生物菌種與擴(kuò)大培養(yǎng)

關(guān)于生物菌種與擴(kuò)大培養(yǎng)第一頁，共九十三頁，2022年，8月28日1一、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物1.細(xì)菌(bacteria)枯草芽孢桿菌-----生產(chǎn)淀粉酶與蛋白酶北京棒桿菌、鈍齒棒桿菌----生產(chǎn)谷氨酸醋酸桿菌----生產(chǎn)醋酸嗜酸芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌----生產(chǎn)普魯蘭酶地衣芽孢桿菌---耐高溫a-淀粉酶假單胞菌、短桿菌小球菌等----生產(chǎn)有機(jī)酸明串珠菌----生產(chǎn)聚葡萄糖、聚果糖、聚甘露糖蘇云金桿菌-----生產(chǎn)殺蟲劑細(xì)菌浸礦第二頁，共九十三頁，2022年，8月28日2乳酸桿菌應(yīng)用：乳酸、干酪、奶子酒、發(fā)面、泡菜、酸奶等的制作乳酸菌由糖類生成乳酸的一類細(xì)菌。以鏈球菌(Streptococcus)、四聯(lián)球菌(Pediococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、乳桿菌(Lactobacillus)等屬為重要，都是革蘭氏陽性、不運(yùn)動(dòng)性及異養(yǎng)厭氧型。分兩個(gè)亞族：鏈球菌亞屬(Streptococeae)，其中有些菌種只產(chǎn)生乳酸，稱為同型乳酸發(fā)酵；另一些菌種除生成乳酸外還生成醋酸、乙醇及二氧化碳，稱為異型乳酸發(fā)酵(明川串株菌屬)。乳桿菌亞屬(Lactobacilleae)，其中的德氏乳桿菌(L.pasterianus)等菌株廣泛用于乳制品工業(yè)和乳酸生產(chǎn)。第三頁，共九十三頁，2022年，8月28日3芽孢桿菌

芽孢桿菌是高產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的產(chǎn)生菌，如枯草芽孢桿菌BF7658是生產(chǎn)淀粉酶的主要菌種，枯草芽孢桿菌AS1.398是生產(chǎn)中性蛋白酶和制造日本獨(dú)特風(fēng)味食品納豆的主要菌種。它們還可用來生產(chǎn)多肽類抗生素、氨基酸、維生素B12及2，3-丁二醇、果膠酶等

枯草芽孢桿菌地衣芽孢桿菌第四頁，共九十三頁，2022年，8月28日4食品納豆第五頁，共九十三頁，2022年，8月28日5梭狀芽孢桿菌梭狀芽孢桿菌是土壤中生芽孢的厭氧桿菌，用來由淀粉或糖發(fā)酵生產(chǎn)丁二醇、丙酮、丁醇、乙醇、某些有機(jī)酸及核黃素等。人們還利用耐熱梭狀芽孢桿菌和熱解糖梭菌從纖維素和半纖維素生產(chǎn)酒精。

第六頁，共九十三頁，2022年，8月28日6鈍齒棒桿菌AS1.542的應(yīng)用：能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、水楊苷、七葉靈以及乙酸、檸檬酸、乳酸、葡萄糖酸、延明羧酸等多種有機(jī)酸作為碳源迅速進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，不分解淀粉、纖維素、油酯和明膠。銨鹽和尿素均可作為氮源，能還原硝酸鹽，不同化酪蛋白。要求多種無機(jī)離子，需要生物素作為生長因素。好氧或兼性厭氧，過氧化氫酶反應(yīng)陽性。20～37℃生長良好，39℃生長微弱，最適生長溫度30℃。pH6～9生長良好，pH10生長減弱，pH4～5不生長。在含7.5%NaCl或2.5%尿素肉汁培養(yǎng)基中生長良好，10%NaCl和3%尿素生長受到抑制。不受北京棒桿菌1.299的噬菌體侵染。產(chǎn)氨短桿菌它是氨基酸、核苷酸工業(yè)生產(chǎn)中常用的菌種，也是酶法合成生產(chǎn)輔酶A的菌種。

谷氨酸棒桿菌第七頁，共九十三頁，2022年，8月28日7甲烷產(chǎn)生菌主要是甲烷桿菌(Methanobacterium)、甲烷八疊球菌(Methanosarcina)、甲烷球菌(Methanococcus)，這些甲烷菌在有機(jī)廢料甲烷發(fā)酵中起重要作用?？莶菅挎邨U菌-----生產(chǎn)淀粉酶與蛋白酶北京棒桿菌、鈍齒棒桿菌----生產(chǎn)谷氨酸醋酸桿菌----生產(chǎn)醋酸嗜酸芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌----生產(chǎn)普魯蘭酶地衣芽孢桿菌---耐高溫a-淀粉酶假單胞菌、短桿菌小球菌等----生產(chǎn)有機(jī)酸明串珠菌----生產(chǎn)聚葡萄糖、聚果糖、聚甘露糖蘇云金桿菌-----生產(chǎn)殺蟲劑第八頁，共九十三頁，2022年，8月28日8醋酸菌醋酸菌不生芽孢、革蘭氏陰性，好氧，分兩個(gè)菌群。一個(gè)菌群只將乙醇氧化生成醋酸，醋酸是最終產(chǎn)品，同時(shí)它也能將葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，一般稱之為醋單胞菌(Acetomonas)或葡萄糖桿菌(Gluconobacter)。另一群醋酸菌不僅能將乙醇氧化為醋酸，而且能將產(chǎn)生的醋酸進(jìn)一步氧化生成二氧化碳和水，這一類菌就叫醋酸桿菌。第九頁，共九十三頁，2022年，8月28日9醋酸菌的應(yīng)用：主要醋酸菌種有：

（1）紋膜醋酸桿菌（A.aceti）:培養(yǎng)時(shí)液面形成乳白色、皺褶狀的粘性菌膜。搖動(dòng)時(shí)，液體變混。能產(chǎn)生葡萄糖酸，最高產(chǎn)醋酸量8.75%。最適生長溫度30℃，能耐14%～15%的酒精。

