分枝桿菌分離培養(yǎng)及質(zhì)量控制課件

結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)柳正衛(wèi)結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)柳正衛(wèi)1結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌2結(jié)核分枝桿菌-結(jié)核病的病原體1882年koch發(fā)現(xiàn)了結(jié)核桿菌，1896年將結(jié)核桿菌正式命名為結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌-結(jié)核病的病原體3分枝桿菌書屬于裂植菌綱，效線菌目，分枝桿菌科，分枝桿菌屬。以《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》分類法為國際間廣泛公認(rèn)和采用，《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》確認(rèn)的分枝桿菌有100多個(gè)種，根據(jù)生長速度將分枝桿菌屬分為快速生長分枝桿菌和緩慢生長分枝桿菌。其中結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、田鼠分枝桿菌等26種為緩慢生長為分枝桿菌。7天以上肉眼可見單個(gè)菌落，稱為緩慢生長分枝桿菌，其代表菌種是結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis).7天以內(nèi)肉眼可見單個(gè)菌落，成為快速生長分枝桿菌。分枝桿菌分類分枝桿菌書屬于裂植菌綱，效線菌目，分枝桿菌科，分枝桿菌屬。分4分枝桿菌種類

類別Rubyun分群

對人致病的分枝桿菌緩

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群

人型、牛型、非洲型慢

非結(jié)核分枝桿菌Ⅰ群堪薩斯、海、猿生

非結(jié)核分枝桿菌Ⅱ群瘰癘長

非結(jié)核分枝桿菌Ⅲ群鳥-胞內(nèi)、蟾快速生長非結(jié)核分枝桿菌Ⅳ群偶發(fā)、龜分枝桿菌種類5分枝桿菌屬主要特點(diǎn)是一類直或微彎曲、有分枝生長趨勢的桿菌。細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高，主要為分枝菌酸。具有抗酸性，革蘭染色不易著色，常用抗酸染色。專性需氧營養(yǎng)要求特殊，大多數(shù)生長緩慢。不產(chǎn)內(nèi)、外毒素和侵襲性酶等致病物質(zhì)，所致疾病呈慢性。分枝桿菌屬主要特點(diǎn)是一類直或微彎曲、有分枝生長趨勢的桿菌。6分枝桿菌種類分枝桿菌屬，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌）及麻風(fēng)分枝桿菌外，余者統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌（NontuberculosisMycobacteria,NTM）結(jié)核分枝桿菌是引起人類結(jié)核病的主要病原菌，此外，牛分枝桿菌除引起牛結(jié)核病外，少數(shù)人類結(jié)核病也由其引起。非洲分枝桿菌致病力較弱，是熱帶非洲人結(jié)核病病原體。田鼠分枝桿菌對人類無致病性。分枝桿菌種類分枝桿菌屬，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（結(jié)核分枝桿菌、7分枝桿菌屬種類結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌田鼠分枝桿菌非典型分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌光產(chǎn)色分枝桿菌暗產(chǎn)色分枝桿菌不產(chǎn)色分枝桿菌迅速生長分枝桿菌分枝桿菌屬分枝桿菌屬種類結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌非典型分枝桿菌麻8形態(tài)直或銷彎曲、兩端鈍圓的桿菌，菌體長1-4um，寬0.3-0.6um，無芽胞，無莢膜，無鞭毛，經(jīng)抗酸染色后菌體呈紅色桿狀，單個(gè)散在或呈“人、V、T、Y”形排列。結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)核質(zhì)。結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性形態(tài)結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性91.專性需氧菌(<50%O2);8%CO2可促進(jìn)基礎(chǔ)生長2.營養(yǎng)要求:-C源:甘油,有機(jī)酸(丙酮酸鹽,檸檬酸,棕櫚酸鹽),葡萄糖-N源:天(門)冬酰胺,谷氨酸,等-雞蛋或血清蛋白:保護(hù)MTB拮抗毒素(油酸,毒素但在血清蛋白存在的情況下可促進(jìn)結(jié)核菌的生長)3.環(huán)境：-生長最適溫度為35-37℃-最適PH為6.8-7.2結(jié)核分枝桿菌的生長和營養(yǎng)71.專性需氧菌(<50%O2);8%CO2可促進(jìn)基10生長現(xiàn)象：生長緩慢在培養(yǎng)基上繁殖一代約需15-20小時(shí)，一般需2-4周或更長時(shí)間始見菌落生長，有極少數(shù)生長極為緩慢者需8周以上才開始有菌落生長。改良羅氏培養(yǎng)基菌落特征：菌落粗糙、凸起、致密，有表面皺折，呈顆粒、結(jié)節(jié)或菜花樣，乳白色或米色，無可溶性色素,不透明。液體培養(yǎng)基：形成菌膜，有毒株呈索狀生長結(jié)核發(fā)枝桿菌的生長特征生長現(xiàn)象：結(jié)核發(fā)枝桿菌的生長特征11結(jié)核分枝桿菌菌落結(jié)核分枝桿菌菌落12結(jié)核分枝桿菌革蘭染色陽性，但不易著色。經(jīng)苯胺染料染色著色后，能抵抗酸和酸乙醇脫色，稱為抗酸性。經(jīng)抗酸染色后，結(jié)核分枝桿菌呈紅色，而標(biāo)本中其他細(xì)菌、細(xì)胞、雜質(zhì)等均呈藍(lán)色。結(jié)核分枝桿菌的染色特性結(jié)核分枝桿菌革蘭染色陽性，但不易著色。結(jié)核分枝桿菌的染色特性13結(jié)核分枝桿菌因細(xì)胞壁含大量類脂質(zhì)，具有疏水性，對物理和化學(xué)因素抵抗力均較強(qiáng)。在室溫和陰暗處干燥痰可存活6-8個(gè)月，在空氣中可保持傳染性8-10天，在-6-8度能存活4-5年，濕熱對結(jié)核分枝桿菌殺傷力強(qiáng)，煮沸與高壓蒸氣消毒是殺滅最有效的方法之一。結(jié)核分枝桿菌對光線和射線敏感，因此紫外線照射常用于空氣和物體表面消毒。結(jié)核分枝桿菌的抵抗力

結(jié)核分枝桿菌因細(xì)胞壁含大量類脂質(zhì)，具有疏水性，對物理和化學(xué)因14耐藥性是結(jié)核桿菌的重要生物學(xué)特性耐藥菌不斷生長繁殖，終致菌群中以耐藥菌為主（敏感菌被藥物淘汰），抗結(jié)核藥物即失效。由基因突變而出現(xiàn)的極少量天然耐藥菌（自然變異），通常不致引起嚴(yán)重后果。藥物與結(jié)核桿菌接觸后，有的細(xì)菌發(fā)生誘導(dǎo)變異，逐漸能適應(yīng)在含藥環(huán)境中繼續(xù)生存（繼發(fā)耐藥）。耐異煙肼菌株的致病力顯著減弱，耐鏈霉素菌株的致病力一般不降低，耐利福平菌株有不同程度降低，對利福平及異煙肼同時(shí)耐藥，其致病力降低較單一耐異煙肼者更顯著。耐藥性是結(jié)核桿菌的重要生物學(xué)特性耐藥菌不斷生長繁殖，終致菌群15結(jié)核分枝桿菌－－生化反應(yīng)生化反應(yīng)不活潑，不發(fā)酵糖類與非結(jié)核分枝桿菌鑒別：

