組織切片制作

組織切片技術1概述制片方法的種類：非切片法、切片法制片方法的一般步驟：切片法（1）殺死、取材與固定（2）洗滌（3）脫水（4）透明（5）透入（6）包埋（7）切片（8）貼片（9）染色（10）封藏非切片法（1）整體封藏法（2）涂片法（3）磨片法（4）分離法（浸漬分離法、撕碎法）（5）壓碎法2石蠟切片技術

石蠟切片法是將組織經(jīng)過一系列藥品處理，使石蠟滲入組織，包埋成蠟塊，再把組織蠟塊切成極薄的片子，根據(jù)不同的需要用不同的染色方法以顯示不同細胞和組織的形態(tài)，以及細胞和組織中某些化學或特殊（如抗原）成份含量的變化。

3一、取材取材應注意事項：切取組織應根據(jù)需要觀察的部位進行選擇。

所取組織應包括臟器或組織的重要結構或全層，同時考慮好切面方向。病理組織除切取病變部位外，還要切取病變和正常組織交界區(qū)域，以利觀察分析。切取的組織必須新鮮。

取材后立即投入固定液中，否則組織會收縮變形，發(fā)生自溶現(xiàn)象。43切取組織，刀要鋒利，動作要輕，不可來回切割，也不要擠壓或牽拉組織，以免組織變形或內部細胞結構受損傷而發(fā)生變化。4切取的組織塊必須小而薄。

組織塊的大小一般為0.5×0.5×0.2cm、1×1×0.3cm或1.5×1.5×0.3~0.5cm，最厚不能超過0.5cm。另：柔嫩組織、被膜厚而堅實的器官、小動物的器官及組織5采取消化道組織時應保持清潔。

56防止材料因固定劑的作用而發(fā)生變形。

如：柔嫩、薄的材料，有空氣的組織7、組織塊附加標記的方法

采取的不同組織塊，必須根據(jù)切片的要求和需要分瓶放入進行固定，加標簽以示區(qū)別，并注明固定液、名稱、來源、日期等等。6二、固定固定就是將采取的新鮮組織，放入固定液內，借助化學藥品的作用使細胞內的蛋白質、脂肪、糖、酶等各種成份沉淀保存下來。同時，使組織硬化不變形，有利于固定以后的處理。7固定時間應根據(jù)組織的種類、性質、大小，固定液的種類、性質、滲透力的強弱而定。

如：一般組織，以10％福爾馬林固定24h左右，波音(Bouin)氏固定液12至24h，卡諾氏(Carnoy)固定液1h內。適當?shù)卦黾訙囟瓤煽s短固定時間。固定液的用量

應充足，一般為組織塊體積的10倍左右。

83常用固定液

（1）單純固定液福爾馬林固定液：甲醛10ml蒸餾水90ml優(yōu)點：透滲能力強，固定均勻，組織收縮小。缺點：但經(jīng)乙醇脫水后收縮較大。

9酒精固定液：無水乙醇（純酒精）85ml（或95ml）蒸餾水15ml（或5ml）除此之外，還有重鉻酸鉀、苦味酸、升汞、醋酸、丙酮等單純固定液。

優(yōu)點：有固定兼脫水作用，固定后可直接放入85％－95％酒精中脫水。對糖原、纖維蛋白和彈性纖維等固定效果好。

缺點：但固定速度較慢，易使組織變脆。一般先用85％酒精固定數(shù)小時再放入95％酒精繼續(xù)固定。10（２）混合固定液波音(Bouin)氏固定液：飽和苦味酸水溶液75ml甲醛75ml冰醋酸5ml滲透迅速，固定均勻，組織收縮小，切片著色良好。

卡諾氏(Carnoy)固定液：無水乙醇60ml三氯甲烷（氯仿）30ml冰醋酸10ml固定速度快，可固定細胞漿和細胞核，尤其適宜染色體的固定.

