《發(fā)酵工程原理》課件第二章 微生物菌種制備（制藥14級）

第二章

微生物菌種制備原理與技術(shù)本章內(nèi)容一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵微生物生理學(xué)三、發(fā)酵工業(yè)菌種篩選四、發(fā)酵工業(yè)菌種改良2發(fā)酵工程是以微生物的生命活動為中心的；微生物的生物學(xué)性狀和發(fā)酵條件決定了其相應(yīng)產(chǎn)物的生成；工業(yè)上用的微生物稱為工業(yè)微生物，工業(yè)生產(chǎn)上常用的微生物主要是細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌；由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及基因工程正在進(jìn)入發(fā)酵過程，病毒、藻類等其它微生物也正在逐步地變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)菌。工業(yè)微生物3微生物細(xì)胞工廠4減壓精餾氧化氧化丙烯酸

建筑、紡織、包裝目前國內(nèi)需求55萬噸，產(chǎn)值88億生物質(zhì)生物煉制細(xì)胞工廠細(xì)胞工廠的生產(chǎn)模式實(shí)現(xiàn)One-Pot反應(yīng)，縮短石油化學(xué)品生產(chǎn)的工藝流程，減少原油資源消耗，降低投資成本，減少污染與CO2排放。分離裂化分離分離分離選擇性高效性含氧原料手性特征3-羥基丙酸石油5細(xì)胞工廠的挑戰(zhàn)復(fù)雜原料大量合成定向合成微量合成不能合成木糖阿拉伯糖半乳糖甘露糖葡萄糖(淀粉)產(chǎn)品合成能力精細(xì)原料目前生物煉制的經(jīng)濟(jì)競爭力與市場影響力有限原料利用能力葡萄糖時間濃度(g/L)100木糖利用速率:葡萄糖1/4轉(zhuǎn)化率:10-40%木糖微生物產(chǎn)量(g/L)130~150時間乙烯(?)3-羥基丙酸(?)丙烯酸(?)丁二酸乙醇谷氨酸檸檬酸丁醇6細(xì)胞工廠的構(gòu)建遺傳修飾設(shè)計策略代謝分析出發(fā)菌株細(xì)胞工廠高效利用生物質(zhì)高效生產(chǎn)目的產(chǎn)物細(xì)胞工廠構(gòu)建的策略7細(xì)胞工廠的構(gòu)建基于基因組序列數(shù)據(jù)、代謝組分析和通量組計算重構(gòu)代謝網(wǎng)絡(luò)，是構(gòu)建生物煉制細(xì)胞工廠的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，通過計算分析，確定其中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，可以設(shè)計出新的代謝工程策略，設(shè)法調(diào)節(jié)代謝流向目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量最大化的方向流動，從而構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠。8一、常用的工業(yè)微生物9一、常用的工業(yè)微生物1、細(xì)菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、乳酸、醋酸、氨基酸等。10一、常用的工業(yè)微生物2、酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬用于釀酒，制造面包，生產(chǎn)脂肪酶、食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。11一、常用的工業(yè)微生物3、霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點(diǎn)青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉用于生產(chǎn)酶制劑、抗生素、有機(jī)酸、甾體激素等。12一、常用的工業(yè)微生物4、放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌抗生素主要產(chǎn)生菌。13

5、未培養(yǎng)微生物※定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物。其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。一、常用的工業(yè)微生物14菌種的保藏在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價值的代謝產(chǎn)物能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。15在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：基本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥16要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。17不利

條件低溫干燥無氧缺營養(yǎng)創(chuàng)造不利于菌種生長的一切條件，使其代謝處于休眠狀態(tài)。18菌種保藏方法暫時保藏法

斜面?zhèn)鞔?/p>

穿刺法

長期保藏法

液體石蠟法甘油管法砂土管保藏法濾紙片保藏法冷凍干燥保藏法液氮冷凍法

1920斜面保藏冷凍干燥保藏液氮菌液氮保藏用程控降溫礦油斜面覆蓋保藏凍干菌種庫21國際重要菌種保藏機(jī)構(gòu)22中國菌種保藏單位232425二、發(fā)酵微生物生理學(xué)26微生物的遺傳和繁殖底物的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)微生物的代謝與調(diào)控脅迫條件下的響應(yīng)和耐受27葡萄糖酵解途徑丙酮酸有氧無氧乳酸糖異生途徑乳酸、氨基酸、甘油磷酸戊糖途徑磷酸核糖

+NADPH+H+培養(yǎng)基葡萄糖吸收H2O＋CO2ATP糖代謝的概況28乳酸糖酵解一次脫氫二次底物水平磷酸化已糖激酶6-磷酸果糖激酶-1丙酮酸激酶三個關(guān)鍵酶①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑾2930

NAD+NADH+H+NADH+HNADNADH

+

H++GDP+PiGTPFADH2FAD+NAD+CO2H2OCO2乙酰CoA(1)(6)(7)(8)(9)(4)(5)(2)檸檬酸異檸檬酸順烏頭酸α-酮戊二酸琥珀酰CoA琥珀酸延胡索酸蘋果酸草酰乙酸HO2(1)

檸檬酸合酶(2)(3)

順烏頭酸酶(4)異檸檬酸脫氫酶(5)α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(6)琥珀酰CoA合成酶(7)

琥珀酸脫氫酶(8)