耐熱觸酶試驗(yàn)－；（非結(jié)核分枝桿菌＋）與牛分枝桿菌鑒別煙酸試驗(yàn)＋；（牛分枝桿菌－）結(jié)核分枝桿菌－－生化反應(yīng)生化反應(yīng)不活潑，不發(fā)酵糖類16結(jié)核分枝桿菌－－抵抗力與變異性抵抗力特點(diǎn)：“三耐四敏”耐干燥、耐酸堿、耐孔雀綠（1：13000）對濕熱、70％乙醇、紫外線、常用抗結(jié)核藥物（但長期使用易產(chǎn)生耐藥性）變異性典型形態(tài)－→多形性R型菌落－→S型菌落有毒－→無毒（用于制備疫苗）抗結(jié)核藥敏感－→耐藥結(jié)核分枝桿菌－－抵抗力與變異性抵抗力特點(diǎn)：“三耐四敏”17結(jié)核分枝桿菌－－致病物質(zhì)脂質(zhì)索狀因子:與該菌毒力有密切關(guān)系磷脂:分枝菌酸：與抗酸性有關(guān)蠟質(zhì)D:具有佐劑作用硫酸腦苷脂蛋白質(zhì)糖類結(jié)核桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，不產(chǎn)生侵襲性酶結(jié)核分枝桿菌－－致病物質(zhì)脂質(zhì)18結(jié)核分枝桿菌－－所致疾病與免疫性經(jīng)多途徑感染，引起結(jié)核病，以肺結(jié)核多見類型：原發(fā)感染和繼發(fā)感染免疫性抗結(jié)核免疫以細(xì)胞免疫為主抗結(jié)核免疫屬帶菌免疫抗結(jié)核免疫與Ⅳ型超敏反應(yīng)同時(shí)出現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌－－所致疾病與免疫性經(jīng)多途徑感染，引起結(jié)核病，以19結(jié)核分枝桿菌鑒定程序結(jié)核分枝桿菌鑒定程序20結(jié)核分枝桿菌－－檢驗(yàn)程序標(biāo)本核酸檢測接種固體培養(yǎng)基可疑菌落涂片抗酸染色鏡檢抗體檢測慢性生長菌快速生長菌菌種鑒定標(biāo)本前處理接種液體培養(yǎng)基接種小白鼠豚鼠臟器涂片鏡檢抗酸染色鑒定試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌－－檢驗(yàn)程序標(biāo)本核酸接種固體培養(yǎng)基可疑菌落涂片抗21分枝桿菌菌種鑒定的意義非結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率在不同的國家、不同的地區(qū)報(bào)告差別很大。據(jù)資料報(bào)道，日本在1980年報(bào)告：在分枝桿菌感染中，非結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率為12%，并有逐年上升趨勢，其中主要為鳥胞內(nèi)復(fù)合群，高達(dá)89.6%，其次為堪薩斯占8.0%我國年對非結(jié)核分枝桿菌的研究資料尚不充足，也缺乏較大規(guī)模的流調(diào)，據(jù)報(bào)告非結(jié)核分枝桿菌在我國的發(fā)病率占分枝桿菌的4.3%左右。分枝桿菌菌種鑒定的意義非結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率在不同的國家、不22分枝桿菌菌種鑒定的意義一般來說，非結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物的敏感性低于結(jié)核菌，但各型和各菌株之間對藥物的敏感性差別甚大。分枝桿菌菌種鑒定的意義一般來說，非結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物的23分枝桿菌菌種鑒定形態(tài)學(xué)菌落形態(tài)、顏色生長條件28℃生長試驗(yàn)，結(jié)核分枝桿菌在28℃的孵育環(huán)境中不能生長；而TNM菌群的大部分分枝桿菌可以生長。生化反應(yīng)硝酸還原

、煙酸試驗(yàn)酶尿素酶耐熱觸酶

分子生物學(xué)方法

分枝桿菌菌種鑒定形態(tài)學(xué)菌落形態(tài)、顏色24分枝桿菌菌種鑒定分枝桿菌菌群鑒定的目的既是鑒定菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群還是非結(jié)核分枝桿菌，也是進(jìn)一步菌種鑒定的基礎(chǔ)。分枝桿菌臨床分離株藥物敏感性試驗(yàn)應(yīng)與菌種初步鑒定同步進(jìn)行，以對硝基苯甲酸（PNB）、噻吩-2-羧酸肼（TCH）鑒別培養(yǎng)基初步鑒別結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌鑒別培養(yǎng)基的制備過程略。分枝桿菌菌種鑒定分枝桿菌菌群鑒定的目的既是鑒定菌株屬于結(jié)核分25分枝桿菌菌種初步鑒定分枝桿菌PNBTCH28℃生長耐熱觸酶硝酸還原煙酸試驗(yàn)牛分枝桿菌——————結(jié)核分枝桿菌—+————NTM++++++分枝桿菌菌種初步鑒定分枝桿菌PNBTCH28℃生長耐熱26分枝桿菌菌種鑒定質(zhì)量控制要求經(jīng)過初步鑒定的分枝桿菌，需進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定，可送上一級實(shí)驗(yàn)室。鑒別菌株應(yīng)生長旺盛，生長時(shí)間為3~4周為宜。所有培養(yǎng)基、試劑應(yīng)在規(guī)定期限內(nèi)使用。所有試劑均應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌株對照試驗(yàn)合格后使用。分枝桿菌菌種鑒定質(zhì)量控制要求經(jīng)過初步鑒定的分枝桿菌，需進(jìn)一步27非典型分枝桿菌是指結(jié)核分枝桿菌與麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。大多為環(huán)境中的腐生菌對酸堿比較敏感對常用抗結(jié)核藥耐受為條件致病菌，艾滋病患者易感染鳥復(fù)合分枝桿菌非典型分枝桿菌是指結(jié)核分枝桿菌與麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。28MTB鑒定流程Mycobact.tuberculosis其他分枝菌

M.tuberculos培養(yǎng)特征(1)10天后出現(xiàn)較硬菌落(2)抗酸菌(3)索狀構(gòu)成初培養(yǎng)物生長的好生長的差yes敏感抵抗+煙酸+NO3

試驗(yàn)68℃耐熱觸酶試驗(yàn)PNB敏感性試驗(yàn)noMTBNTMMTB鑒定流程Mycobact.其他M.t29結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)操作結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)操作30結(jié)核分枝桿菌－－分離培養(yǎng)標(biāo)本前處理：目的：殺死雜菌；液化標(biāo)本方法：4％NaOH法；4％H2SO4法；胰酶-新潔爾滅法等培養(yǎng)基選擇：羅氏培養(yǎng)基、米氏培養(yǎng)基、小川培養(yǎng)基等接種培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌－－分離培養(yǎng)標(biāo)本前處理：31去污染處理(痰標(biāo)本)視標(biāo)本性狀，加1~2倍體積4%氫氧化鈉（NaOH)消化液于痰瓶中，擰緊螺旋蓋，渦旋震蕩器上震蕩1min，使痰液充分勻化，室溫放置。自加入氫氧化鈉消化液起，整個(gè)處理時(shí)間應(yīng)在15~20min。標(biāo)本較多時(shí)，應(yīng)分批處理去污染處理(痰標(biāo)本)視標(biāo)本性狀，加1~2倍體積4%氫氧化鈉（32

病理組織或干酪塊標(biāo)本切碎后置于無菌組織研磨器，加入適量（0.5~1ml）生理鹽水后充分研磨成混懸液；混懸液經(jīng)3000r/min離心30min后，沉淀物進(jìn)行堿處理[與2~4倍量2%氫氧化鈉（NaOH)混合，處理15min]后接種。尿液留全量夜尿，靜置4~5h,取沉淀部分約10ml,3000r/min離心30min,取沉淀進(jìn)行堿處理[與等倍量4%硫酸（H2SO4）混合,處理15min]后接種.去污染處理(其他標(biāo)本)