11中性福爾馬林固定液甲醛100ml蒸餾水900ml磷酸二氫鈉4g磷酸氫二鈉6.5g滲透性好，組織收縮小，固定效果好。

此外，還有辛克(Zenker)氏液、酒精福爾馬林液(A·F·)等混合固定液。12三、洗滌（或水洗）

目的：組織在固定后要把滲入里面的固定液洗去，否則留在組織中的固定液有的會妨礙染色，有的會產(chǎn)生沉淀或結晶。

原則：1、固定液為酒精或酒精混合液，一般不沖洗。2、固定液為甲醛水溶液或以水配制的可用流水沖洗。

3、沖洗的時間與組織的種類，組織塊大小和固定時間長短有關。一般10-24h。方法：流水緩慢沖洗。小組織可不沖洗，多次換水浸泡即可。

13四脫水

組織經(jīng)固定和水洗后含多量水分，水與透明劑、石蠟不能溶合，因此，在透明、浸蠟前必須進行脫水，把組織中的水份徹底驅除。常用脫水劑：酒精注意事項：1、一般從70％酒精開始，由低濃度酒精到高濃度酒精逐步遞增。如果固定液為酒精溶液，則應從與固定液中相同濃度的酒精開始脫水。2、對一些柔軟組織低等無脊椎動物組織需增加酒精級數(shù)，縮小濃度差異，應從70％酒精以下50％或30％開始脫水，否則收縮較大。3、脫水的時間根據(jù)組織的種類、體積大小和厚度而定，一般與組織的大小成正比。4、脫水必須在有蓋瓶子內進行。14酒精濃度脫水時間45~50℃恒溫箱中脫水時間70％2~4h30~40min80%2~4h30~40min90%或95%2~4h1h無水乙醇I2h1h無水乙醇II2h1h一般組織酒精脫水的濃度及時間如下：

15五、透明

為使石蠟能浸入組織塊，組織脫水后，必須經(jīng)過一種既能與酒精相混合，又能溶解石蠟的溶劑，通過這種溶劑的媒介作用，而達到石蠟浸入組織塊的目的。

常用透明劑：二甲苯注意事項：1、組織不能在二甲苯透明過久，在時間上應加以控制。

2、組織在入二甲苯透明前最好先放入純酒精與二甲苯等量混合液中半小時至1小時處理。3、二甲苯透明，一般15至30分鐘，其間需更換一次二甲苯。4、對著光線觀察組織呈半透明或透明狀態(tài)即可。

16六浸蠟

組織透明后，放入熔化的石蠟內浸漬，使石蠟滲入組織同時取代組織內的二甲苯，這個過程稱浸蠟。注意事項：1、夏季：采用熔點高的石蠟（56－60℃）；冬季，應用熔點略低一點的石蠟（52－54℃）。一般常用石蠟熔點為52－60℃。2、浸蠟前可在石蠟二甲苯等量混合液內處理半小時至1小時。3、浸蠟溫度（恒溫箱溫度）：比石蠟的熔點高2℃。4、浸蠟時間：3至5小時，其間更換一次石蠟。17七、包埋包埋器蠟塊步驟：將熔化好的石蠟倒入包埋框，用加溫的鑷子將組織塊切面朝下放入，將準備好的標簽放在待凝固的石蠟面上，冷卻。完全凝固后，修整蠟塊。

包埋溫度：與浸蠟的溫度接近或高2℃左右。

18、切片和附貼組織經(jīng)石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機切成薄片的過程稱切片。切片前的準備（1）切片前必須了解切片機的基本結構和性能。裝刀架、刀片。檢驗刀片是否鋒利。（2）載玻片、蓋玻片的處理：洗液浸泡24小時后用自來水充分洗滌，95％酒精中浸泡，再用軟綢布或紗布擦干待用。

（3）為了使切出的薄片能粘貼在載玻片上，可用蛋清與甘油（1:1）混合物均勻抹在載玻片上，再使切片附貼在玻片上。（4）另外，準備水浴鍋、蓬松的中號毛筆，眼科鑷，水槽等物。

192切片制作過程（1）冷凍組織蠟塊，固定刀架、刀片和蠟塊。（2）切片：切片厚度：5μm；轉速：40至50次/分鐘。

（3）展片（4）撈片、燙片（45o）、撈片

（5）切片過程中，固定好蠟塊、刀片，注意刀與蠟塊的角度（5o）。出現(xiàn)蠟片上卷、裂隙、刀痕等立即移動刀片或切片刀，換至刀刃鋒利處。毛筆必須由下向上拔動，燙片時水溫不宜過高等等。載玻片20、烤片

40℃需烤1天或1晝夜；60℃烤0.5至1小時，放在酒精燈上烤片（必須來回晃動），或70℃左右的溫度烤片，只需3至5分鐘即可。

21十、染色

蘇木精（素）－伊紅染色方法

具體步驟：（1）二甲苯I（10min）（2）二甲苯II（5min）（3）無水乙醇（1min）（4）95％酒精（1min）（5）85％酒精（1min）（6）75％酒精（1min）（7）自來水洗（2min）（8）蘇木精染液（5－10min）（9）自來水洗（1－5min）22（10）1％鹽酸酒精（3－15s）（11）自來水洗（0.5h以上）（或自來水洗1min，0.5％左右的稀氨水返藍1min，再水洗1min）（12）伊紅染液（0.5－1min）（13）自來水洗（0.5－1min）（14）85％酒精（1min）（15）95％酒精（1min）（16）無水乙醇I（2min）（17）無水乙醇II（2min）（18）二甲苯I（2－3min）（19）二甲苯II（2－3min）232蘇木精（素）－伊紅染色液的配制

（1）Harris蘇木素染液的配制：蘇木色精1g硫酸鋁鉀20g無水乙醇10ml蒸餾水200ml氧化汞0.5g（2）