延胡索酸酶(9)蘋果酸脫氫酶三羧酸循環(huán)H2OHSCoAHSCoAHSCoA一次底物水平磷酸化H2OH2O二次脫羧反應(yīng)三個不可逆反應(yīng)四次脫氫反應(yīng)123431(6)(4)(5)(1)(4)(5)丙酮酸羧化支路（回補(bǔ)途徑）三羧酸循環(huán)不僅是產(chǎn)生ATP的途徑，它產(chǎn)生的中間產(chǎn)物也是生物合成的前體。例如卟啉的主要碳原子來自琥珀酰CoA，谷氨酸、天冬氨酸是從α-酮戊二酸、草酰乙酸衍生而成。一旦草酰乙酸濃度下降，勢必影響三羧酸循環(huán)的進(jìn)行。

32由丙酮酸合成草酰乙酸(1)丙酮酸+CO2

+ATP

草酰乙酸+ADP+Pi+

CO2

+ATP+ADP+Pi丙酮酸羧化酶生物素、Mg2+由丙酮酸作為底物合成草酰乙酸33+

CO2NADPH+H+NADP+NAD+NADH+H+丙酮酸+CO2

蘋果酸草酰乙酸蘋果酸酶蘋果酸脫氫酶由丙酮酸合成草酰乙酸(2)34磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的催化下形成草酰乙酸。35脂肪葡萄糖、其它單糖三羧酸循環(huán)電子傳遞（氧化）蛋白質(zhì)脂肪酸、甘油多糖氨基酸乙酰CoAe-磷酸化+Pi

小分子化合物分解成共同的中間產(chǎn)物（如丙酮酸、乙酰CoA等）

共同中間物進(jìn)入三羧酸循環(huán),氧化脫下的氫由電子傳遞鏈傳遞生成H2O，釋放出大量能量，其中一部分通過磷酸化儲存在ATP中。大分子降解成基本結(jié)構(gòu)單位

生物氧化的三個階段NADPH36糖類脂類氨基酸和核苷酸之間的代謝聯(lián)系磷酸烯醇丙酮酸PEP丙酮酸生酮氨基酸-酮戊二酸核糖-5-磷酸

甘氨酸天冬氨酸谷氨酰氨丙氨酸甘氨酸絲氨酰蘇氨酸半胱氨酸

氨基酸6-磷酸葡萄糖磷酸二羥丙酮乙酰CoA甘油脂肪酸膽固醇亮氨酸賴氨酸酪酰氨色氨酸笨丙氨酸異亮氨酸亮氨酸色氨酸乙酰乙酰CoA脂肪核苷酸天冬氨酸天冬酰氨天冬氨酸苯丙酰氨酪氨酸異亮氨酸甲硫酰氨蘇氨酸纈氨酸琥珀酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸異檸檬酸乙醛酸蛋白質(zhì)淀粉、糖原核酸生糖氨基酸谷氨酰氨組氨酸脯氨酸精氨酸谷氨酸延胡索酸琥珀酸丙二單酰CoA1-磷酸葡萄糖3738代謝調(diào)節(jié)代謝調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)代謝速度改變細(xì)胞膜通透性影響酶活性相應(yīng)生理效應(yīng)[E]酶結(jié)構(gòu)改變酶合成酶分解誘導(dǎo)劑[E]酶結(jié)構(gòu)改變酶合成酶分解阻遏劑化學(xué)修飾抑制變構(gòu)（劑）化學(xué)修飾激活變構(gòu)（劑）快速調(diào)節(jié)：影響酶的結(jié)構(gòu)，快，但短暫，（幾秒－幾分）遲緩調(diào)節(jié)：影響酶量，慢而持久（幾小時）39三、發(fā)酵工業(yè)菌種篩選40三、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選※菌株分離：將混雜著各種微生物的樣品按照實(shí)際需要和菌株的特性采取迅速、準(zhǔn)確、有效的方法對它們進(jìn)行分離、篩選，進(jìn)而得到所需微生物的過程。41

1.菌種選擇的總趨勢野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發(fā)基因突變→基因重組的定向育種

（一）發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求42

※2.菌種選擇的要求能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且生成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收；

生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期較短；培養(yǎng)條件易于控制；抗噬菌體及雜菌污染的能力強(qiáng)；432.菌種選擇的要求（續(xù)）菌種不易變異退化（遺傳穩(wěn)定）；對放大設(shè)備的適應(yīng)性強(qiáng)；菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。44（二）分離篩選原理與技術(shù)1.篩選的指導(dǎo)思想2.分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個方面3.

新種分離篩選原理與技術(shù)451、篩選的兩種指導(dǎo)思想

先分離純化，再結(jié)合工藝要求進(jìn)行篩選。分離純化同時富于篩選條件，一步得出所需菌株。結(jié)果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株

462、分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌；

生產(chǎn)中長期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；從保藏機(jī)構(gòu)獲取菌種從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。473、新種分離與篩選的步驟土樣的采取→預(yù)處理→培養(yǎng)→菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大?如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn)?目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：48

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點(diǎn)分

選擇性分離方法 隨機(jī)分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測系統(tǒng)進(jìn)行間接分離）

富集培養(yǎng)

菌種純化

復(fù)篩49

菌種純化初步工藝條件摸索再復(fù)篩生產(chǎn)性能測試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)試驗(yàn)?zāi)承┍匾囼?yàn)和或作為育種的出發(fā)菌株毒性試驗(yàn)等

