能l2l1l119（三）熒光效率及其影響因素

熒光量子產率(熒光效率或量子效率)，它表示物質發(fā)射熒光的能力，常用下式表示?；?發(fā)射熒光量子數(shù)/吸收熒光量子數(shù)。

在產生熒光的過程中，涉及到許多輻射和無輻射躍遷過程，如熒光發(fā)射、內轉移、系間竄躍和外轉移等。很明顯，熒光的量子產率，將與上述每一個過程的速率常數(shù)有關。（三）熒光效率及其影響因素熒光量子產率(熒120若用數(shù)學式來表達這些關系，得到

=kf

/(kf+ki)

式中:

kf為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，ki為其它有關過程的速率常數(shù)的總和。

凡是能使kf值升高而使其它ki值降低的因素，都可增強熒光。

實際上，對于高熒光分子，例如熒光素，其量子產率在某些情況下接近1，說明ki很小，可以忽略不計。

一般來說，kf主要取決于化學結構，而ki則主要取決于化學環(huán)境，同時也與化學結構有關。磷光的量子產率與此類似。若用數(shù)學式來表達這些關系，得到121

分子產生熒光必須具備兩個條件：

①分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應的結構，才能吸收激發(fā)光；②吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產率。分子產生熒光必須具備兩個條件：122(1)躍遷類型

對于大多數(shù)熒光物質：

首先，經(jīng)歷或n激發(fā)，然后經(jīng)過振動弛豫或其他無輻射躍遷，再發(fā)生或n躍遷而得到熒光。在這兩種躍遷類型中，躍遷常能發(fā)出較強的熒光(較大)。這是由于躍遷具有較大的(一般比n大100-1000倍)。(1)躍遷類型123其次，躍遷的壽命約為10-7~10-9s，比n躍遷的壽命10-5—10-7s要短。在各種躍遷過程的競爭中，它是有利于發(fā)射熒光的。此外，在躍遷過程中，通過系間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較小。(S1T1能級差較大)，這也有利于熒光的發(fā)射。

總之，躍遷是產生熒光的主要躍遷類型。其次，躍遷的壽命約為10-7~10-9124(2)共軛效應

容易實現(xiàn)激發(fā)的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少(僅少數(shù)高度共軛體系化合物除外)。此外，增加體系的共軛度，熒光效率一般也將增大。

例如：在多烯結構中，Ph(CH=CH)3Ph和Ph(CH=CH)2Ph在苯中的分別為0.68和0.28。

共軛效應使熒光增強的原因：

主要是由于增大熒光物質的

，有利于產生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的發(fā)生。(2)共軛效應125(3)剛性平面結構

多數(shù)具有剛性平面結構的有機分子具有強烈的熒光。因為這種結構可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。(3)剛性平面結構126(4)取代基效應

芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對該化合物的熒光強度和熒光光譜有很大的影響。給電子基團，如-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等，使熒光增強。因為產生了p-共軛作用，增強了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。吸電子基團，如-COOH、-NO、-CO、鹵素等，會減弱甚至會猝滅熒光。(4)取代基效應芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代127

鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低。這可能是由所謂“重原子效應”使系間竄躍速率增加所致。在重原子中，能級之間的交叉現(xiàn)象比較嚴重，因此容易發(fā)生自旋軌道的相互作用，增加了由單重態(tài)轉化為三重態(tài)的概率。

取代基的空間障礙對熒光也有影響。

立體異構現(xiàn)象對熒光強度有顯著的影響。鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低。這可128四、金屬螯合物的熒光

除過渡元素的順磁性原子會發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無機鹽類金屬離子，在溶液中只能發(fā)生無輻射躍遷，因而不產生熒光。但是，在某些情況下，金屬螯合物卻能產生很強的熒光，并可用于痕量金屬元素分析。四、金屬螯合物的熒光除過渡元素的順磁性原子129(1)螯合物中配位體的發(fā)光

不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結構，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強，平面結構的增大，常會發(fā)生熒光。

如8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強的熒光。(2)螯合物中金屬離子的特征熒光

這類發(fā)光過程通常是螯合物首先通過配位體的躍遷激發(fā)，接著配位體把能量轉給金屬離子，導致dd*躍遷和ff*躍遷，最終發(fā)射的是dd*躍遷和ff*躍遷光譜。(1)螯合物中配位體的發(fā)1，2-二苯乙烯反式：平面構型強熒光體順式：非平面構型非熒光體例1，2-二苯乙烯反式：平面構型132不產生熒光產生熒光產生熒光不產生熒光F=0.92萘VAF(萘)=5F(VA)

熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯不產生熒光產生熒光產生熒光不產生熒光F=0.92萘VAF133五、影響熒光強度的因素(環(huán)境因素）①溶劑對熒光強度的影響

溶劑的影響可分為一般溶劑效應和特殊溶劑效應。

一般溶劑效應指的是溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響。特殊溶劑效應指的是熒光體和溶劑分子間的特殊化學作用，如氫鍵的生成和化合作用。五、影響熒光強度的因素(環(huán)境因素）134

一般溶劑效應是普遍的，而特殊溶劑效應則決定于溶劑和熒光體的化學結構。特殊溶劑效應所引起熒光光譜的移動值，往往大于一般溶劑效應所引起的影響。由于溶質分子與溶劑分子間的作用，使同一種熒光物質在不同的溶劑中的熒光光譜可能會有顯著不同。有的情況，增大溶劑的極性，將使n躍遷的能量增大，躍遷的能量減小，而導致熒光增強，熒光峰紅移。一般溶劑效應是普遍的，而特殊溶劑效應則決定于135

但也有相反的情況，例如，苯胺、萘磺酸類化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，隨著醇的極性增大，熒光強度減小，熒光峰藍移。因此熒光光譜的位置和強度與溶劑極性之間的關系，應根據(jù)熒光物質與溶劑的不同而異。