（2）奧爾蘭醋酸桿菌（A.orleanense）:屬紋膜醋酸桿菌的亞種，也是法國奧爾蘭地區(qū)用葡萄酒生產(chǎn)食醋的菌種。最高產(chǎn)醋酸量2.9%，耐酸能力強(qiáng)，能產(chǎn)生少量的酯。最適生長溫度30℃。

（3）許氏醋桿菌（A.Schutzenbachii）：它是法國著名的速釀食醋菌種，也是目前釀醋工業(yè)重要的菌種之一。最高產(chǎn)醋酸量達(dá)11.5%。對醋酸沒有進(jìn)一步的氧化作用，耐酸能力較弱。最高生長溫度37℃。

（4）醋酸桿菌AS1.41：是我國釀醋工業(yè)常用菌種之一。產(chǎn)醋酸量6%～8%，可將醋酸進(jìn)一步氧化為CO2和H2O。最適生長溫度28～30℃，耐酒精濃度8%。

第十頁，共九十三頁，2022年，8月28日10雙歧桿菌屬：代表種：人體腸道中共有8種，其中數(shù)量最多的5種為：

兩歧雙歧桿菌（B.bifidum）、

嬰兒雙歧桿菌（B.infantis）、

青春雙歧桿菌（B.adolescentis）、

長雙歧桿菌（B.longum）、

短雙歧桿菌(B.breve)。

雙歧桿菌是人體腸道有益菌群，它可定殖在宿主的腸粘膜上形成生物學(xué)屏障，具有拮抗致病菌、改善微生態(tài)平衡、合成多種微生素、提供營養(yǎng)、抗腫瘤、降低內(nèi)毒素、提高免疫力、保護(hù)造血器官、降低膽固醇水平等重要生理功能，其促進(jìn)人體健康的有益作用，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它乳酸菌。第十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日11大腸桿菌以埃希氏大腸桿菌(Escherichiacoli)、產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacteraerogenes)等為代表。工業(yè)上利用大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶，進(jìn)行谷氨酸定量分析，還可利用大腸桿菌制取天冬氨酸、蘇氨酸和纈氨酸等。醫(yī)藥方面用大腸桿菌制造治療白血癥的天冬酰氨酶。大腸桿菌經(jīng)常用作分子生物學(xué)的研究材料，同時(shí)和病原菌有很密切的關(guān)系。

第十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日122、酵母菌(yeast)

酵母菌為單細(xì)胞真核生物，主要分布在含糖較多的酸性環(huán)境中（果皮、發(fā)酵果汁、土壤和酒曲中）--研究最徹底。

工業(yè)上用的酵母菌有啤酒酵母、假絲酵母、類酵母等。分別用于釀酒、制造面包、生產(chǎn)石油，蛋白、脂肪酶等。第十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日13（1）啤酒酵母的應(yīng)用：能發(fā)酵葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖以及1/3的棉子糖，不發(fā)酵蜜二糖、乳糖和甘油醛，也不發(fā)酵淀粉、纖維素等多糖。不分解蛋白質(zhì)，可同化氨基酸和氨態(tài)氮，不同化硝酸鹽。需要B族維生素和P、S、Ca、Mg、K、Fe等無機(jī)元素。兼性厭氧，有氧條件下，將可發(fā)酵性糖類通過有氧呼吸作用徹底氧化為CO2和H2O，釋放大量能量供細(xì)胞生長；無氧條件下，使可發(fā)性糖類通過發(fā)酵作用（EMP途徑）生成酒精和CO2，釋放較少能量供細(xì)胞生長。最適生長溫度25℃，發(fā)酵最適溫度10-25℃。最適發(fā)酵pH為。真正發(fā)酵度達(dá)60%-65%。

第十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日14啤酒酵母第十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日15（2）葡萄酒酵母的應(yīng)用：

葡萄酒酵母的培養(yǎng)特征

葡萄汁固體培養(yǎng)，菌落呈乳黃色，不透明，有光澤，表面光滑濕潤，邊緣整齊；隨培養(yǎng)時(shí)間延長，菌落顏色變暗。

液體培養(yǎng)變濁，表面形成泡沫，聚凝性較強(qiáng)，培養(yǎng)后期菌體沉降于容器底部。

可發(fā)酵葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖以及1/3的棉子糖，不發(fā)酵蜜二糖、乳糖和甘油醛，也不發(fā)酵淀粉、纖維素等多糖。

不分解蛋白質(zhì)，不還原硝酸鹽，可同化氨基酸和氨態(tài)氮。需要B族維生素和P、S、Ca、Mg、K、Fe等無機(jī)元素。

兼性厭氧，有氧條件下，將可發(fā)性糖類通過有氧呼吸作用徹底氧化為CO2和H2O，釋放大量能量供菌體繁殖；

無氧條件下，使可發(fā)酵性糖類通過發(fā)酵作用（EMP途徑）生成酒精和CO2，釋放較少能量供細(xì)胞繁殖。

最適生長溫度25℃，葡萄酒發(fā)酵最適溫度15-25℃。最適發(fā)酵pH為。耐酸、耐乙醇、耐高滲、耐二氧化硫能力強(qiáng)于啤酒酵母。葡萄酒發(fā)酵后乙醇含量達(dá)16%以上。第十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日16（3）產(chǎn)蛋白假絲酵母的應(yīng)用：能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和1/3的棉子糖，不發(fā)酵半乳糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖。能同化尿素、銨鹽和硝酸鹽，不分解蛋白質(zhì)和脂肪。