50(1)、含微生物樣品的采集1、采樣時應(yīng)注意的問題:土壤微生物的分布土壤的有機(jī)質(zhì)含量和通風(fēng)情況土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度2、對于分離篩選新菌種，還存在另兩個選擇標(biāo)準(zhǔn)：土壤來源廣泛在已適應(yīng)相當(dāng)苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種51（2）、樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過濾法；離心法化學(xué)方法：化學(xué)成分增加特定微生物的數(shù)量誘餌法：富集目的菌52（3）、分離方法的選擇根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養(yǎng)特征獨(dú)特

生長特征獨(dú)特

無選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進(jìn)行

隨機(jī)分離選擇性分離

53

A、選擇性分離原理和技術(shù)1、生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

542、選擇性分離技術(shù)富集培養(yǎng)施加選擇壓力，進(jìn)行定向篩選

A、選擇性分離原理和技術(shù)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件如：篩選真菌時加抑制細(xì)菌的抗生素55B、隨機(jī)分離原理與技術(shù)從產(chǎn)物入手，通過設(shè)計高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機(jī)分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術(shù)關(guān)鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應(yīng)篩選方法的確定。隨機(jī)分離技術(shù)舉例抗生素產(chǎn)生菌的篩選生長因子產(chǎn)生菌的篩選56抗生素產(chǎn)生菌的篩選：正篩選篩選模型：試驗(yàn)菌篩選方法：鋪菌法復(fù)印平板法液體培養(yǎng)篩選

抗藥性篩選固體培養(yǎng)篩選57生長因子產(chǎn)生菌的篩選

篩選模型：營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌

篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進(jìn)營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌生長58氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個單菌落復(fù)印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應(yīng)到copy前相應(yīng)

u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進(jìn)行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株59放線菌的分離：

以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例

（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產(chǎn)菌恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)菌的特點(diǎn)，選擇目的菌落放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測試篩選模型：形態(tài)依據(jù)60真菌的分離篩選：以啤酒酵母的分離為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h

形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點(diǎn)進(jìn)行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板分離法進(jìn)一步純化，至少反復(fù)三次

①生成子囊孢子速度測定 ②發(fā)酵力測定性能測定③熱死溫度測定

④凝集力測定

⑤雙乙酰含量測定61四、發(fā)酵工業(yè)菌種改良62發(fā)酵工程的基本思路：為了實(shí)現(xiàn)某種工業(yè)目的(生產(chǎn)某種產(chǎn)品或降解有毒物質(zhì))，從自然界中篩選微生物并通過遺傳手段改善其工業(yè)性能。63菌種選育改良的具體目標(biāo)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品四、發(fā)酵工業(yè)菌種改良64

發(fā)酵工業(yè)菌種改良方法常規(guī)育種(誘變育種)細(xì)胞工程育種基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基因工程育種蛋白質(zhì)工程育種代謝工程育種