病理組織或干酪塊標(biāo)本切碎后置于無菌組織研磨器，加入適量（33去污染處理(其他標(biāo)本)膿液采用4%硫酸（H2SO4）以1︰3混勻后，靜置25min（期間震蕩數(shù)次)，按無菌手續(xù)接種0.1ml經(jīng)處理的標(biāo)本至L-J培養(yǎng)基，每份標(biāo)本接種2支培養(yǎng)基。酸處理去污染時(shí)間不超過25min。胸腹水,支氣管灌洗液標(biāo)本參照痰標(biāo)本處理辦法.去污染處理(其他標(biāo)本)膿液采用4%硫酸（H2SO4）以134去污染處理(其他標(biāo)本)腦脊液無菌操作收集的腦脊液,置冰箱或室溫24h,待薄膜形成后將薄膜接種到L-J培養(yǎng)基;或?qū)⒛X脊液在無菌操作環(huán)境中3000r/min離心30min,取沉淀直接接種到L-J培養(yǎng)基.非無菌操作采集的腦脊液標(biāo)本,離心后的沉淀進(jìn)行堿處理[與等倍量4%氫氧化鈉（NaOH)混合,處理10~15min]后接種于酸性L-J培養(yǎng)基去污染處理(其他標(biāo)本)35去污染處理（其他標(biāo)本）糞便標(biāo)本與生理鹽水混合后,充分振蕩使之成為混懸液;定性濾紙過濾后,濾液經(jīng)3000r/min離心10min;沉淀進(jìn)行酸處理[與2~4倍量的4%硫酸（H2SO4）]混合,處理15~20min)后接種L-J培養(yǎng)基.咽喉棉拭子將棉拭子放入一無菌試管,加入適量生理鹽水浸泡,加入等體積4%氫氧化鈉（NaOH)后強(qiáng)烈振蕩,靜置15min后接種.去污染處理（其他標(biāo)本）糞便標(biāo)本與生理鹽水混合后,充分振蕩使36不同溫度下儲存痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌生存活力的改變908190n=36n=41n=41No.ofsputatestedKimSJ,etal,1986ParamasivanCN,etal,1983703142125~30℃2825℃4℃不同溫度下儲存痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌生存活力的改變90819037痰標(biāo)本的收集和運(yùn)輸容器：帶螺旋蓋的McCartney玻璃或塑料瓶收集：至少兩份標(biāo)本（兩份即時(shí)痰或1份即時(shí)痰和1分家中采集的痰）運(yùn)輸：使用CPCorCPB;使用泡沫盒加冰袋標(biāo)本加酒精或其它殺菌劑/標(biāo)本滅菌后在

CTL用分子學(xué)做鑒定和藥敏痰標(biāo)本的收集和運(yùn)輸容器：帶螺旋蓋的McCartney玻璃或塑38含有CPC痰標(biāo)本的去污處理

TB在0.5%CPC中的存活新鮮痰標(biāo)本用等體積

1%CPC或0.6%CPB混合<10℃≥20℃含有CPC痰標(biāo)本的去污處理

TB在039酸性改良羅氏培養(yǎng)基成分和制備方法略。酸性改良羅氏培養(yǎng)基成分和制備方法略。40痰培養(yǎng)方法簡單培養(yǎng)：適合于大部分實(shí)驗(yàn)室/臨床檢驗(yàn)濃縮培養(yǎng)：在有離心機(jī)、相應(yīng)材料和熟練技術(shù)人員的條件下適用痰培養(yǎng)方法簡單培養(yǎng)：適合于大部分實(shí)驗(yàn)室/臨床檢驗(yàn)41簡單法培養(yǎng)過程SputumAdd4%NaOH勻化痰去污處理(15min)如沒有中和，接種到酸性培養(yǎng)基36±1C孵育9周

MTBgrowth鋪開/水平位置孵育/24-48小時(shí)后擰緊瓶蓋or簡單法培養(yǎng)過程SputumAdd4%勻化痰去污處理如沒有中42濃縮法涂片/培養(yǎng)SputumAdd4%NaOH勻化/去污處理37C孵育9周MTBgrowth1.用盡可能多的無菌水/PB稀釋2.3,000xg離心2次以上3.用接種環(huán)或吸管轉(zhuǎn)移沉淀SwingbucketrotorBucket&tubesWindshieldedswingbucketrotor固定角度的轉(zhuǎn)頭濃縮法涂片/培養(yǎng)SputumAdd4%勻化/去污處理37C43離心力對痰涂片和培養(yǎng)結(jié)果的影響離心力（xg）涂片陽性（+）培養(yǎng)陽性（+）涂片陽性/培養(yǎng)陽性比率12601.87.10.2530004.511.20.4038009.611.60.83離心力對痰涂片和培養(yǎng)結(jié)果的影響離心力涂片陽性（+）培養(yǎng)陽性（44結(jié)果報(bào)告1.接種后第3、7天各觀察1次菌落生長情況。發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經(jīng)抗酸染色證實(shí)后，可報(bào)告快速生長分枝桿菌陽性。此后每周觀察1次，記錄菌落生長及污染情況。陽性生長物經(jīng)抗酸染色證實(shí)后，可報(bào)告分枝桿菌生長。滿8周后未見菌落生長者方可報(bào)告培養(yǎng)陰性結(jié)果。結(jié)果報(bào)告1.接種后第3、7天各觀察1次菌落生長情況。發(fā)現(xiàn)菌落45結(jié)果報(bào)告2.觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌生長時(shí)，應(yīng)報(bào)告污染。培養(yǎng)污染率應(yīng)控制在2%~5%范圍。污染率過高，提示培養(yǎng)基滅菌不佳，標(biāo)本前處理、接種等環(huán)節(jié)有誤，應(yīng)當(dāng)分析原因，采取相應(yīng)措施。結(jié)果報(bào)告2.觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌生長時(shí)，應(yīng)報(bào)告污染。培養(yǎng)46結(jié)果報(bào)告(1)分枝桿菌培養(yǎng)陰性:斜面無菌落生長,以“培養(yǎng)陰性”報(bào)告,不可以“–”表示.(2)分枝桿菌培養(yǎng)陽性（１＋）：菌落生長占斜面面積的1/4．(3)分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2＋）：菌落生長占斜面面積的1/2．(4)分枝桿菌培養(yǎng)陽性（3＋）：菌落生長占斜面面積的3/4．(5)分枝桿菌培養(yǎng)陽性（4＋）：菌落生長布滿整個(gè)斜面(6)報(bào)實(shí)際菌落數(shù):菌落生長不足斜面面積1/4．結(jié)果報(bào)告47分離培養(yǎng)的操作流程

痰標(biāo)本中、加1~2倍體積4%NaOH渦旋振蕩1~2min室溫靜置15min分別接種0.1ml前處理液至2支培養(yǎng)基斜面置37℃溫箱培養(yǎng)接種后3天,7天觀察,此后每周觀察一次有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認(rèn),至第8周無菌落生長報(bào)告陰性分離培養(yǎng)的操作流程痰標(biāo)本中、加渦旋振蕩室溫靜置48AFB復(fù)紅染色AFB熒光染色L-J培養(yǎng)基上生長的克隆細(xì)菌聚集融合(索狀)形態(tài)學(xué)特征1