如果溶劑和熒光物質形成了化合物，或溶劑使熒光物質的電力狀態(tài)改變，則熒光峰位和強度都會發(fā)生較大的變化。但也有相反的情況，例如，苯胺、萘磺酸類化合物136②溫度對熒光強度的影響

溫度上升使熒光強度下降。其中一個原因是分子的內部能量轉化作用。當激發(fā)分子接受額外熱能時，有可能使激發(fā)能轉換為基態(tài)的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量。另一個原因是碰撞頻率增加，使外轉換的去活幾率增加。②溫度對熒光強度的影響137③溶液pH值對熒光強度的影響

帶有酸性或堿性官能團的大多數(shù)芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關。

具有酸性或堿性基團的有機物質，在不同pH值時，其結構可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變；對無機熒光物質，因pH值會影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強度發(fā)生改變。

對于金屬離子與有機試劑形成的發(fā)光螯合物，一方面pH會影響合螯物的形成，另一方面還會影響螯合物的組成，從而影響它們的熒光性質。③溶液pH值對熒光強度的影響138④內濾光作用和自吸收現(xiàn)象

溶液中若存在能吸收激發(fā)或熒光物質所發(fā)射光能的物質，就會使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為“內濾光作用”。

內濾光作用的另一種情況是熒光物質的熒光發(fā)射光譜的短波長的一端與該物質的吸收光譜的長波長一端有重疊。

在溶液濃度較大時，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產生“自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強度。④內濾光作用和自吸收現(xiàn)象139

⑤順磁性物質的存在，使激發(fā)單重態(tài)的體系間竄越速率增大，因而會使熒光效率降低。⑤順磁性物質的存在，使激發(fā)單重態(tài)的體系間竄越1402、影響熒光強度的環(huán)境因素因素溶劑一般溶劑效應折射率和介電常數(shù)的影響特殊溶劑效應熒光體和溶劑分子間的特殊化學作用如氫鍵的生成同一種熒光物質在不同的溶劑中的熒光光譜不同溫度溫度上升使熒光強度下降內部能量轉化作用增大碰撞頻率增加，使外轉換的幾率增加酸度化合物所處狀態(tài)不同電子構型上有所不同熒光強度和熒光光譜不同2、影響熒光強度的環(huán)境因素因素溶劑一般溶劑效應折射率和介六章分子發(fā)光分析課件143（三）熒光強度與熒光物質濃度的關系根據(jù)熒光強度的定義式：=If/Ia

熒光強度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產率(熒光量子效率)。

If=Ia=f（I0-I）Ia：吸收的輻射強度I0：入射光強度熒光池I0IIf熒光強度檢測器If=f（I0-I010-A）=fI0

（1-10-A）I=I010-A將上式展開（三）熒光強度與熒光物質濃度的關系根據(jù)熒光強度的定義式：144

在熒光濃度很稀(A<0.05)時，方括號中除第一項之外的其他項均可忽略，可得：

If=2.3I0A

=2.3I0bc

當入射光強度I0和激發(fā)光一定時，上式為：

If=Kc

即，熒光強度與熒光物質的濃度成正比，但這種線性關系只有在極稀的溶液中，當A0.05時才成立。對于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度和濃度不呈線性關系。熒光定量分析依據(jù)在熒光濃度很稀(A<0.05)時，方括號中145熒光猝滅

熒光物質與溶劑或其它物質之間發(fā)生化學反應，或發(fā)生碰撞后使熒光強度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅。

使熒光強度降低的物質稱為熒光猝滅劑。氧分子及產生重原子效應的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑。碰撞猝滅——是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞，使激發(fā)單重態(tài)的熒光分子以無輻射躍遷的方式躍遷，熒光效率降低。

M+激→M*M*+Q→M+Q+熱自熄滅——熒光物質發(fā)射的熒光被熒光物質的基態(tài)分子所吸收，即自吸收現(xiàn)象。熒光猝滅146

任何熒(磷)光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒(磷)光定性分析的基礎。1)激發(fā)光譜

改變激發(fā)波長，測量在最強熒(磷)光發(fā)射波長處的強度變化，以激發(fā)波長對熒光強度作圖可得到熒光激發(fā)光譜。

激發(fā)光譜實質上就是熒光物質的吸收光譜。(四)熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜任何熒(磷)光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與147

激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質；在定量時，用于選擇最適宜的激發(fā)波長。

2)發(fā)射光譜

發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長和強度的激發(fā)波長輻照熒光物質，產生不同波長和強度的熒光，以熒光強度對其波長作圖可得熒光發(fā)射光譜。

由于不同物質具有不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質。

激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質；在定量時，用于選148圖6.2熒光發(fā)射光譜萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜圖6.2熒光發(fā)射光譜萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜149光源氙燈和高壓汞燈激發(fā)單色器光柵掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長液槽I0

IIf發(fā)射單色器掃描發(fā)射光譜消除其它光線的干擾，獲得所需的熒光檢測器顯示器光電倍增管三、熒光分析儀器與分光光度計有兩點不同

①兩個單色器②檢測器與激發(fā)光互成直角光源氙燈和高壓汞燈激發(fā)單色器光柵掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長液1501、光源

激發(fā)光源一般要求比吸收測量中的光源有更大的發(fā)射強度；適用波長范圍寬

熒光計中，常使用鹵鎢燈作光源

熒光光度計中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強應用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強的連續(xù)光源1、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測量中1512、單色器

熒光計用濾光片作單色器，熒光計只能用于定量分析，不能獲得光譜

大多數(shù)熒光光度計一般采用兩個光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜。

第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長ex，用此激發(fā)光激發(fā)液池內的熒光物質ex