兼性厭氧，有氧條件下，進(jìn)行有氧呼吸；無氧條件下，進(jìn)行酒精發(fā)酵。

最適生長溫度25℃，最適生長pH為4.5～6.5。

在發(fā)酵工業(yè)中，常采用富含半纖維的紙漿廢液、稻草、稻殼、玉米芯、木屑、啤酒廢渣等水解液和糖蜜為主要原料，培養(yǎng)產(chǎn)蛋白假絲酵母，生產(chǎn)食用或飼用單細(xì)胞蛋白和維生素B。第十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日173、霉菌(mould)霉菌不是分類學(xué)上的名詞，是絲狀真菌的一個(gè)通俗名稱，凡生長在營養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、網(wǎng)狀or絮狀菌絲的真菌統(tǒng)稱為霉菌，有較強(qiáng)陸生性，它喜歡偏酸性環(huán)境，大多數(shù)為好氧性，繁殖能力很強(qiáng)，它以無性孢子和有性孢子進(jìn)行繁殖，但多以無性孢子繁殖為主，其生長方式是菌絲末端的伸長和頂端分支，彼此交錯(cuò)呈網(wǎng)狀。工業(yè)上常用的霉菌有藻狀菌綱的的根霉、青霉、曲霉、毛霉等第十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日183.1根霉屬（Rhizopus）

根霉與毛霉類似，能產(chǎn)生大量的淀粉酶，故用作釀酒、制醋業(yè)的糖化菌。有些種根霉還用于甾體激素、延胡索酸和酶劑制生產(chǎn)。

根霉的生物學(xué)特性

根霉與毛霉相似，菌絲為無隔單細(xì)胞，生長迅速，有發(fā)達(dá)的菌絲體，氣生菌絲白色、蓬松，如棉絮狀。

根霉氣生性強(qiáng)，故大部分菌絲葡匐生長在營養(yǎng)基質(zhì)的表面。這種氣生菌絲，稱為葡匐菌絲?；鶅?nèi)菌絲根狀稱為假根。由假根著生處，向上長出直立的2~4根孢囊梗，孢囊梗不分枝，梗的頂端膨大形成孢囊，同時(shí)產(chǎn)生橫隔，囊內(nèi)形成大量孢囊孢子。

根霉的有性生殖產(chǎn)生接合孢子。除有性根霉為同宗結(jié)合外，其它根霉都是異宗結(jié)合。

常見的根霉：

第十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日19（1）．米根霉（Rhizopusoryzae）這個(gè)種在我國酒藥和酒曲中?？吹?，在土壤、空氣，以及其它各種物質(zhì)中亦常見。菌落疏松，初期白色，后變?yōu)榛液稚胶诤稚?，匍匐枝爬行，無色。假根發(fā)達(dá)，指狀或根狀分枝，褐色，孢囊梗直立或稍彎曲，2~4根，群生。尚未發(fā)現(xiàn)其形成接合孢子，發(fā)育溫度30~35℃，最適溫度37℃，41℃亦能生長。此菌有淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶，能產(chǎn)生乳酸、反丁烯二酸及微量的酒精。產(chǎn)L（+）乳酸量最強(qiáng)，達(dá)70%左右。是腐乳發(fā)酵的主要菌種。

（2）．華根霉（Rhizopuschinensis

）此菌多出現(xiàn)在我國酒藥和藥曲中，這個(gè)種耐高溫，于45℃能生長，菌落疏松或稠密，初期白色，后變?yōu)楹稚蚝谏?，假根不發(fā)達(dá)，短小，手指狀。孢子囊柄通常直立，光滑，淺褐色至黃褐色。不生接合孢子，但生多數(shù)的厚垣孢子，發(fā)育溫度為15~45℃，最適溫度為30℃。此菌淀粉液化力強(qiáng)，有溶膠性，能產(chǎn)生酒精、芳香脂類、左旋乳酸及反丁烯二酸，能轉(zhuǎn)化甾族化合物。

第二十頁，共九十三頁，2022年，8月28日20根霉種類：米根霉、華根霉、少根根霉、爪哇根霉應(yīng)用：釀酒第二十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日213.2毛霉屬（Mucor）

毛霉的生物學(xué)特性

菌落形態(tài)：菌落絮狀，初為白色或灰白色，后變?yōu)榛液稚鷧哺叨瓤捎蓭缀撩字潦畮桌迕祝械木哂泄鉂伞?/p>

菌絲形態(tài)：菌絲無隔。分氣生、基生；后者在基質(zhì)中較均勻分布，吸收營養(yǎng)；

氣生菌絲發(fā)育到一定階段，即產(chǎn)生垂直向上的孢囊梗；梗頂端膨大形成孢子囊，囊成熟后，囊壁破裂釋放出孢囊孢子；囊軸呈橢園形或圓柱形；孢囊孢子為球形、橢圓形或其他形狀，單細(xì)胞、無色，壁薄而光滑，無色或黃色；有性孢子（接合孢子）為球形，黃褐色，有的有突起。

第二十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日22常見的毛霉菌種

（1）．高大毛霉（Mucormucedo

）在培養(yǎng)基上的菌落，初期為白色，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，逐漸變?yōu)榈S色，有光澤，菌絲高達(dá)3~12cm或更高。孢子囊柄直立不分枝。孢子囊壁有草酸鈣結(jié)晶，此菌能產(chǎn)生3-羥基丁酮、脂肪酶。

（2）．總狀毛霉（Mucorracemosus）是毛霉中分布最廣的一種。菌絲灰白色，菌絲直立而稍短，孢子囊柄總狀分枝。我國四川的豆豉即用此菌制成。另外總狀毛霉能產(chǎn)生3-羥基丁酮，并對甾族化合物有轉(zhuǎn)化作用。

（3）．魯氏毛霉（MucorRouxianus)此菌種最初是從我國小曲中分離出來的，菌落在馬鈴薯培養(yǎng)基上呈黃色，在米飯上略帶紅色，孢子囊柄呈假軸狀分枝，厚垣孢子數(shù)量很多，大小不一，黃色至褐色，接合孢子未見。魯氏毛霉能產(chǎn)生蛋白酶，有分解大豆的能力，我國多用它來做豆腐乳。

第二十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日233.3曲霉屬（Aspergilus）

本屬菌絲有隔，多細(xì)胞。菌落呈圓形。以分生孢子方式進(jìn)行無性繁殖，本屬分生孢子呈綠、黃、橙、褐、黑等各種顏色，故菌落顏色多種多樣，而且比較穩(wěn)定，是分類的主要特征之一。曲霉菌的有性世代產(chǎn)生閉囊殼，其中著生圓球狀子囊，囊內(nèi)含有8個(gè)子囊孢子。子囊孢子大都無色，有的菌種呈紅、褐、紫等顏色。