0.2~0.3x2~5?-抗酸/乙醇脫色的桿菌染色特性-靜止不動(dòng);-無芽孢;2孵育10天后出現(xiàn)象牙色、干燥、較硬、表面粗糙的克隆3

細(xì)菌聚集融合

/形成索狀A(yù)FB復(fù)紅染色AFB熒光染色L-J培養(yǎng)基上生長細(xì)菌聚集融合49分枝桿菌分離培養(yǎng)注意事項(xiàng)分枝桿菌分離培養(yǎng)注意事項(xiàng)50培養(yǎng)注意事項(xiàng)標(biāo)本的選擇：選擇痰標(biāo)本中膿性、血樣、干酪樣的部分；新發(fā)病人應(yīng)在抗結(jié)核藥物治療前留取痰標(biāo)本。治療中的病人應(yīng)停藥2—3天后留取痰標(biāo)本。標(biāo)本的保存：如需送上級實(shí)驗(yàn)室檢查，應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)痰瓶中，加入與標(biāo)本等體積的防腐液[0.6％溴化十六烷基吡啶(CPB)的2％氯化鈉(NaCl)液]，密封保存。此標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送交上級實(shí)驗(yàn)室。防腐處理后，痰標(biāo)本可在室溫下短期存放。但仍以4℃保存為宜，存放時(shí)間不應(yīng)超過2周。時(shí)間控制：從加入消化液（NaOH）到接種時(shí)間15～20min；消化一定要充分。加入消化液的量應(yīng)視標(biāo)本性狀接種前倒去培養(yǎng)基中的冷凝水培養(yǎng)注意事項(xiàng)標(biāo)本的選擇：選擇痰標(biāo)本中膿性、血樣、干酪樣的部分51培養(yǎng)基的選擇：用（NaOH）的選擇酸性改良羅氏培養(yǎng)基；用H2SO4的選擇改良羅氏培養(yǎng)基；使用有限期內(nèi)的培養(yǎng)基；每批次培養(yǎng)使用前應(yīng)抽檢，放置37℃培養(yǎng)，觀察有無滅菌徹底培養(yǎng)基應(yīng)放4℃冰箱保存，接種前應(yīng)提早30分鐘從冰箱中取出，保持一定平衡接種量的控制：0.1ml，并使接種液均勻分布于培養(yǎng)基表面培養(yǎng)溫度：37℃；第一天平臥放置斜面，并不擰緊瓶蓋，第二天直立，擰緊瓶蓋。觀察時(shí)間：接種后3天,7天觀察,此后每周觀察一次培養(yǎng)基的選擇：用（NaOH）的選擇酸性改良羅氏培養(yǎng)基；用H252結(jié)果報(bào)告：有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認(rèn),至第8周無菌落生長報(bào)告陰性；抗酸桿菌培養(yǎng)陰性應(yīng)以“(培養(yǎng)陰性)”報(bào)告，不能以“(—)”表示。菌落生長不足以斜面面積1／4時(shí)，實(shí)報(bào)菌落數(shù)。抗酸桿菌和污染同時(shí)存在于同一斜面上，應(yīng)同時(shí)報(bào)告。培養(yǎng)結(jié)果報(bào)告方式：抗酸桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長抗酸桿菌培養(yǎng)陽性（1+）：菌落生長占斜面面積的1/4抗酸桿菌培養(yǎng)陽性（2+）：菌落生長占斜面面積的1/2抗酸桿菌培養(yǎng)陽性（3+）：菌落生長占斜面面積的3/4抗酸桿菌培養(yǎng)陽性（4+）：菌落生長布滿全占斜面結(jié)果報(bào)告：有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認(rèn),至第8周無菌落生長報(bào)告53快速生長菌、污染菌鑒別非抗酸桿菌生長即報(bào)污染污染率的控制：2%~5%范圍涂陽培陰率：<10%渦旋振蕩、離心、傾倒上清液、接種時(shí)容易產(chǎn)生氣溶膠，應(yīng)注意使用安全儀器，正確操作?？焖偕L菌、污染菌鑒別非抗酸桿菌生長即報(bào)污染54培養(yǎng)失敗CPC離心培養(yǎng)失敗55(1)不論從結(jié)核病控制、流行病學(xué)檢查或臨床診斷的角度看，分枝桿菌的分離培養(yǎng)檢查法都是結(jié)核病確診最可靠的方法，是結(jié)核病病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義56分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義(2)開展進(jìn)一步檢測的基礎(chǔ)，是獲得純培養(yǎng)物進(jìn)行菌種鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)以及其他生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。(3)隨著結(jié)核病控制工作水平的提高，一些具備條件的基層結(jié)核病細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)逐步開展分枝桿菌的分離培養(yǎng).分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義(2)開展進(jìn)一步檢測的基礎(chǔ)57分離培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)敏感性較直接涂片法高，理論上10~100條菌/毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長速度，色素產(chǎn)生初步判斷非結(jié)核分枝桿菌；分離出具有活力的純培養(yǎng)物，為進(jìn)一步試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。分離培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)敏感性較直接涂片法高，理論上10~100條菌/58分離培養(yǎng)的缺點(diǎn)需時(shí)長，根據(jù)接種量的大小，一般2~8周才能得到肉眼可見菌落。結(jié)果受標(biāo)本保存運(yùn)送時(shí)間，培養(yǎng)基成分和質(zhì)量，前處理方法等影響，操作較直接涂片法復(fù)雜，需經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn)。需培養(yǎng)基凝固滅菌器，離心機(jī)，渦旋振蕩器，恒溫培養(yǎng)箱等設(shè)備。成本是直接涂片法的7~8倍。分離培養(yǎng)的缺點(diǎn)需時(shí)長，根據(jù)接種量的大小，一般2~8周才能得到59Dio-TK快速自動(dòng)變色培養(yǎng)系統(tǒng)（土耳其，伊斯坦

布爾，Diomed公司）顏色的改變是由于不同種屬的細(xì)菌代謝產(chǎn)物和產(chǎn)生的酶所造成，

而且這種顏色的改變早在培養(yǎng)基上長出肉眼可見的菌落前就發(fā)生了Dio-TK快速自動(dòng)變色培養(yǎng)系統(tǒng)（土耳其，伊斯坦

布爾，Di60括Dio-TK培養(yǎng)基Dio-TKSLC（選擇培養(yǎng)基）Dio-TKPNB（對硝基苯甲酸）Dio-TKINH（異煙肼）Dio-TKRMP(利福平)Dio-TKSM（鏈霉素）Dio-TKEMB（乙胺丁醇）培養(yǎng)基。括Dio-TK培養(yǎng)基61液體培養(yǎng)基營養(yǎng)好，細(xì)菌生長快，利于快速診斷。米氏7H9液體培養(yǎng)基液體變色培養(yǎng)基底層有顆粒狀沉淀，上清無色透明顯色劑：四唑鎓鹽→還原成粉紅色甲臢

液體培養(yǎng)基營養(yǎng)好，細(xì)菌生長快，利于快速診斷。底層有顆粒狀沉淀62液體變色培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)操作簡便；培養(yǎng)時(shí)間縮短；肉眼觀察結(jié)果；無需特殊儀器；無放射性污染；進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷帶有存在主觀性顯色結(jié)果不能長期保存敏感性、特異性有待提高不能觀察菌落特征液體變色培養(yǎng)基缺點(diǎn)液體變色培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)操作簡便；結(jié)果判斷帶有存在主觀性液體變色培63雙相培養(yǎng)基由固體和液體培養(yǎng)基組成，同時(shí)具有兩種培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)雙相羅氏培養(yǎng)基可促進(jìn)細(xì)菌生長縮短培養(yǎng)時(shí)間可提高培養(yǎng)陽性率可觀察菌落特征可進(jìn)行藥敏和菌種鑒定雙相培養(yǎng)基由固體和液體培養(yǎng)基組成，同時(shí)具有兩種培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)64用于病例發(fā)現(xiàn)和藥敏試驗(yàn)液體培養(yǎng)系統(tǒng)用于病例發(fā)現(xiàn)和藥敏試驗(yàn)液體培養(yǎng)系統(tǒng)65