65出發(fā)菌株的選擇工業(yè)上用來進(jìn)行誘變處理的菌株，稱為出發(fā)菌株（parentstrain）。一般有三種：菌懸液的制備誘變變異菌株的分離和篩選（一）、誘變選育的程序前培養(yǎng)從自然界分離得到的野生型菌株；通過生產(chǎn)選育，即由自發(fā)突變經(jīng)篩選獲得的高產(chǎn)菌株；已經(jīng)誘變過的菌株。66（二）、誘變育種方案設(shè)計1、出發(fā)菌株的選擇純種：排除異核體或異質(zhì)體的影響。有利于合成發(fā)酵產(chǎn)物：不僅選產(chǎn)量高的，還要考慮其他因素，如產(chǎn)孢子早而多，色素多或少，生長速度快等。對誘變劑敏感且變異幅度廣：可以提高變異頻率，而且高產(chǎn)突變株的出現(xiàn)率也大。672、誘變劑的種類和選擇物理誘變劑化學(xué)誘變劑各種射線，如紫外線（焦耳）、X射線（庫侖/千克）、β射線、γ射線、α射線和超聲波等甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥等。一般正突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)突變則較多出現(xiàn)于偏高劑量中。對于經(jīng)過多次誘變而提高了產(chǎn)量的菌株，在較高劑量負(fù)突變率更高。目前處理劑量采用的死亡率為70～80％。68各種化學(xué)誘變劑常用的劑量和處理時間誘變劑誘變劑的劑量處理時間緩沖劑中止反應(yīng)方法亞硝酸（HNO2）0.01～0.1mol/L5～10minpH值4.5，1mol/L醋酸緩沖液pH8.6，0.07磷酸二氫鈉硫酸二乙酯（DES）0.5～1％10～30min，孢子18～24hpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋甲基磺酸乙酯（EMS）0.05～0.5mol/L10～60min，孢子3～6hpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液硫代硫酸鈉或大量稀釋亞硝基胍（NTG）0.1～1.0mol/mL，孢子3mg/mL15～60min，90～120minpH值7.0，0.1mol/L磷酸緩沖液或Tris緩沖液大量稀釋亞硝基甲基胍（NMU）0.1～1.0mol/mL15～90minpH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸緩沖劑或Tris緩沖液大量稀釋氮芥0.1～1.0mol/mL5～10minNaHCO3甘氨酸或大量稀釋乙烯亞胺1:1000～1:1000030～60min硫代硫酸鈉或大量稀釋羥胺（NH2OH?HCl）0.1～0.5％數(shù)小時或生長過程中誘變大量稀釋氯化鋰（LiCl）0.3～0.5％加入培養(yǎng)基中，在生長過程中誘變大量稀釋秋水仙堿（C22H25NO6）0.01～0.2％加入培養(yǎng)基中，在生長過程中誘變大量稀釋693、突變的誘發(fā)A、誘變劑接觸DNA分子B、DNA損傷的修復(fù)C、從突變到突變型光復(fù)活作用切補(bǔ)修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)系統(tǒng)DNA多聚酶的校正作用（表型延遲：誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，故某一突變還是無法反映在當(dāng)代的表型上，只有當(dāng)經(jīng)過DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂后，這一變異才會在表型上表達(dá)出來，于是出現(xiàn)了不純菌落。）704、篩選A、制定篩選方案方案設(shè)計的中心內(nèi)容是確定誘變篩選流程。71B、營養(yǎng)缺陷型的篩選方法一般經(jīng)誘變后，再經(jīng)中間培養(yǎng)、淘汰野生型、檢出營養(yǎng)缺陷型、確定生長譜等。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法（青霉素對細(xì)菌、制霉菌素對真菌）、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出方法有：逐個測定法、夾層平板法、限量營養(yǎng)法和影印接種法等。72逐個檢出法：負(fù)篩選基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷型在補(bǔ)充培養(yǎng)基上進(jìn)一步鑒定73※(三）誘變育種應(yīng)考慮的因素1、選擇合適的出發(fā)菌株合適的出發(fā)菌株就是通過育種能有效地提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的菌株。出發(fā)菌株最好已具備一些有利的性狀，如生長速度快、營養(yǎng)要求低和產(chǎn)孢子早而多的菌株。742、復(fù)合誘變劑的使用復(fù)合處理可以將兩種或多種誘變劑分先后或同時使用，也可用同一誘變劑重復(fù)使用。誘變劑復(fù)合處理的效果往往好于單獨(dú)處理。753、誘變劑劑量的選擇僅僅采用誘變劑的理化指標(biāo)控制誘變劑的用量常會造成偏差，不利于重復(fù)操作。不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同就一般微生物而言，突變率隨劑量的增大而增高，但達(dá)到一定劑量后，再加大劑量反而會使突變率下降。4、變異菌株的篩選一般要經(jīng)過初篩和復(fù)篩兩個階段。76初篩：誘變后→稀釋→涂布平板→培養(yǎng)→挑單個菌落到斜面→培養(yǎng)→將斜面上的菌落逐個接種到搖瓶→振蕩培養(yǎng)→測抗生素效價→

超過對照效價10%以上的菌種，進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩：過程與初篩基本相同，不同的是一般將斜面上的單個菌落接種到三個搖瓶中，得出平均效價。復(fù)篩可進(jìn)行1～3次。由此篩選出的高產(chǎn)穩(wěn)定菌種還要經(jīng)過小型甚至中型試驗(yàn)，才能用到發(fā)酵生產(chǎn)中。77傳統(tǒng)菌種改造技術(shù)的缺陷會產(chǎn)生大量不需要的突變?nèi)狈︶槍π再M(fèi)時、費(fèi)力、費(fèi)錢：每輪誘變育種可能要篩選>105

突變株78菌種改造的新技術(shù)代謝工程系統(tǒng)生物學(xué)79代謝工程的定義利用多基因重組技術(shù)有目的地對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個新的學(xué)科領(lǐng)域。又稱作途徑工程，是多基因的基因工程?；舅枷胧牵焊鶕?jù)已有的遺傳和生化知識，找出限速步驟，進(jìn)行遺傳操作80代謝工程發(fā)展基礎(chǔ)

代謝網(wǎng)絡(luò)理論：是把細(xì)胞的生化反應(yīng)以網(wǎng)絡(luò)整體，而不是孤立地來考慮。代謝網(wǎng)絡(luò)分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點(diǎn)，其中對終產(chǎn)物合成起決定作用的少數(shù)節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)下游分支的可變程度，節(jié)點(diǎn)分為：柔性節(jié)點(diǎn)：解除一個分支的反饋抑制可提高該分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。剛性節(jié)點(diǎn)：其下游各分支的比例不易改變。半柔性節(jié)點(diǎn)：須降低主分支的酶活并同時提高次分支的酶活或解除其反饋抑制，才可提高次分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。81代謝工程：定向改造微生物的自然能力以生產(chǎn)(降解)某種物質(zhì)為目標(biāo)的工業(yè)生物技術(shù)，需要拓展底物利用能力和范圍引入新的合成途徑，或延伸已有途徑減少副產(chǎn)物形成；提高產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度改善細(xì)胞生理功能傳統(tǒng)育種：隨機(jī)突變，非理性設(shè)計代謝工程：定向遺傳修飾，理性設(shè)計82代謝工程策略碳水化合物原料丙酮丁醇C2酸C2醇C2CoAC3酮酸C2醛C2~PC3酮酸~PC3酸~PC4CoAC3酮C4醇C6糖~PC3醛~PC6糖~PC6糖~P利用系統(tǒng)生物學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)新的支路途徑和調(diào)控位點(diǎn)酸~PC3二醇C3羥酮~PC4酸C5酮酸C4CoAC6酸

