發(fā)育生物學(xué)003研究方法

1發(fā)育生物學(xué)

（Developmentbiology）發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)Department

of

Developmental

Biology

SchoolofLifeSciencesCentral

South

Universityzhangjianxiang@2發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)根據(jù)研究目的不同，采用的技術(shù)發(fā)法也不同。大致可以分為以下幾個(gè)方面：形態(tài)學(xué)研究技術(shù)發(fā)育機(jī)理研究技術(shù)遺傳學(xué)研究技術(shù)生殖技術(shù)3形態(tài)學(xué)研究技術(shù)：主要用于生物發(fā)育過程中的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察與組織結(jié)構(gòu)演變規(guī)律及細(xì)胞遷移等研究。包括光鏡技術(shù)、電鏡技術(shù)、組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、組織化學(xué)技術(shù)、原位雜交技術(shù)、細(xì)胞移植技術(shù)等。其中包含了染料細(xì)胞標(biāo)記、熒光細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)。4發(fā)育機(jī)理研究技術(shù)發(fā)育機(jī)理研究，主要是發(fā)育控制基因的鑒定、表達(dá)和功能檢測(cè)。研究方法主要是分子生物學(xué)技術(shù)從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因；分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。（一）、鑒定發(fā)育相關(guān)基因的主要方法5（二）、基因表達(dá)的檢測(cè)mRNA的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)啟動(dòng)子活性檢測(cè)（三）基因?qū)Πl(fā)育的影響的功能性研究1.基因敲除(geneknockout)2.轉(zhuǎn)基因3.AntisenseRNA4.DsRNAinterference(RNAi)5.Antibodyblocking6.Dominantnegativereceptormutations6遺傳學(xué)研究技術(shù)主要由于物種遺傳信息、生物進(jìn)化、遺傳性疾病與畸形等基因分析。常用染色體技術(shù)與基因掃描技術(shù)生殖技術(shù)屬于應(yīng)用技術(shù)，主要由于物種改良、輔助生殖。如人工授精技術(shù)、物種間雜交技術(shù)等。7發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)（一）傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)2、基因表達(dá)的檢測(cè)從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因；分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。1、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法（二）控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測(cè)方法1、染料細(xì)胞標(biāo)記2、熒光細(xì)胞標(biāo)記3、細(xì)胞移植8(一)傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)

1、染料細(xì)胞標(biāo)記9（一）傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)

2、熒光細(xì)胞標(biāo)記10（一）傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)

3、細(xì)胞移植11（二）控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測(cè)方法從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因；分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。1、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法12從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因；突變體的類型：隱性突變和顯性突變

獲得突變體的方法：自然群體中的突變體

化學(xué)誘變劑處理如亞硝基－乙脲－乙亞硝基脲(N-nitroso-N-ethylureaethylnitrosourea,ENU)；

外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、轉(zhuǎn)座子利用等；

X－射線或r－射線照射1、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法13分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法獲取特定組織：直接取材或轉(zhuǎn)基因法取材；基因芯片雙向電泳：從蛋白質(zhì)到基因；DDPCR抑制差減雜交1、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法141516利用基因序列同源性的克隆法用一個(gè)物種的基因直接做探針分離另一個(gè)物種的同源基因；根據(jù)多個(gè)物種的蛋白序列分離另一個(gè)物種的同源基因；根據(jù)同一基因家族的不同成員間的保守序列分離新的家族成員基因。1、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法1718利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。利用DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用利用蛋白質(zhì)之間的相互作用1、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法19鑒定可與靶蛋白結(jié)合的DNA序列;分離結(jié)合蛋白質(zhì);利用DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用20酵母雙雜交法利用蛋白質(zhì)之間的相互作用21（二）控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測(cè)方法mRNA的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)啟動(dòng)子活性檢測(cè)2、基因表達(dá)的檢測(cè)22mRNA的檢測(cè)2、基因表達(dá)的檢測(cè)NorthernblotRT-PCRDNAMicroarrayinsituhybridization23Northernblot(RNA印跡雜交）24利用原位雜交技術(shù)研究基因表達(dá)的時(shí)空譜25電泳法Westernblot抗體染色法蛋白質(zhì)的的檢測(cè)2、基因表達(dá)的檢測(cè)26表達(dá)載體的構(gòu)建：2、基因表達(dá)的檢測(cè)啟動(dòng)子活性檢測(cè)27用組織特異性啟動(dòng)子控制外源基因的表達(dá)綠色血液綠色神經(jīng)細(xì)胞28五、發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)（一）傳統(tǒng)的發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)mRNA的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)啟動(dòng)子活性檢測(cè)2、基因表達(dá)的檢測(cè)從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因；分離時(shí)空特異性表達(dá)基因的方法；利用基因序列同源性的克隆法；利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。1、鑒定發(fā)育相關(guān)新基因的主要方法（二）控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達(dá)和功能檢測(cè)方法1、染料細(xì)胞標(biāo)記2、熒光細(xì)胞標(biāo)記3、細(xì)胞移植291.基因敲除(geneknockout)2.轉(zhuǎn)基因3.AntisenseRNA4.DsRNAinterference(RNAi)5.Antibodyblocking6.Dominantnegativereceptormutations（三）基因?qū)Πl(fā)育的影響的功能性研究30用基因敲除法研究基因的功能31轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與基因的異位表達(dá)DNA注射；RNA注射；病毒感染。32RNAi研究史1990，RichJorgensen在矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默1995，researchersGuo和Kemphues注入反義RNA及正義鏈RNA都能抑制線蟲par-1

基因的表達(dá)；三年后，F(xiàn)ire等注入雙鏈RNA到線蟲中發(fā)現(xiàn)比注入單鏈更有效，隨后發(fā)展了通過RNAi進(jìn)行線蟲基因敲除的策略。2001年Elbashir等《Nature》上首次報(bào)道通過21個(gè)核苷酸的siRNA成功地在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多種細(xì)胞中也取得了成功。2002---載體33化學(xué)合成體外合成siRNA對(duì)應(yīng)的DNA發(fā)卡模板siRNA進(jìn)入細(xì)胞（轉(zhuǎn)染）siRNA設(shè)計(jì)siRNA合成體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA標(biāo)記模板構(gòu)建到載體質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞（轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化）檢測(cè)（核酸，蛋白質(zhì)水平）目的基因片段的PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RNA長片段RNaseIII消化34體外轉(zhuǎn)錄合成SiRNA35U6/H1-siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建TandemTypeHairpinTypeGN17CTTTTTU6PU6PGN17CTTTTTGN18-loop-N18U6PTTTTTSenseantisenseantisenseSenseGN17CU44UCN17G轉(zhuǎn)錄退火siRNAGN184UCN18GN18NN4UCN18轉(zhuǎn)錄DicersiRNA36DominantNegativeReceptorMutations

細(xì)胞膜

受體胞外區(qū)

受體跨膜區(qū)

突變

受體胞內(nèi)區(qū)缺失導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)的中斷受體胞內(nèi)區(qū)

配體配體

下游信號(hào)分子蛋白以及蛋白之間的相互作用決定了蛋白的生物學(xué)功能及細(xì)胞的表型.

一種結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去其正常的生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子，往往與其相應(yīng)的野生型蛋白進(jìn)行競爭性的抑制，從而阻斷野生型蛋白的生物學(xué)功能.

這種具有競爭性抑制野生型蛋白分子生物學(xué)功能的突變體稱為顯性抑制突變體(do