結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)儀檢測BACTECMGIT960全自動(dòng)快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀BacT/ALERT3D全自動(dòng)培養(yǎng)儀熒光物質(zhì)包埋在7H9液體培養(yǎng)管的底部，分枝桿菌生長過程中，O2被消耗，底物產(chǎn)生熒光，儀器通過測定熒光強(qiáng)度，用生長指數(shù)來表示測定結(jié)果，培養(yǎng)時(shí)間通常需要7~42天。分枝桿菌生長過程中代謝產(chǎn)生CO2，CO2的產(chǎn)生使瓶底顏色感受器產(chǎn)生不同的顏色變化。通過比色傳感器來測定，CO2產(chǎn)生的速率和總量與細(xì)菌生長的速率和總量一致。結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)儀檢測BACTECMGIT960全自動(dòng)快66BACTECMGIT分枝桿菌熒光判讀器BACTECMGIT分枝桿菌熒光判讀器67用于病例發(fā)現(xiàn)和藥敏試驗(yàn)的液體培養(yǎng)系統(tǒng)涂片敏感性較低特別是在兒童或者合并感染HIV的人群。培養(yǎng)較涂片更敏感。液體培養(yǎng)系統(tǒng)較傳統(tǒng)固體培養(yǎng)系統(tǒng)更快速、更敏感。ProductprofileMGIT-TB培養(yǎng)系統(tǒng)平均檢出時(shí)間為10-14天，而雞蛋或者瓊脂固體培養(yǎng)基則需要3-4周的時(shí)間。MGIT也可以用來檢測耐藥情況。FIND與BD公司正在評價(jià)MGIT-DST的可行性以及在疫情較高的地區(qū)廣泛應(yīng)用的影響Liquidmedia+drug:

-Isoniazid -Rifampicin -Streptomycin -EthambutolTurnaroundTime:2-3wks afterculturepositive用于病例發(fā)現(xiàn)和藥敏試驗(yàn)的液體培養(yǎng)系統(tǒng)涂片敏感性較低特別是在兒68培養(yǎng)的質(zhì)量控制培養(yǎng)的質(zhì)量控制69結(jié)核菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)結(jié)核菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)70室內(nèi)質(zhì)量控制幫助實(shí)驗(yàn)室建立自己的室內(nèi)質(zhì)量控制制度幫助他們理解培養(yǎng)過程中的每一步推薦用一些簡單的法自測，例如：用簡單的鹽酸滴定法測定NaOH濃度記錄培養(yǎng)箱的最高和最低溫度

(35-37oC)如果使用離心,用轉(zhuǎn)速記常規(guī)檢測離心機(jī)轉(zhuǎn)速,保證3000g離心力對于自動(dòng)液體培養(yǎng)系統(tǒng),保證能做日常維持和檢測工作.檢查每一批新的培養(yǎng)基和

PENTA所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果和記錄必須裝冊室內(nèi)質(zhì)量控制幫助實(shí)驗(yàn)室建立自己的室內(nèi)質(zhì)量控制制度71舉例:LJ培養(yǎng)基制備指南

(1)孔雀綠:可能對分枝桿菌有一定的殺菌作用,選擇測試后無殺分枝桿菌作用的必須避光保存雞蛋來源:A級:能為LJ培養(yǎng)基提供足夠的蛋白無抗生素和染料新鮮,蛋殼無縫，表面無真菌生長

不容易獲得舉例:LJ培養(yǎng)基制備指南(1)孔雀綠:72舉例:LJ培養(yǎng)基制備無菌測試陽性質(zhì)控:偶然分枝桿菌3天內(nèi)生長

50-100CFU單位

的

MTB在4周內(nèi)能生長送新批培養(yǎng)基到高一級別實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生長測試試驗(yàn)？舉例:LJ培養(yǎng)基制備無菌測試73培養(yǎng)陽性率和污染率紅線：陽性率綠線：污染率藍(lán)線：涂片陽相率培養(yǎng)陽性率和污染率紅線：陽性率74培養(yǎng)一些指標(biāo)污染率:3-5%;5-10%(液體培養(yǎng))陽性結(jié)果需要的平均時(shí)間

:4-5周涂陰培陽率:<10%其他分枝桿菌(例如戈登分枝桿菌):基線監(jiān)測值，占全部的~5%??,或者其他分枝桿菌？培養(yǎng)一些指標(biāo)污染率:3-5%;5-10%(液體培養(yǎng))75謝謝！謝謝！76結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)柳正衛(wèi)結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)柳正衛(wèi)77結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌78結(jié)核分枝桿菌-結(jié)核病的病原體1882年koch發(fā)現(xiàn)了結(jié)核桿菌，1896年將結(jié)核桿菌正式命名為結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌-結(jié)核病的病原體79分枝桿菌書屬于裂植菌綱，效線菌目，分枝桿菌科，分枝桿菌屬。以《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》分類法為國際間廣泛公認(rèn)和采用，《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》確認(rèn)的分枝桿菌有100多個(gè)種，根據(jù)生長速度將分枝桿菌屬分為快速生長分枝桿菌和緩慢生長分枝桿菌。其中結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、田鼠分枝桿菌等26種為緩慢生長為分枝桿菌。7天以上肉眼可見單個(gè)菌落，稱為緩慢生長分枝桿菌，其代表菌種是結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis).7天以內(nèi)肉眼可見單個(gè)菌落，成為快速生長分枝桿菌。分枝桿菌分類分枝桿菌書屬于裂植菌綱，效線菌目，分枝桿菌科，分枝桿菌屬。分80分枝桿菌種類

類別Rubyun分群

對人致病的分枝桿菌緩

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群

人型、牛型、非洲型慢

非結(jié)核分枝桿菌Ⅰ群堪薩斯、海、猿生

非結(jié)核分枝桿菌Ⅱ群瘰癘長

非結(jié)核分枝桿菌Ⅲ群鳥-胞內(nèi)、蟾快速生長非結(jié)核分枝桿菌Ⅳ群偶發(fā)、龜分枝桿菌種類81分枝桿菌屬主要特點(diǎn)是一類直或微彎曲、有分枝生長趨勢的桿菌。細(xì)胞壁脂質(zhì)含量高，主要為分枝菌酸。具有抗酸性，革蘭染色不易著色，常用抗酸染色。專性需氧營養(yǎng)要求特殊，大多數(shù)生長緩慢。不產(chǎn)內(nèi)、外毒素和侵襲性酶等致病物質(zhì)，所致疾病呈慢性。分枝桿菌屬主要特點(diǎn)是一類直或微彎曲、有分枝生長趨勢的桿菌。82分枝桿菌種類分枝桿菌屬，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌）及麻風(fēng)分枝桿菌外，余者統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌（NontuberculosisMycobacteria,NTM）結(jié)核分枝桿菌是引起人類結(jié)核病的主要病原菌，此外，牛分枝桿菌除引起牛結(jié)核病外，少數(shù)人類結(jié)核病也由其引起。非洲分枝桿菌致病力較弱，是熱帶非洲人結(jié)核病病原體。田鼠分枝桿菌對人類無致病性。分枝桿菌種類分枝桿菌屬，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（結(jié)核分枝桿菌、83分枝桿菌屬種類結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌田鼠分枝桿菌非典型分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌光產(chǎn)色分枝桿菌暗產(chǎn)色分枝桿菌不產(chǎn)色分枝桿菌迅速生長分枝桿菌分枝桿菌屬分枝桿菌屬種類結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群結(jié)核分枝桿菌非典型分枝桿菌麻84形態(tài)直或銷彎曲、兩端鈍圓的桿菌，菌體長1-4um，寬0.3-0.6um，無芽胞，無莢膜，無鞭毛，經(jīng)抗酸染色后菌體呈紅色桿狀，單個(gè)散在或呈“人、V、T、Y”形排列。結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)核質(zhì)。結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性形態(tài)結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特性851.專性需氧菌(<50%O2);8%CO2可促進(jìn)基礎(chǔ)生長2.營養(yǎng)要求:-C源:甘油,有機(jī)酸(丙酮酸鹽,檸檬酸,棕櫚酸鹽),葡萄糖-N源:天(門)冬酰胺,谷氨酸,等-雞蛋或血清蛋白:保護(hù)MTB拮抗毒素(油酸,毒素但在血清蛋白存在的情況下可促進(jìn)結(jié)核菌的生長)3.環(huán)境：-生長最適溫度為35-37℃-最適PH為6.8-7.2結(jié)核分枝桿菌的生長和營養(yǎng)71.專性需氧菌(<50%O2);8%CO2可促進(jìn)基86生長現(xiàn)象：生長緩慢在培養(yǎng)基上繁殖一代約需15-20小時(shí)，一般需2-4周或更長時(shí)間始見菌落生長，有極少數(shù)生長極為緩慢者需8周以上才開始有菌落生長。改良羅氏培養(yǎng)基菌落特征：菌落粗糙、凸起、致密，有表面皺折，呈顆粒、結(jié)節(jié)或菜花樣，乳白色或米色，無可溶性色素,不透明。液體培養(yǎng)基：形成菌膜，有毒株呈索狀生長結(jié)核發(fā)枝桿菌的生長特征生長現(xiàn)象：結(jié)核發(fā)枝桿菌的生長特征87結(jié)核分枝桿菌菌落結(jié)核分枝桿菌菌落88結(jié)核分枝桿菌革蘭染色陽性，但不易著色。經(jīng)苯胺染料染色著色后，能抵抗酸和酸乙醇脫色，稱為抗酸性。經(jīng)抗酸染色后，結(jié)核分枝桿菌呈紅色，而標(biāo)本中其他細(xì)菌、細(xì)胞、雜質(zhì)等均呈藍(lán)色。結(jié)核分枝桿菌的染色特性結(jié)核分枝桿菌革蘭染色陽性，但不易著色。結(jié)核分枝桿菌的染色特性89結(jié)核分枝桿菌因細(xì)胞壁含大量類脂質(zhì)，具有疏水性，對物理和化學(xué)因素抵抗力均較強(qiáng)。在室溫和陰暗處干燥痰可存活6-8個(gè)月，在空氣中可保持傳染性8-10天，在-6-8度能存活4-5年，濕熱對結(jié)核分枝桿菌殺傷力強(qiáng)，煮沸與高壓蒸氣消毒是殺滅最有效的方法之一。結(jié)核分枝桿菌對光線和射線敏感，因此紫外線照射常用于空氣和物體表面消毒。結(jié)核分枝桿菌的抵抗力