設(shè)計新的代謝工程策略83代謝工程策略C3烯酰CoAC3羥酸C3烯酸碳水化合物原料C2酸C2醇C2CoAC3酮酸C2醛C2~PC3酮酸~PC3酸~PC4CoAC3酮C4醇C6糖~PC3醛~PC6糖~PC6糖~P酸~PC3二醇C3羥酮~PC4酸C5酮酸C4CoAC6酸C3烯酰CoAC3羥酸C3烯酸丙烯酸實(shí)現(xiàn)代謝途徑重構(gòu)丙酮丁醇84遺傳修飾設(shè)計策略代謝分析出發(fā)菌株高效生產(chǎn)菌株代謝工程的基本思路設(shè)計策略是基礎(chǔ)遺傳修飾是關(guān)鍵85設(shè)計策略：正向(Constructive)代謝工程

1991年在Science上正式提出，基本思想是：根據(jù)已有的遺傳和生化知識，找出限速步驟，進(jìn)行遺傳操作86正向代謝工程：重新分配中心途徑代謝流PyruvateLactateSugarldhNADHNAD+XNADHNAD+L-alaninealadfromBacillusNH4+AlanineracemaseX乳酸乳球菌以同型發(fā)酵方式，將95%以上的葡萄糖轉(zhuǎn)化為L-乳酸將乳酸脫氫酶（LDH）敲除，然后再表達(dá)丙氨酸脫氫酶，并敲除丙氨酸消旋酶，可以將原來到L-乳酸的碳流重新分配到L-丙氨酸（甜味劑）實(shí)現(xiàn)同型乳酸發(fā)酵到同型丙氨酸發(fā)酵。87設(shè)計策略：反向(Inverse)代謝工程

1996年首次提出，基本思想是：對實(shí)驗(yàn)室菌株（或野生型）的突變、定向進(jìn)化和定向篩選，獲得預(yù)期的表型，并確定其基因型選擇工業(yè)菌株并對其相應(yīng)基因進(jìn)行遺傳操作，以期獲得同樣的表型88反向代謝工程：基因組測序發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)日本學(xué)者對兩株谷氨酸棒桿菌（一株是生長較差但能高產(chǎn)賴氨酸的突變株、另一株為生長良好的野生型）進(jìn)行全基因組測序找出突變株與野生型不同、且有可能影響賴氨酸生產(chǎn)的突變基因然后將這些突變導(dǎo)入野生型，結(jié)果獲得了迄今為止最高水平的賴氨酸生產(chǎn)率3gL-1h-1這是利用組學(xué)進(jìn)行反向代謝工程研究的第一個例子89設(shè)計策略：進(jìn)化(Evolutionary)代謝工程基因組重排于2002年正式提出引發(fā)NatureBiotechnol.評論90代謝工程設(shè)計改變代謝流擴(kuò)展代謝途徑構(gòu)建新的代謝途徑911，改變代謝途徑改變代謝途徑是指改變分支代謝途徑的流向，阻斷其他代謝產(chǎn)物的合成，以達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物的目的。改變代謝途徑有多種方法：加速限速反應(yīng)；改變分支代謝途徑流向；構(gòu)建代謝旁路；改變能量代謝途徑等。92（1）加速限速反應(yīng)最成功的一個例子是頭孢霉素C的代謝工程菌的構(gòu)建。青霉素N是頭孢霉素合成的中間體。當(dāng)用頂頭孢霉發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)了青霉素N的積累，這表明下一步酶反應(yīng)是頭孢霉素合成代謝中的限速步驟。因此克隆了編碼脫乙酰氧基頭孢霉素C合成酶基因cefEF，并導(dǎo)入頂頭孢中，所得轉(zhuǎn)化子的頭孢霉素C產(chǎn)量提高了25％，而青霉素N的積累量減少至原來的1/16。93頂頭孢霉發(fā)酵青霉素N頭孢霉素Cα-氨基己二酸頭孢霉素C的代謝工程菌的構(gòu)建

中間產(chǎn)物克隆了編碼脫乙酰氧基頭孢霉素C合成酶基因cefEF青霉素N頭孢霉素C限速步驟所得轉(zhuǎn)化子頭孢霉素C產(chǎn)量提高了25％，而青霉素N的積累量減少至原來的1/16。