第二十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日24常見的曲霉菌（續(xù)）應(yīng)用：生產(chǎn)有機(jī)酸、生產(chǎn)淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶第二十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日25常見的曲霉菌

（1）．米曲霉(Asp.oryzae）米曲霉菌落生長快，10d直徑達(dá)5~6cm，質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色。背面無色。分生孢子頭放射狀，一直徑150~300μm，也有少數(shù)為疏松柱狀。分生孢子梗2mm左右。近頂囊處直徑可達(dá)12~25μm，壁薄，粗糙。頂囊近球形或燒瓶形，通常40~50μm。小梗一般為單層，12~15μm，偶爾有雙層，也有單、雙層小梗同時(shí)存在于一個(gè)頂囊上。分生孢子幼時(shí)洋梨形或卵圓形，老后大多變?yōu)榍蛐位蚪蛐?，一?.5μm，粗糙或近于光滑。第二十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日26(2).黃曲霉（Asp.flavus）該菌為中溫性、中生性霉菌。生長溫度為6~47℃，最適溫度為30~38℃；生長的最低水活度為0.8~0.86。分布很廣泛，在名類食品和糧食上均能出現(xiàn)。有些種產(chǎn)生黃曲霉毒素，使食品和糧食污染帶毒，黃曲霉毒素毒性很強(qiáng)，有致癌致畸作用。該菌產(chǎn)毒的最適溫度為27℃；最適水活度為0.86以上。有些菌株具有很強(qiáng)的糖化淀粉，分解蛋白質(zhì)的能力，因而被廣泛用于白酒、醬油和醬的生產(chǎn)。

菌落：生長快，柔毛狀，平坦或有放射狀溝紋；初為黃色，后變?yōu)辄S綠或褐綠色；反面無色或略帶褐色。有的菌株產(chǎn)生灰褐色的菌核。

菌體：分生孢子梗壁粗糙或有刺，無色；分生孢子頭為半球形、柱形或扁球形；小梗一層或兩層，在同一頂囊上有時(shí)單、雙層并存；頂囊近球形或燒瓶狀；分生孢子球形，表面光滑或粗糙。

第二十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日27(3)．黑曲霉（Asp.niger）該群是接近高溫性的霉菌，生長適溫為35~37℃，最高可達(dá)50℃；孢子萌發(fā)的水活度為0.80~0.88，是自然界中常見的霉腐菌。

菌落：菌絲密集，初為白色，擴(kuò)散生長，培養(yǎng)時(shí)間延長，菌絲變?yōu)楹稚?，分生孢子形成后由中央變黑，逐步向四周擴(kuò)散。有的有放射狀溝紋；背面無色或黃褐色。

菌體：分生孢子梗壁厚，光滑，分生孢子頭球形，放射狀或裂成幾個(gè)放射的柱狀，黑色或褐色，分生孢子球形；菌絲有橫隔；

該菌具有多種活性強(qiáng)大的酶系，可用于工業(yè)生產(chǎn)。如淀粉酶用于淀粉的液化、糖化以生產(chǎn)酒精、白酒或制造葡萄糖和糖化劑；酸性蛋白酶用于蛋白質(zhì)的分解或食品消化劑的制造及皮毛軟化；果膠酶用于水解聚半乳糖醛酸、果汁澄清和植物纖維精煉。

第二十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日283.4青霉屬（Penicillium）生物學(xué)特性

菌落：菌落圓形，擴(kuò)展生長；表面平坦或有放射狀溝紋或有環(huán)狀輪紋；有的有較深的皺褶，使菌落呈紐扣狀；有的表面有各種顏色的滲出液，具有霉味或其他氣味；四周常有明顯的淡色邊緣；菌落正面有青綠、藍(lán)綠色、黃綠色、灰綠色。菌絲有隔，分氣生、基生。大部分青霉菌只有無性世代，產(chǎn)生分生孢子，個(gè)別有性世代，產(chǎn)生子囊孢子。進(jìn)行無性繁殖時(shí)，在菌絲上向上長出芽突，單生直立或密集成束，即為分生孢子梗。分生孢子梗向上長到一定程度，頂端分枝，每個(gè)分枝的頂端又繼續(xù)生出一輪次生分枝稱?；?；在每個(gè)?；捻敹耍a(chǎn)生一輪瓶狀小梗；每個(gè)小梗的頂端產(chǎn)生成串的分生孢子鏈。分枝、梗基、小梗構(gòu)成帚狀分枝；帚狀分枝與分生孢子鏈構(gòu)成帚狀穗（青霉穗）；分生孢子球形、卵形或橢圓形，光滑或粗糙。第二十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日29第三十頁，共九十三頁，2022年，8月28日30常見的青霉菌

1．桔青霉（Pen.citrinum）該菌屬于不對稱組，絨狀亞組，桔青霉系。一般大米產(chǎn)區(qū)都有此菌發(fā)生。危害大米使其黃變（泰國黃變米），有毒，其霉素是桔青霉素。該菌生長適溫為25~30℃，最高發(fā)育溫度為37℃；生長的最低水活度為0.80~0.85。

菌落：生長局限，10~14d直徑2~2.5cm；有放射狀溝紋；絨狀，有的稍帶絮狀；艾綠色到黃綠色；有窄白邊；滲出液淡黃色；反面黃色至褐色。

菌體：帚狀枝典型的雙輪生，不對稱；分生孢子梗多數(shù)由基質(zhì)長出，壁光滑，帶黃色，長50~200μm；梗基2~6個(gè)，輪生于分生孢子梗上，明顯散開，端部膨大；小梗6~10個(gè)，密集而平行，基部圓瓶形；分生孢子鏈為分散的柱狀；分生孢子球形或近球形，2.2~3.2μm，光滑或接近光滑。