結(jié)核分枝桿菌因細(xì)胞壁含大量類脂質(zhì)，具有疏水性，對物理和化學(xué)因90耐藥性是結(jié)核桿菌的重要生物學(xué)特性耐藥菌不斷生長繁殖，終致菌群中以耐藥菌為主（敏感菌被藥物淘汰），抗結(jié)核藥物即失效。由基因突變而出現(xiàn)的極少量天然耐藥菌（自然變異），通常不致引起嚴(yán)重后果。藥物與結(jié)核桿菌接觸后，有的細(xì)菌發(fā)生誘導(dǎo)變異，逐漸能適應(yīng)在含藥環(huán)境中繼續(xù)生存（繼發(fā)耐藥）。耐異煙肼菌株的致病力顯著減弱，耐鏈霉素菌株的致病力一般不降低，耐利福平菌株有不同程度降低，對利福平及異煙肼同時(shí)耐藥，其致病力降低較單一耐異煙肼者更顯著。耐藥性是結(jié)核桿菌的重要生物學(xué)特性耐藥菌不斷生長繁殖，終致菌群91結(jié)核分枝桿菌－－生化反應(yīng)生化反應(yīng)不活潑，不發(fā)酵糖類與非結(jié)核分枝桿菌鑒別：

耐熱觸酶試驗(yàn)－；（非結(jié)核分枝桿菌＋）與牛分枝桿菌鑒別煙酸試驗(yàn)＋；（牛分枝桿菌－）結(jié)核分枝桿菌－－生化反應(yīng)生化反應(yīng)不活潑，不發(fā)酵糖類92結(jié)核分枝桿菌－－抵抗力與變異性抵抗力特點(diǎn)：“三耐四敏”耐干燥、耐酸堿、耐孔雀綠（1：13000）對濕熱、70％乙醇、紫外線、常用抗結(jié)核藥物（但長期使用易產(chǎn)生耐藥性）變異性典型形態(tài)－→多形性R型菌落－→S型菌落有毒－→無毒（用于制備疫苗）抗結(jié)核藥敏感－→耐藥結(jié)核分枝桿菌－－抵抗力與變異性抵抗力特點(diǎn)：“三耐四敏”93結(jié)核分枝桿菌－－致病物質(zhì)脂質(zhì)索狀因子:與該菌毒力有密切關(guān)系磷脂:分枝菌酸：與抗酸性有關(guān)蠟質(zhì)D:具有佐劑作用硫酸腦苷脂蛋白質(zhì)糖類結(jié)核桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，不產(chǎn)生侵襲性酶結(jié)核分枝桿菌－－致病物質(zhì)脂質(zhì)94結(jié)核分枝桿菌－－所致疾病與免疫性經(jīng)多途徑感染，引起結(jié)核病，以肺結(jié)核多見類型：原發(fā)感染和繼發(fā)感染免疫性抗結(jié)核免疫以細(xì)胞免疫為主抗結(jié)核免疫屬帶菌免疫抗結(jié)核免疫與Ⅳ型超敏反應(yīng)同時(shí)出現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌－－所致疾病與免疫性經(jīng)多途徑感染，引起結(jié)核病，以95結(jié)核分枝桿菌鑒定程序結(jié)核分枝桿菌鑒定程序96結(jié)核分枝桿菌－－檢驗(yàn)程序標(biāo)本核酸檢測接種固體培養(yǎng)基可疑菌落涂片抗酸染色鏡檢抗體檢測慢性生長菌快速生長菌菌種鑒定標(biāo)本前處理接種液體培養(yǎng)基接種小白鼠豚鼠臟器涂片鏡檢抗酸染色鑒定試驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌－－檢驗(yàn)程序標(biāo)本核酸接種固體培養(yǎng)基可疑菌落涂片抗97分枝桿菌菌種鑒定的意義非結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率在不同的國家、不同的地區(qū)報(bào)告差別很大。據(jù)資料報(bào)道，日本在1980年報(bào)告：在分枝桿菌感染中，非結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率為12%，并有逐年上升趨勢，其中主要為鳥胞內(nèi)復(fù)合群，高達(dá)89.6%，其次為堪薩斯占8.0%我國年對非結(jié)核分枝桿菌的研究資料尚不充足，也缺乏較大規(guī)模的流調(diào)，據(jù)報(bào)告非結(jié)核分枝桿菌在我國的發(fā)病率占分枝桿菌的4.3%左右。分枝桿菌菌種鑒定的意義非結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率在不同的國家、不98分枝桿菌菌種鑒定的意義一般來說，非結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物的敏感性低于結(jié)核菌，但各型和各菌株之間對藥物的敏感性差別甚大。分枝桿菌菌種鑒定的意義一般來說，非結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物的99分枝桿菌菌種鑒定形態(tài)學(xué)菌落形態(tài)、顏色生長條件28℃生長試驗(yàn)，結(jié)核分枝桿菌在28℃的孵育環(huán)境中不能生長；而TNM菌群的大部分分枝桿菌可以生長。生化反應(yīng)硝酸還原