94（2）改變分支代謝途徑流向是指提高代謝分支點(diǎn)的某一代謝途徑酶系的活性，在與另外的分支代謝途徑的競爭中占據(jù)優(yōu)勢，亦可提高目的末端代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。95如：賴氨酸合成，選育解除反饋抑制和缺失高絲氨酸脫氫酶的突變株，提高了賴氨酸的產(chǎn)量。而為了獲得蘇氨酸的高產(chǎn)菌株，以解除了反饋抑制的賴氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌為宿主，轉(zhuǎn)入高絲氨酸脫氫酶基因，結(jié)果使原來不產(chǎn)生蘇氨酸的賴氨酸產(chǎn)生菌的賴氨酸產(chǎn)量由65g/L下降至4g/L，而蘇氨酸產(chǎn)量增加到52g/L，使賴氨酸產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)變成蘇氨酸產(chǎn)生菌。96高絲氨酸脫氫酶基因賴氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌產(chǎn)生菌的賴氨酸產(chǎn)量由65g/L下降至4g/L，蘇氨酸產(chǎn)量增加到52g/L，賴氨酸產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)變成蘇氨酸產(chǎn)生菌。972，轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑將催化一系列反應(yīng)的多個酶基因，克隆到不能產(chǎn)生某種新的化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物的微生物中，使之獲得產(chǎn)生新的化合物的能力；利用基因工程手段，克隆少數(shù)基因，使細(xì)胞原來無關(guān)的兩條代謝途徑聯(lián)結(jié)起來，形成新的途徑，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物；將催化某一代謝途徑的基因組克隆到另一生物中，使之發(fā)生代謝轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生目的產(chǎn)物。98PyruvateLactateSugarldhNADHNAD+XNADHNAD+L-alaninealadfromBacillusNH4+AlanineracemaseX乳酸乳球菌以同型發(fā)酵方式，將95%以上的葡萄糖轉(zhuǎn)化為L-乳酸將乳酸脫氫酶（LDH）敲除，然后再表達(dá)丙氨酸脫氫酶，并敲除丙氨酸消旋酶，可以將原來到L-乳酸的碳流重新分配到L-丙氨酸（甜味劑）99通過插入基因使L-乳酸產(chǎn)生菌獲得新能力—產(chǎn)L-丙氨酸。3，擴(kuò)展代謝途徑定義：指在引入外源基因后，使原來的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的末端產(chǎn)物?；蚴乖瓉淼拇x途徑向前延伸，可以利用新的原料合成代謝產(chǎn)物。100綜合設(shè)計策略：1,3-丙二醇3-磷酸甘油醛丙酮酸葡萄糖TCA循環(huán)磷酸二羥丙酮3-磷酸甘油甘油酵母的甘油途徑大腸桿菌自身的代謝途徑1,3-丙二醇3-羥基丙醛肺炎桿菌的1,3-丙二醇途徑修飾了>70個基因，最后工程菌中有18個基因被敲除或過量表達(dá)

1,3-丙二醇產(chǎn)量135g/L，生產(chǎn)率3.5g/L/h101作業(yè)為何要進(jìn)行發(fā)酵工業(yè)菌種改良？方法或技術(shù)主要有哪些？代謝工程的定義？開展代謝工程育種主要有哪些策略？102第四節(jié)微生物原生質(zhì)體育種與基因組改組育種原生質(zhì)體的概念中文名稱：原生質(zhì)體英文名稱：protoplast定義：脫去細(xì)胞壁的植物、真菌或細(xì)菌細(xì)胞。動物細(xì)胞是天生的原生質(zhì)體嗎？原生質(zhì)體育種的優(yōu)勢原生質(zhì)體具有的新特性：與正常細(xì)胞相比，由于原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁，因而具有一些新的特征：對誘變劑敏感對噬菌體不敏感不受感受態(tài)影響育種優(yōu)勢原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種的種類原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生育種原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體誘變育種原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種的種類原生質(zhì)體再生育種原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體誘變育種原生質(zhì)體制備破壁原生質(zhì)體制備活性鑒定分離

純化原生質(zhì)體制備的方法：關(guān)鍵是細(xì)胞壁的去除收集原生質(zhì)體的制備是指通過物理、化學(xué)的方法將微生物細(xì)胞壁破碎釋放出原生質(zhì)體的過程。原生質(zhì)體制備：影響因素培養(yǎng)基組成：加入特定物質(zhì)松散細(xì)胞壁菌齡：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞放線菌在加甘氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后較易使酶類滲入細(xì)胞壁，進(jìn)而破壞細(xì)胞壁釋放出原生質(zhì)體；黑曲霉在限制性培養(yǎng)基或綜合性培養(yǎng)基中分離原生質(zhì)體的數(shù)量會顯著地增加。一般對數(shù)生長期的微生物代謝旺盛、細(xì)胞壁對酶解作用敏感，易于制備原生質(zhì)體。原生質(zhì)體制備：影響因素酶解前預(yù)處理：抑制細(xì)胞壁成分在霉菌中加入脂肪酶除去細(xì)胞壁上的脂肪層；

在酵母菌中加入EDTA或者β-巰基乙醇還原細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的二硫鍵，使分子鏈切開，酶分子易于滲入；

在放線菌中加入甘氨酸錯誤替代丙氨酸干擾細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成；在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入亞致死劑量的青霉素抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成；對革蘭氏陰性菌而言，由于其細(xì)胞壁中還有脂多糖和多糖類，因此，采用EDTA預(yù)處理后加溶菌酶。目的：？？使酶更容易滲入細(xì)胞壁進(jìn)行酶解原生質(zhì)體制備：影響因素滲透壓：穩(wěn)定原生質(zhì)體酶濃度：根據(jù)細(xì)胞壁成分用不同濃度的不同酶原生質(zhì)體處于高滲溶液中才能避免吸水而漲破。常用的無機(jī)鹽穩(wěn)定劑有NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2等，有機(jī)物中蔗糖、甘露糖、山梨醇等都是有效地穩(wěn)定劑。細(xì)菌和放線菌主要由溶菌酶來破壁，霉菌可以用蝸牛酶、纖維素酶破壁，酵母菌可以使用蝸牛酶、β-葡聚糖酶等破壁。等滲與低滲溶液中原生質(zhì)體的制備結(jié)果