2．展開青霉（Pen.expanasum）作為蘋果的腐敗菌被分離到的。

菌落：菌落生長迅速，黃綠色—青綠色，束狀，背面無色——黃褐色。分生孢子梗長200~300μm，平滑，梗徑10~15μm，分生孢子小梗單輪生，分生孢子橢圓形或球形，2.3×1μm。

第三十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日314.放線菌（actinomycetes）因菌落呈放線狀而得名，基本上是與細(xì)菌類同的原核細(xì)胞生物，無典型的核和核結(jié)構(gòu)，對青霉素、四環(huán)素、磺胺等抗菌素敏感。放線菌大部分是鏈絲菌or鏈霉菌，大多為腐生菌，少數(shù)為寄生菌，主要存在于有機(jī)物豐富的微堿土壤中，空氣、淡水、海水中也存在，土壤中特有的泥腥味主要是放線菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物引起。放線菌的突出特性之一是產(chǎn)生抗菌素。到目前為止臨床和農(nóng)業(yè)上使用的抗菌素大多數(shù)是利用放線菌生產(chǎn)的。如鏈霉素、土霉素、卡那霉素、慶大霉素等。第三十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日32其他霉菌粗糙鏈孢霉：微生物遺傳學(xué)的重要研究材料，好食鏈孢霉的孢子色素中含有多量的β-胡蘿卜素，是維生素A的研究材料。阿舒氏假囊霉和棉病假囊霉：都是植物病原菌。前者雌雄異株，后者雌雄同體，但互為近緣菌種，通常為維生素B2產(chǎn)生菌。白地霉：其菌體蛋白營養(yǎng)價(jià)值很高，可供食用及飼用，也可提取核酸，還可合成脂肪，在糖廠、酒廠、淀粉廠、飲料廠、豆腐廠、制藥廠等的廢料和廢水綜合利用方面很有前途。第三十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日33白地霉

粗糙鏈孢霉第三十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日34種類：龜裂鏈霉菌、金霉素鏈霉菌、灰色鏈霉菌、紅霉素鏈霉菌應(yīng)用：各類抗生素。土霉素、四環(huán)素、鏈霉素、紅霉素第三十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日355.擔(dān)子菌（basidiomycetes）

就是人們通常所說的菇類微生物。銀耳、木耳目等

6.藻類（alga）

自然界分布極廣的一類自養(yǎng)微生物資源，人們用它作為人類保健食品和飼料。培養(yǎng)藻類獲得廉價(jià)高質(zhì)的蛋白質(zhì)：培養(yǎng)螺旋藻，1公頃面積可獲得60噸（干重）的螺旋藻，從蛋白質(zhì)產(chǎn)率來看是大豆的28倍。

可通過培養(yǎng)藻類利用二氧化碳轉(zhuǎn)化成生物柴油，如單胞藻（1公頃面積可獲得60噸石油燃料）

第三十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日36螺旋藻第三十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日37未培養(yǎng)微生物：指迄今為止所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得的純培養(yǎng)的微生物。極端微生物，又稱嗜極菌。研究方法主要有：模擬自然培養(yǎng)法；宏基因組分析法。南極冰下湖存在著復(fù)雜的微生物群

宏基因組是基因組學(xué)一個(gè)新興的科學(xué)研究方向。宏基因組學(xué)（又稱元基因組學(xué)，環(huán)境基因組學(xué)，生態(tài)基因組學(xué)等），是研究直接從環(huán)境樣本中提取的基因組遺傳物質(zhì)的學(xué)科。傳統(tǒng)的微生物研究依賴于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，元基因組的興起填補(bǔ)了無法在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)的微生物研究的空白。第三十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日38嗜熱微生物：《自然》雜志曾報(bào)道在流體靜壓為250個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，水溫高達(dá)250℃-300℃的熱液口水域里發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌存活。極端高溫微生物一般生活在熱水系統(tǒng)周圍、制糖廠一帶、青貯飼料堆和堆肥里，或位于海底斷陷谷中的熱液口中?！癙CR”(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)),其中的DNA聚合酶就是從一種嗜熱微生物中提取分離出來的，這種酶在90℃以上的高溫下仍可繼續(xù)工作。

嗜寒微生物：

有些細(xì)菌在0℃以下仍可正常生長，當(dāng)溫度超過20℃時(shí)反而會死亡。第三十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日39嗜酸微生物：硫桿菌是一類能產(chǎn)生硫酸的桿菌，因此這一類細(xì)菌能在pH5~2之間的環(huán)境中滋生繁殖。還有一類細(xì)菌叫做鐵桿菌，能夠分解黃鐵礦而使其中部分硫轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩?，因此它們的最適pH也非常低。它們生存的環(huán)境也很特殊，如硫磺泉、硫礦、黃鐵礦，或金、銅、鉛或鈾礦礦口的廢物堆中。硫桿菌細(xì)胞內(nèi)的pH值在6~7之間，這就意味著硫桿菌細(xì)胞內(nèi)外的氫離子數(shù)量相差上萬倍。嗜堿微生物：嗜堿菌必須在pH8以上的環(huán)境里才能存活，而它們最佳生存環(huán)境的pH值高于10，許多能在pH11.5的環(huán)境中存活，最高存活記錄達(dá)pH13。從嗜堿菌細(xì)胞中提取的許多酶不僅具有抗破壞能力，而且只有在堿水里才最為活躍，這也使得嗜堿菌具有重要的商業(yè)價(jià)值。一般肥皂都是堿性的，嗜堿菌的細(xì)胞酶則能夠作為添加劑用于肥皂的生產(chǎn)。第四十頁，共九十三頁，2022年，8月28日40嗜鹽微生物：嗜鹽微生物能夠在高濃度鹽溶液中正常生長，如鹽桿菌，它們的生存環(huán)境不可缺少鹽，在含18%氯化鈉的溶液里生長最旺盛，在鹽量飽和的溶液和潮濕的鹽粒上也能滋生繁衍。還有一種“浮游水藻”，其組織非常簡單，以其抗鹽性強(qiáng)而著稱，可以在含鹽量高達(dá)33%的飽和溶液里生存，而在正常的水中無法生存。壓強(qiáng)極端微生物：在海底的一些嗜熱微生物就屬于強(qiáng)壓微生物，它們可以承受巨大的壓強(qiáng)（大洋最深處的流體靜壓可高達(dá)1100個(gè)大氣壓）。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大腸桿菌在被提供合適養(yǎng)料的情況下，可以在300個(gè)大氣壓下生長。