、煙酸試驗(yàn)酶尿素酶耐熱觸酶

分子生物學(xué)方法

分枝桿菌菌種鑒定形態(tài)學(xué)菌落形態(tài)、顏色100分枝桿菌菌種鑒定分枝桿菌菌群鑒定的目的既是鑒定菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群還是非結(jié)核分枝桿菌，也是進(jìn)一步菌種鑒定的基礎(chǔ)。分枝桿菌臨床分離株藥物敏感性試驗(yàn)應(yīng)與菌種初步鑒定同步進(jìn)行，以對硝基苯甲酸（PNB）、噻吩-2-羧酸肼（TCH）鑒別培養(yǎng)基初步鑒別結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌鑒別培養(yǎng)基的制備過程略。分枝桿菌菌種鑒定分枝桿菌菌群鑒定的目的既是鑒定菌株屬于結(jié)核分101分枝桿菌菌種初步鑒定分枝桿菌PNBTCH28℃生長耐熱觸酶硝酸還原煙酸試驗(yàn)牛分枝桿菌——————結(jié)核分枝桿菌—+————NTM++++++分枝桿菌菌種初步鑒定分枝桿菌PNBTCH28℃生長耐熱102分枝桿菌菌種鑒定質(zhì)量控制要求經(jīng)過初步鑒定的分枝桿菌，需進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定，可送上一級實(shí)驗(yàn)室。鑒別菌株應(yīng)生長旺盛，生長時(shí)間為3~4周為宜。所有培養(yǎng)基、試劑應(yīng)在規(guī)定期限內(nèi)使用。所有試劑均應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌株對照試驗(yàn)合格后使用。分枝桿菌菌種鑒定質(zhì)量控制要求經(jīng)過初步鑒定的分枝桿菌，需進(jìn)一步103非典型分枝桿菌是指結(jié)核分枝桿菌與麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。大多為環(huán)境中的腐生菌對酸堿比較敏感對常用抗結(jié)核藥耐受為條件致病菌，艾滋病患者易感染鳥復(fù)合分枝桿菌非典型分枝桿菌是指結(jié)核分枝桿菌與麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。104MTB鑒定流程Mycobact.tuberculosis其他分枝菌

M.tuberculos培養(yǎng)特征(1)10天后出現(xiàn)較硬菌落(2)抗酸菌(3)索狀構(gòu)成初培養(yǎng)物生長的好生長的差yes敏感抵抗+煙酸+NO3

試驗(yàn)68℃耐熱觸酶試驗(yàn)PNB敏感性試驗(yàn)noMTBNTMMTB鑒定流程Mycobact.其他M.t105結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)操作結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)操作106結(jié)核分枝桿菌－－分離培養(yǎng)標(biāo)本前處理：目的：殺死雜菌；液化標(biāo)本方法：4％NaOH法；4％H2SO4法；胰酶-新潔爾滅法等培養(yǎng)基選擇：羅氏培養(yǎng)基、米氏培養(yǎng)基、小川培養(yǎng)基等接種培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌－－分離培養(yǎng)標(biāo)本前處理：107去污染處理(痰標(biāo)本)視標(biāo)本性狀，加1~2倍體積4%氫氧化鈉（NaOH)消化液于痰瓶中，擰緊螺旋蓋，渦旋震蕩器上震蕩1min，使痰液充分勻化，室溫放置。自加入氫氧化鈉消化液起，整個(gè)處理時(shí)間應(yīng)在15~20min。標(biāo)本較多時(shí)，應(yīng)分批處理去污染處理(痰標(biāo)本)視標(biāo)本性狀，加1~2倍體積4%氫氧化鈉（108

病理組織或干酪塊標(biāo)本切碎后置于無菌組織研磨器，加入適量（0.5~1ml）生理鹽水后充分研磨成混懸液；混懸液經(jīng)3000r/min離心30min后，沉淀物進(jìn)行堿處理[與2~4倍量2%氫氧化鈉（NaOH)混合，處理15min]后接種。尿液留全量夜尿，靜置4~5h,取沉淀部分約10ml,3000r/min離心30min,取沉淀進(jìn)行堿處理[與等倍量4%硫酸（H2SO4）混合,處理15min]后接種.去污染處理(其他標(biāo)本)

病理組織或干酪塊標(biāo)本切碎后置于無菌組織研磨器，加入適量（109去污染處理(其他標(biāo)本)膿液采用4%硫酸（H2SO4）以1︰3混勻后，靜置25min（期間震蕩數(shù)次)，按無菌手續(xù)接種0.1ml經(jīng)處理的標(biāo)本至L-J培養(yǎng)基，每份標(biāo)本接種2支培養(yǎng)基。酸處理去污染時(shí)間不超過25min。胸腹水,支氣管灌洗液標(biāo)本參照痰標(biāo)本處理辦法.去污染處理(其他標(biāo)本)膿液采用4%硫酸（H2SO4）以1110去污染處理(其他標(biāo)本)腦脊液無菌操作收集的腦脊液,置冰箱或室溫24h,待薄膜形成后將薄膜接種到L-J培養(yǎng)基;或?qū)⒛X脊液在無菌操作環(huán)境中3000r/min離心30min,取沉淀直接接種到L-J培養(yǎng)基.非無菌操作采集的腦脊液標(biāo)本,離心后的沉淀進(jìn)行堿處理[與等倍量4%氫氧化鈉（NaOH)混合,處理10~15min]后接種于酸性L-J培養(yǎng)基去污染處理(其他標(biāo)本)111去污染處理（其他標(biāo)本）糞便標(biāo)本與生理鹽水混合后,充分振蕩使之成為混懸液;定性濾紙過濾后,濾液經(jīng)3000r/min離心10min;沉淀進(jìn)行酸處理[與2~4倍量的4%硫酸（H2SO4）]混合,處理15~20min)后接種L-J培養(yǎng)基.咽喉棉拭子將棉拭子放入一無菌試管,加入適量生理鹽水浸泡,加入等體積4%氫氧化鈉（NaOH)后強(qiáng)烈振蕩,靜置15min后接種.去污染處理（其他標(biāo)本）糞便標(biāo)本與生理鹽水混合后,充分振蕩使112不同溫度下儲存痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌生存活力的改變908190n=36n=41n=41No.ofsputatestedKimSJ,etal,1986ParamasivanCN,etal,1983703142125~30℃2825℃4℃不同溫度下儲存痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌生存活力的改變908190113痰標(biāo)本的收集和運(yùn)輸容器：帶螺旋蓋的McCartney玻璃或塑料瓶收集：至少兩份標(biāo)本（兩份即時(shí)痰或1份即時(shí)痰和1分家中采集的痰）運(yùn)輸：使用CPCorCPB;使用泡沫盒加冰袋標(biāo)本加酒精或其它殺菌劑/標(biāo)本滅菌后在

CTL用分子學(xué)做鑒定和藥敏痰標(biāo)本的收集和運(yùn)輸容器：帶螺旋蓋的McCartney玻璃或塑114含有CPC痰標(biāo)本的去污處理

TB在0.5%CPC中的存活新鮮痰標(biāo)本用等體積

1%CPC或0.6%CPB混合<10℃≥20℃含有CPC痰標(biāo)本的去污處理

TB在0115酸性改良羅氏培養(yǎng)基成分和制備方法略。酸性改良羅氏培養(yǎng)基成分和制備方法略。116痰培養(yǎng)方法簡單培養(yǎng)：適合于大部分實(shí)驗(yàn)室/臨床檢驗(yàn)濃縮培養(yǎng)：在有離心機(jī)、相應(yīng)材料和熟練技術(shù)人員的條件下適用痰培養(yǎng)方法簡單培養(yǎng)：適合于大部分實(shí)驗(yàn)室/臨床檢驗(yàn)117簡單法培養(yǎng)過程SputumAdd4%NaOH勻化痰去污處理(15min)如沒有中和，接種到酸性培養(yǎng)基36±1C孵育9周