原生質(zhì)體制備效果實(shí)例原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種的種類原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體誘變育種原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生育種出發(fā)菌株選擇菌種活化和預(yù)培養(yǎng)原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生高產(chǎn)菌株分離原生質(zhì)體再生育種原生質(zhì)體再生是指原生質(zhì)體重新合成細(xì)胞壁物質(zhì)，恢復(fù)其完整的細(xì)胞形態(tài)的過程。原生質(zhì)體懸浮液未酶解的細(xì)菌無菌水稀釋高滲溶液稀釋高滲溶液稀釋培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)總菌落數(shù)(A)未原生質(zhì)化細(xì)胞（B)再生菌落(C)再生率（%）=×100%C－BA－B再生率及其計算原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種的種類原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生育種原生質(zhì)體誘變育種原生質(zhì)體融合育種出發(fā)菌株選擇菌種活化和預(yù)培養(yǎng)原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生高產(chǎn)菌株分離原生質(zhì)體誘變育種原生質(zhì)體再生前進(jìn)行誘變誘變?yōu)槭裁丛|(zhì)體誘變效果很好？原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種的種類原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生育種原生質(zhì)體誘變育種原生質(zhì)體融合育種定義：指用自然或人工方法、使兩個或更多個不同的細(xì)胞融合成一個細(xì)胞的過程，又稱為體細(xì)胞雜交原生質(zhì)體融合育種提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量提高菌株降解能力提高菌株抗受性改良菌種的遺傳特性獲得新代謝途徑和性狀打破了微生物的種界界限，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組。可使遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機(jī)會?？膳c其他育種方法相結(jié)合，如把常規(guī)誘變和原生質(zhì)體誘變所獲得的優(yōu)良性狀，組合到一個單株中。原生質(zhì)體融合育種意義：原生質(zhì)體融合方法自發(fā)融合誘導(dǎo)融合融合概率低，一般不推薦化學(xué)誘導(dǎo)融合電誘導(dǎo)融合激光誘導(dǎo)融合不需要儀器，操作簡單，但PEG對細(xì)胞有毒無毒無害，直觀操作，融合率較高，但所需的設(shè)備費(fèi)用較貴毒性小，損傷小，但由于其所需設(shè)備昂貴復(fù)雜，技術(shù)難度大原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合子的篩選利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選融合子利用抗藥性標(biāo)記篩選融合子利用滅活標(biāo)記篩選融合子利用熒光染色標(biāo)記篩選融合子利用某些特殊的生理特征作為標(biāo)記篩選融合子利用其他標(biāo)記篩選融合子標(biāo)記不同熒光，利用熒光顯色篩選融合子將帶有不用熒光色素的親本原生質(zhì)體融合，然后挑選同時具有雙親染色的兩種熒光色素的融合體。融合原生質(zhì)體懸浮液稀釋完全再生培養(yǎng)基選擇性再生培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)重組體×100%融合率（%）=選擇性培養(yǎng)基上再生的菌落數(shù)完全培養(yǎng)基上再生的菌落數(shù)融合率的計算原生質(zhì)體育種從原生質(zhì)體育種到基因組改組育種基因組改組育種基因組改組育種基因組改組是經(jīng)典微生物誘變育種技術(shù)與原生質(zhì)體融合技術(shù)的有機(jī)結(jié)合。首先對微生物菌體進(jìn)行誘變，篩選出正向突變菌株，然后通過原生質(zhì)體“遞推式融合”使正向突變的若干個菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選出符合育種要求的融合子基因組改組發(fā)展簡史1994年,Stemmer首先提出了在體外定向進(jìn)化分子的方法--DNAshuffling技術(shù)。其方法是

將同源的DNA用DNAaseI進(jìn)行消化成片段,然后將得到的隨機(jī)片段無引物PCR,使之重新隨機(jī)裝配,從而獲得了多種排列組合的突變基因庫,最后利用設(shè)計好的引物PCR,得到預(yù)期的重組體。

A-B-C-D-E-F-GA-D-B-G-C-F-E全基因組改組技術(shù)1998年，Stemmer等又提出了genome-shuffling(全基因組改組)全基因組改組技術(shù)是建立在原生質(zhì)體融合技術(shù)基礎(chǔ)之上的一種菌種選育新技術(shù).首先選擇一個原始親株，通過經(jīng)典的誘變育種方法獲得多個表型得到提高的菌株，構(gòu)建突變候選株文庫;以這些表型提高的菌株作為首輪多親本融合的直接親株，然后進(jìn)行多親株融合，使其全基因組進(jìn)行隨機(jī)重組，獲得第一代融合株；再從中選擇表型獲得進(jìn)一步提高的菌株作為下一輪融合的直接親本，依此類推進(jìn)行多輪的多親株融合;最終從獲得的突變體庫中篩選出性狀被提升的目的菌株基因工程育種131

一、基因工程概述二、載體三、基因工程酶系四、主要步驟主要內(nèi)容基因工程育種概述基因工程——又稱遺傳工程，即利用DNA重組技術(shù)的方法。把DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外源基因DNA在宿主細(xì)胞中隨細(xì)胞的繁殖而增殖（cloning，克?。?，或最后得到表達(dá)，最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。134奠定基因工程的三項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)DNA的特異切割

Smith和Nathans獲1978年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎DNA的分子克隆

Berg（1972）將猴病毒SV40DNA與λ噬菌體基因融合，成功構(gòu)建重組DNA；

Cohen和Boyer（1973）將質(zhì)粒pSC101與R的tetrkmr基因融合，并將重組DNA轉(zhuǎn)化E.coli，首次實(shí)現(xiàn)了DNA的分子克隆。DNA的快速測序

Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化學(xué)法DNA快速測序技術(shù)

1980年諾貝爾化學(xué)獎：Berg,Gilbert,Sanger135分離或合成基因；通過體外重組將基因插入載體；將重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞；篩選重組體克隆；對克隆的基因進(jìn)行鑒定或測序；控制外源基因的表達(dá)；得到基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物基因工程操作的主要步驟基因工程DNA提取離體切割載體DNA分子連接導(dǎo)入受體細(xì)胞重組體重組體形狀表達(dá)得到新的物種1、基因分離提取目的基因——密度梯度超速離心等方法分別提取所需要的DNA（目的基因）和作為載體的松弛型細(xì)菌質(zhì)粒。處理目的基因——加入專一性很強(qiáng)的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行處理，從而獲得帶有特定基因并暴露出黏性末端的DNA單鏈部分。DNA分子的切割與連接2、體外重組目的基因5～6℃

DNA連接酶

環(huán)狀重組體細(xì)菌質(zhì)粒混合“退火”

復(fù)制能力）（a）粘性末端連接：用同一種限制性內(nèi)切酶或者用能夠產(chǎn)生相同粘性末端的兩種限制性內(nèi)切酶分別消化外源DNA分子和載體，所形成的DNA末端彼此互補(bǔ)，用DNA連接酶共價連接起來，形成重組體DNA分子。

（b）平頭末端連接：將平末端的DNA分子在T4DNA連接酶催化下，使DNA分子的3′OH和5′P進(jìn)行共價結(jié)合。（c）人工接頭法：指利用人工接頭加在平端DNA片段的兩端，然后用相應(yīng)限制酶切割人工接頭以產(chǎn)生黏性末端，再與帶相同黏性末端的載體相連。

（d）同源多聚尾連接法：在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化下，在線型載體分子的兩端加上單一核苷酸如dG組成的多聚尾；而在目的DNA分子的兩端加上dC尾，兩者混合退火，然后經(jīng)DNA聚合酶Ⅰ或Klenow填補(bǔ)裂口處缺失的核苷酸，再通過DNA連接酶修復(fù)成環(huán)狀的雙鏈DNA。

3、載體傳遞通過載體把供體的遺傳基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞內(nèi)。載體需具有自我復(fù)制的能力。4、復(fù)制和表達(dá)通過自我復(fù)制得到擴(kuò)增，并使受體細(xì)胞表達(dá)出供體細(xì)胞所固有的遺傳特性，成為“工程菌”。系統(tǒng)生物學(xué)143定義(Definition)學(xué)科背景(Background)內(nèi)容體系和研究方法(Contents&Methods)定義(Definition)系統(tǒng)生物學(xué)利用一系列的原理與方法學(xué)來研究分子行為與系統(tǒng)特性與功能的關(guān)系，通過計算生物學(xué)來定量闡明和預(yù)測生物的功能、表型和行為。

Systemsbiologyisadisciplinetostudythespatial-temporalinteractionsofcomponentsindifferentlevelsofbiologicalsystems,seekingtofindthelawsintheorganizationprinciples,dynamicbehaviorsandemergentpropertiesofsuchbiologicalsystems.WhatisSystemsBiology?Systemsbiologyisanemergentfieldthataimsatsystem-levelunderstandingofbiologicalsystems.HiroakiKitano（北野宏明）Ph.DProjectDirector.SonyComputerScienceLaboratoriesScience,295,

1662-1664(2002).Tounderstandbiologyatthesystemlevel,wemustexaminethestructureanddynamicsofcellularandorganismalfunction,ratherthanthecharacteristicsofisolatedpartsofacellororganism.1948年，控制論之父NorbertWiener提出生物系統(tǒng)和控制系統(tǒng)可以用同樣的科學(xué)方法進(jìn)行研究20世紀(jì)60年代生物化學(xué)系統(tǒng)理論（BST）

20世紀(jì)70年代謝控制理論（MCT）21世紀(jì)的系統(tǒng)生物學(xué)穩(wěn)態(tài)或擬穩(wěn)態(tài)理論、模型的數(shù)據(jù)不充分分子生物學(xué)、基因組測序以及高通量測量技術(shù)的進(jìn)展，使生物信息系統(tǒng)（BIS）的建立成為可能人類基因組計劃和各種組學(xué)技術(shù)把生物學(xué)帶入系統(tǒng)科學(xué)的時代

分子生物學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)還原主義將生物學(xué)還原到分子水平

整體主義從系統(tǒng)層次上理解生物系統(tǒng)研究對象是生物系統(tǒng)的組成部分（個別基因、個別蛋白質(zhì)）研究對象是組成部分的相互作用或部分之間關(guān)系——本質(zhì)上就是信息

148側(cè)重從實(shí)驗(yàn)中獲取數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的挖掘（datamining）實(shí)驗(yàn)的深層次成果往往被忽視

獲得深層次成果，理論創(chuàng)新

分子生物學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)149背景學(xué)科生理學(xué)分子生物學(xué)生物信息學(xué)組學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)方法系統(tǒng)生物學(xué)與合成生物學(xué)的關(guān)系

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