第四十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日41二、微生物工業(yè)對菌種的要求

微生物資源豐富，廣布于土壤、水和空氣等自然界中，其中土壤中最多?，F(xiàn)在微生物工業(yè)用菌有的是野生型，有的是通過誘變得到的突變體。發(fā)展趨勢：從野生型變異株自然選育代謝控制育種誘變育種基因工程定向育種第四十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日42微生物工業(yè)對大規(guī)模生產(chǎn)用菌的要求原則：（1）所需培養(yǎng)基易得，價(jià)格低廉；（2）培養(yǎng)和發(fā)酵條件溫和（糖濃度、溫度、pH、溶解氧、滲透壓等）（3）生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期短（4）單產(chǎn)高（選擇野生型、營養(yǎng)缺陷型或調(diào)節(jié)突變株）（5）抗病毒能力強(qiáng)（6）菌種純粹，不易變異退化，穩(wěn)定性好（7）菌體不是病源菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保證安全第四十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日43第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏一、菌種的退化、復(fù)壯1.1菌種退化的原因生產(chǎn)菌株生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失稱為菌種退化。菌種退化可以是形態(tài)上的，也可以是生理上的。菌種退化表現(xiàn)：（1）產(chǎn)量降低，出現(xiàn)負(fù)增長；（2）生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；（3）代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主的寄生能力下降；（4）抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體、抗低溫等）能力的減弱。第四十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日44菌種退化的原因：1.基因突變菌種退化的主要原因就是那些控制生產(chǎn)性狀的基因發(fā)生負(fù)突變。在生物進(jìn)化過程中，遺傳變異是絕對的，而它的穩(wěn)定性是相對的；退化性變異是大量存在的，而進(jìn)化性變異是個(gè)別的。從生物學(xué)角度講，生產(chǎn)實(shí)踐中采用的優(yōu)良菌株往往是不正常的，許多都是營養(yǎng)缺陷型，一旦發(fā)生回復(fù)突變，成為野生型。隨著傳代次數(shù)增加，回復(fù)突變菌株會在數(shù)量上占優(yōu)勢。2.分離現(xiàn)象遺傳育種獲得的菌種若是DNA雙鏈之一發(fā)生突變，隨著傳代，其生產(chǎn)性狀也將發(fā)生退化。這種退化不是基因突變引起的，而是由于誘變獲得的高產(chǎn)菌本身不純。高產(chǎn)菌只發(fā)生在一條DNA單鏈上，隨著細(xì)胞分裂，突變基因與未突變基因發(fā)生分離，出現(xiàn)突變的高產(chǎn)菌株和未突變的低產(chǎn)菌株。第四十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日45菌種退化的原因（續(xù)）3.連續(xù)移代微生物自發(fā)突變都是通過繁殖傳代出現(xiàn)的。DNA在復(fù)制過程中，自發(fā)突變率為10－8～10－9，移代次數(shù)越多，發(fā)生突變的概率越高。突變后的菌株隨著傳代次數(shù)的增加會在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，最終整個(gè)菌群出現(xiàn)退化。4.培養(yǎng)和保藏條件的影響不良的營養(yǎng)條件如營養(yǎng)成分、溫度濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等，不僅會誘發(fā)低產(chǎn)基因型菌株的出現(xiàn)，而且會造成低產(chǎn)基因和高產(chǎn)基因細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生對比，造成整個(gè)菌群出現(xiàn)退化。第四十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日461.2菌種退化的防止

（1）菌種的分離；

（2）菌種的復(fù)壯；

（3）提供良好的環(huán)境條件；

（4）用優(yōu)良的保藏方法；

（5）定期純化菌種。第四十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日471.3菌種的復(fù)壯

“狹義”復(fù)壯：是一種消極措施，指在菌種已經(jīng)發(fā)生退化的情況下，通過純化分離和測定生產(chǎn)性能等方法，從退化的群體中找出尚未衰退的個(gè)體，進(jìn)一步繁殖，以達(dá)到恢復(fù)該菌種原有典型性狀的一種措施。

“廣義”復(fù)壯：是一種積極措施，指在菌種還未發(fā)生退化前就有意識地進(jìn)行純種分離與生產(chǎn)性能鑒定，以保持菌種穩(wěn)定的生產(chǎn)性狀，甚至使其逐步有所提高。第四十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日48菌種復(fù)壯的方法：

（1）純種分離

通過純種分離，可以把退化菌種的細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來。一般分為菌落純（通過平板劃線、平板涂布、培養(yǎng)基稀釋法獲取單菌落）；細(xì)胞純（用“分離小室”、顯微鏡操縱、菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離）

（2）淘汰法

淘汰已經(jīng)衰退的個(gè)體。

（3）宿主體內(nèi)復(fù)壯法

對于寄生性的微生物退化菌株，可以通過接種至相應(yīng)的昆蟲等動(dòng)植物宿主體內(nèi)的措施來提高它們的活性。第四十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日491.4菌種保藏

菌種的保藏方法有很多，但其基本原理是大同小異的，主要是根據(jù)微生物生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。

（1）目的：提高菌種存活率，減少菌種的變異，保持原來優(yōu)良的生產(chǎn)性能。

（2）原理：根據(jù)菌種的生物生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動(dòng)處于不活潑狀態(tài)，生長繁殖處于休眠狀態(tài)。

保藏時(shí)首先要挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體（孢子、芽孢等），其次是要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)最有利于休眠的環(huán)境，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，以達(dá)到降低其代謝活動(dòng)，延長保存期的目的。第五十頁，共九十三頁，2022年，8月28日50（3）菌種保藏的方法：