MTBgrowth鋪開/水平位置孵育/24-48小時(shí)后擰緊瓶蓋or簡單法培養(yǎng)過程SputumAdd4%勻化痰去污處理如沒有中118濃縮法涂片/培養(yǎng)SputumAdd4%NaOH勻化/去污處理37C孵育9周MTBgrowth1.用盡可能多的無菌水/PB稀釋2.3,000xg離心2次以上3.用接種環(huán)或吸管轉(zhuǎn)移沉淀SwingbucketrotorBucket&tubesWindshieldedswingbucketrotor固定角度的轉(zhuǎn)頭濃縮法涂片/培養(yǎng)SputumAdd4%勻化/去污處理37C119離心力對痰涂片和培養(yǎng)結(jié)果的影響離心力（xg）涂片陽性（+）培養(yǎng)陽性（+）涂片陽性/培養(yǎng)陽性比率12601.87.10.2530004.511.20.4038009.611.60.83離心力對痰涂片和培養(yǎng)結(jié)果的影響離心力涂片陽性（+）培養(yǎng)陽性（120結(jié)果報(bào)告1.接種后第3、7天各觀察1次菌落生長情況。發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經(jīng)抗酸染色證實(shí)后，可報(bào)告快速生長分枝桿菌陽性。此后每周觀察1次，記錄菌落生長及污染情況。陽性生長物經(jīng)抗酸染色證實(shí)后，可報(bào)告分枝桿菌生長。滿8周后未見菌落生長者方可報(bào)告培養(yǎng)陰性結(jié)果。結(jié)果報(bào)告1.接種后第3、7天各觀察1次菌落生長情況。發(fā)現(xiàn)菌落121結(jié)果報(bào)告2.觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌生長時(shí)，應(yīng)報(bào)告污染。培養(yǎng)污染率應(yīng)控制在2%~5%范圍。污染率過高，提示培養(yǎng)基滅菌不佳，標(biāo)本前處理、接種等環(huán)節(jié)有誤，應(yīng)當(dāng)分析原因，采取相應(yīng)措施。結(jié)果報(bào)告2.觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌生長時(shí)，應(yīng)報(bào)告污染。培養(yǎng)122結(jié)果報(bào)告(1)分枝桿菌培養(yǎng)陰性:斜面無菌落生長,以“培養(yǎng)陰性”報(bào)告,不可以“–”表示.(2)分枝桿菌培養(yǎng)陽性（１＋）：菌落生長占斜面面積的1/4．(3)分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2＋）：菌落生長占斜面面積的1/2．(4)分枝桿菌培養(yǎng)陽性（3＋）：菌落生長占斜面面積的3/4．(5)分枝桿菌培養(yǎng)陽性（4＋）：菌落生長布滿整個(gè)斜面(6)報(bào)實(shí)際菌落數(shù):菌落生長不足斜面面積1/4．結(jié)果報(bào)告123分離培養(yǎng)的操作流程

痰標(biāo)本中、加1~2倍體積4%NaOH渦旋振蕩1~2min室溫靜置15min分別接種0.1ml前處理液至2支培養(yǎng)基斜面置37℃溫箱培養(yǎng)接種后3天,7天觀察,此后每周觀察一次有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認(rèn),至第8周無菌落生長報(bào)告陰性分離培養(yǎng)的操作流程痰標(biāo)本中、加渦旋振蕩室溫靜置124AFB復(fù)紅染色AFB熒光染色L-J培養(yǎng)基上生長的克隆細(xì)菌聚集融合(索狀)形態(tài)學(xué)特征1

0.2~0.3x2~5?-抗酸/乙醇脫色的桿菌染色特性-靜止不動(dòng);-無芽孢;2孵育10天后出現(xiàn)象牙色、干燥、較硬、表面粗糙的克隆3

細(xì)菌聚集融合

/形成索狀A(yù)FB復(fù)紅染色AFB熒光染色L-J培養(yǎng)基上生長細(xì)菌聚集融合125分枝桿菌分離培養(yǎng)注意事項(xiàng)分枝桿菌分離培養(yǎng)注意事項(xiàng)126培養(yǎng)注意事項(xiàng)標(biāo)本的選擇：選擇痰標(biāo)本中膿性、血樣、干酪樣的部分；新發(fā)病人應(yīng)在抗結(jié)核藥物治療前留取痰標(biāo)本。治療中的病人應(yīng)停藥2—3天后留取痰標(biāo)本。標(biāo)本的保存：如需送上級實(shí)驗(yàn)室檢查，應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)痰瓶中，加入與標(biāo)本等體積的防腐液[0.6％溴化十六烷基吡啶(CPB)的2％氯化鈉(NaCl)液]，密封保存。此標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送交上級實(shí)驗(yàn)室。防腐處理后，痰標(biāo)本可在室溫下短期存放。但仍以4℃保存為宜，存放時(shí)間不應(yīng)超過2周。時(shí)間控制：從加入消化液（NaOH）到接種時(shí)間15～20min；消化一定要充分。加入消化液的量應(yīng)視標(biāo)本性狀接種前倒去培養(yǎng)基中的冷凝水培養(yǎng)注意事項(xiàng)標(biāo)本的選擇：選擇痰標(biāo)本中膿性、血樣、干酪樣的部分127培養(yǎng)基的選擇：用（NaOH）的選擇酸性改良羅氏培養(yǎng)基；用H2SO4的選擇改良羅氏培養(yǎng)基；使用有限期內(nèi)的培養(yǎng)基；每批次培養(yǎng)使用前應(yīng)抽檢，放置37℃培養(yǎng)，觀察有無滅菌徹底培養(yǎng)基應(yīng)放4℃冰箱保存，接種前應(yīng)提早30分鐘從冰箱中取出，保持一定平衡接種量的控制：0.1ml，并使接種液均勻分布于培養(yǎng)基表面培養(yǎng)溫度：37℃；第一天平臥放置斜面，并不擰緊瓶蓋，第二天直立，擰緊瓶蓋。觀察時(shí)間：接種后3天,7天觀察,此后每周觀察一次培養(yǎng)基的選擇：用（NaOH）的選擇酸性改良羅氏培養(yǎng)基；用H2128結(jié)果報(bào)告：有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認(rèn),至第8周無菌落生長報(bào)告陰性；抗酸桿菌培養(yǎng)陰性應(yīng)以“(培養(yǎng)陰性)”報(bào)告，不能以“(—)”表示。菌落生長不足以斜面面積1／4時(shí)，實(shí)報(bào)菌落數(shù)?？顾釛U菌和污染同時(shí)存在于同一斜面上，應(yīng)同時(shí)報(bào)告。培養(yǎng)結(jié)果報(bào)告方式：抗酸桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長抗酸桿菌培養(yǎng)陽性（1+）：菌落生長占斜面面積的1/4抗酸桿菌培養(yǎng)陽性（2+）：菌落生長占斜面面積的1/2抗酸桿菌培養(yǎng)陽性（3+）：菌落生長占斜面面積的3/4抗酸桿菌培養(yǎng)陽性（4+）：菌落生長布滿全占斜面結(jié)果報(bào)告：有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認(rèn),至第8周無菌落生長報(bào)告129快速生長菌、污染菌鑒別非抗酸桿菌生長即報(bào)污染污染率的控制：2%~5%范圍涂陽培陰率：<10%渦旋振蕩、離心、傾倒上清液、接種時(shí)容易產(chǎn)生氣溶膠，應(yīng)注意使用安全儀器，正確操作?？焖偕L菌、污染菌鑒別非抗酸桿菌生長即報(bào)污染130培養(yǎng)失敗CPC離心培養(yǎng)失敗131(1)不論從結(jié)核病控制、流行病學(xué)檢查或臨床診斷的角度看，分枝桿菌的分離培養(yǎng)檢查法都是結(jié)核病確診最可靠的方法，是結(jié)核病病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義132分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義(2)開展進(jìn)一步檢測的基礎(chǔ)，是獲得純培養(yǎng)物進(jìn)行菌種鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)以及其他生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。(3)隨著結(jié)核病控制工作水平的提高，一些具備條件的基層結(jié)核病細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)逐步開展分枝桿菌的分離培養(yǎng).分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法的重要意義(2)開展進(jìn)一步檢測的基礎(chǔ)133分離培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)敏感性較直接涂片法高，理論上10~100條菌/毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長速度，色素產(chǎn)生初步判斷非結(jié)核分枝桿菌；分離出具有活力的純培養(yǎng)物，為進(jìn)一步試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。分離培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)敏感性較直接涂片法高，理論上10~100條菌/134分離培養(yǎng)的缺點(diǎn)需時(shí)長，根據(jù)接種量的大小，一般2~8周才能得到肉眼