A.斜面保藏法

這是一種最基本的方法，適用范圍廣，細(xì)菌、真菌和放線菌都可應(yīng)用。當(dāng)微生物在適宜的斜面培養(yǎng)基和溫度條件下生長良好后，一般在5℃左右可保藏3-6個(gè)月，到期后重新移種一次。保藏溫度和時(shí)間都不是絕對的，個(gè)別菌種甚至在37℃保藏為宜，也有的需要l～2周傳代一次。

這種保藏方法的弊端在于傳代多了容易發(fā)生變異，同時(shí)污染機(jī)會也增加。

B.干燥保藏法

這種方法是將微生物吸附在各種載體上，干燥后保藏。

一般將園土或耕作土研細(xì)、過篩(24篩目)，干燥后使用，也可以用砂子篩后以氫氧化鈉和鹽酸交替洗滌凈后作為載體。土壤或沙子12l℃高壓滅菌2—3次。試管口可熔封亦可用石蠟封口后，放在干燥器內(nèi)在5℃保藏，其保藏期一般為兩年，有些微生物可長達(dá)10年之久。適用的微生物不多，存活期亦較短。第五十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日51（3）菌種保藏的方法(續(xù))：C.懸液保藏法是將微生物懸浮于不含養(yǎng)分的溶液中，如蒸餾水、0．25mol/L磷酸緩沖液（pH6．5）或生理鹽水中。大部分能保藏一年或更長。此法的關(guān)鍵是要用密封性能好的螺旋口試管或一般試管加橡皮塞以防止水分的蒸發(fā)。保藏在10℃或室溫(18～20℃)更優(yōu)于低溫操作。D.冷凍保藏法保藏期長、變異小、便于大量保藏及適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是各保藏機(jī)構(gòu)使用的主要方法。其基本原理是將微生物或袍子冷凍，然后在減壓情況下利用升華現(xiàn)象除去水分，使細(xì)胞的代謝、生理等生命活動(dòng)處在停止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行長期保藏。第五十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日52（3）菌種保藏的方法(續(xù))：E.液氮保藏法效果好、方法簡單、保藏的對象也最為廣泛。其方法是將濃的懸液加入滅菌后的分散劑中，細(xì)菌加入最終濃度為10％的甘油或5％二甲基亞砜(DMSO)作為防凍的保護(hù)劑。安瓴管開始以每分鐘l℃的緩慢速度冷卻至—25℃左右，有的菌種要經(jīng)過干冰—乙二醇等制冷劑冷卻至—78℃再故人液氮罐中。安瓴管保藏在—196℃的液氮中，亦可在—150℃的液氮中。從液氮中取出安額管應(yīng)當(dāng)放入38℃—40℃的溫水中振蕩1—2min使之完全融化，這樣做有利于細(xì)胞的復(fù)蘇。這種方法的保藏期一般為兩三年，長的可達(dá)九年。該方法的缺點(diǎn)是不能發(fā)送菌種。第五十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日53（3）菌種保藏的方法(續(xù))：F.低溫保藏法大多數(shù)的微生物可在—20℃以下的低溫中保藏。使用密封性能好的螺旋口小管，加入1—2ml的菌液，直接放入低溫冰箱中保藏。一般是溫度低時(shí)保藏效果好；懸液的濃度應(yīng)用濃度高的為宜，但是因微生物不同而異。該法的保藏期約在一年左右。第五十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日54保藏菌種的技術(shù)要點(diǎn):

（1）選擇適宜的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和菌齡，以便得到健壯的細(xì)胞或孢子

（2）保存在低溫、隔氧、干燥、避光的環(huán)境中，使微生物盡量降低或停止代謝活動(dòng)，減慢或停止生長繁殖

（3）不污染雜菌

（4）在較長時(shí)間內(nèi)保持生命活力和相對遺傳穩(wěn)定性。第五十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日55冷凍干燥方法的適用范圍適用于大多數(shù)的細(xì)菌、放線菌、病毒、霉菌、酵母菌等不適用于真菌的營養(yǎng)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的相對統(tǒng)一是成功進(jìn)行冷凍干燥保存的基礎(chǔ)。第五十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日56冷凍干燥的生理性損傷冷凍干燥對微生物細(xì)胞的生理損傷和致死是客觀存在的。生理損傷和致死之間的關(guān)系復(fù)雜，很難截然將其分開。生理損傷不易被發(fā)現(xiàn)，以“隱性損傷”的形式存在于細(xì)胞中。有時(shí)，細(xì)胞的隱性損傷會在生理、代謝、遺傳等方面對生物體造成不利影響，致使生物體發(fā)生突變。多數(shù)情況下，冷凍干燥對微生物細(xì)胞造成的生理損傷是暫時(shí)的，屬非致死損傷，以隱性損傷長期存在的例子仍為少數(shù)。冷凍干燥后恢復(fù)生長的條件影響凍干效果。通過提供合適的營養(yǎng)物、極佳的培養(yǎng)條件，多數(shù)生理損傷可在短期內(nèi)恢復(fù)。第五十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日57凍干導(dǎo)致細(xì)胞致死損傷的機(jī)理微生物在凍干過程中的致死損傷是不可避免的。完善凍干程序、優(yōu)化凍干條件，加入凍干保護(hù)劑只能是減少致死損傷。冷凍對微生物細(xì)胞的致死損傷

預(yù)凍對微生物細(xì)胞凍干效果至關(guān)重要，有效的預(yù)凍條件能減少細(xì)胞的損傷，有利于凍干過程中水分的升華。預(yù)凍產(chǎn)生的致死損傷，尚無統(tǒng)一的理論，一般認(rèn)為主要是機(jī)械效應(yīng)和溶質(zhì)效應(yīng)引起。干燥對微生物細(xì)胞的致死損傷

可能是缺水引發(fā)的生理損傷，尤其對于不耐干燥的微生物。很大程度是由于干燥引起膜脂的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能的改變使膜的流動(dòng)性或完整性改變，膜的功能失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第五十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日58保護(hù)劑系統(tǒng)的保護(hù)效應(yīng)避免微生物細(xì)胞因脫水造成的危害脫水使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生相變（液晶態(tài)脂膜變成凝膠態(tài)），從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。凍干保護(hù)劑，尤其是糖類保護(hù)劑，通過水置換作用，抑制脂膜的相變，使保護(hù)劑存在下的干燥脂膜和無保護(hù)劑存在時(shí)的水合脂膜的生理特性相似。保護(hù)微生物細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性

保護(hù)劑的水置換作用、保護(hù)劑中的脂蛋白與膜脂蛋白的結(jié)構(gòu)相同（β折疊結(jié)構(gòu)）、增加粘度，穩(wěn)定滲透壓。保護(hù)微生物細(xì)胞代謝酶的生物活性

保護(hù)劑系統(tǒng)不同程度地消除了干燥對酶活性的影響，使微生物細(xì)胞在凍干后仍能恢復(fù)生長。第五十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日59凍干細(xì)胞中的水分殘存量微生物菌種冷凍干燥的儲存效果，在很大程度上取決于樣品中細(xì)胞的含水量。細(xì)胞中水分殘存量與儲存穩(wěn)定性和儲存期限密切相關(guān)，且存在種屬間的差異。大多數(shù)微生物菌種凍干后的含水量應(yīng)控制在2-3%。高水分殘留比低水分殘留對細(xì)胞的危害更大。第六十頁，共九十三頁，2022年，8月28日60水的凍結(jié)：

細(xì)胞膜表面的自由水：

接近環(huán)境中水的凍結(jié)溫度

細(xì)胞中的游離水：

凍結(jié)溫度約為-25℃

細(xì)胞中的結(jié)合水：

-100℃仍不凍結(jié)第六十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日61水溶液的凍結(jié)：

溶質(zhì)改變水的物理性質(zhì)

溶液的凍結(jié)從過冷開始

溶液的凍結(jié)溫度：共晶點(diǎn)（飽和溶液的凝固點(diǎn)）

冰晶（異質(zhì)冰晶）的形成與溶質(zhì)含量和降溫速度呈正相關(guān)

增加溶質(zhì)濃度，加快降溫速度，可以獲得玻璃化冰晶。第六十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日62生活細(xì)胞的凍結(jié)細(xì)胞內(nèi)外水的凍結(jié)狀態(tài)是細(xì)胞凍存技術(shù)的關(guān)鍵懸浮細(xì)胞的凍結(jié)首先是細(xì)胞外凍結(jié)。細(xì)胞外水的凍結(jié)溫度為-5～-15℃細(xì)胞內(nèi)游離水在-25℃凍結(jié)，-30℃時(shí)，細(xì)胞幾乎沒有非凍結(jié)狀態(tài)的自由水存在。Luyet的二步凍結(jié)法先對細(xì)胞慢速降溫（1℃/min）到-30℃，造成細(xì)胞外凍結(jié)，細(xì)胞內(nèi)脫水。然后提高降溫速度。第六十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日63細(xì)胞的超低溫凍結(jié)即便在-70℃，細(xì)胞內(nèi)某些酶類仍具備一定活性，使細(xì)胞進(jìn)行簡單、緩慢的代謝，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)“衰老”現(xiàn)象。溫度波動(dòng)也會產(chǎn)生物理和化學(xué)反應(yīng)，受溶液凍結(jié)、融化以及滲透壓力變化的影響，細(xì)胞受到不同程度的損傷。這種低溫?fù)p傷主要發(fā)生在0∽-60℃范圍內(nèi)。Meryman曾引證在-130℃無生化活性產(chǎn)生，因此推斷，在-130℃或更低，生物代謝是停頓的。能夠經(jīng)受超低溫凍結(jié)以及其后融化的生物，在超低溫條件下，可實(shí)現(xiàn)無定限地保持原有性狀存活。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的超低溫保存，一般均需在溶液中加入一定種類的低溫保護(hù)劑并針對不同的細(xì)胞，設(shè)計(jì)特定的降溫和復(fù)溫程序。沒有這些特定的條件，細(xì)胞在降溫復(fù)溫過程中必然會遭到低溫?fù)p傷而死亡。第六十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日64冷凍對微生物細(xì)胞的致死損傷細(xì)胞的超低溫凍存由三個(gè)技術(shù)步驟組成：細(xì)胞預(yù)凍；細(xì)胞在超低溫下的長期儲存；細(xì)胞凍融。致死損傷發(fā)生在預(yù)凍和凍融階段。細(xì)胞的損傷是全方位的，包括：膜系統(tǒng)的完整性受損（膜的融合和膜的相變）；或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)受破壞；或代謝酶失活（不利物質(zhì)大量積累或必需營養(yǎng)物質(zhì)大量分解）第六十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日65冷凍導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)理1972年，Mazur等首先提出冷凍損傷的兩因素假說。機(jī)械損傷：細(xì)胞內(nèi)外冰晶生長而產(chǎn)生的機(jī)械力量造成膜結(jié)構(gòu)損傷，從而影響細(xì)胞的生理、代謝功能的正常發(fā)揮。這是過快冷卻所產(chǎn)生的，冷卻速率越快，損傷越大。溶質(zhì)損傷：水的凍結(jié)使細(xì)胞間隙內(nèi)的液體逐漸濃縮，電解質(zhì)濃度顯著增加，胞內(nèi)pH值和離子強(qiáng)度改變，潛在的不利化學(xué)反應(yīng)發(fā)生率提高，如蛋白質(zhì)變性，膜脂蛋白復(fù)合體的破壞；細(xì)胞膜脫水收縮達(dá)到臨界最小體積時(shí)，會使細(xì)胞膜的滲透率產(chǎn)生不可逆的致命增加等。這是由于過慢冷卻所產(chǎn)生，冷卻速率越慢，細(xì)胞在高濃度溶液中暴露的時(shí)間越長，損傷越大。溶質(zhì)損傷在預(yù)凍的某一溫度范圍內(nèi)最為明顯，這個(gè)溫度范圍在水的冰點(diǎn)和該溶液的全部固化溫度之間，以較高速度越過這一溫度范圍，可以減弱溶質(zhì)損傷。第六十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日66低溫保護(hù)劑：

滲透型保護(hù)劑：

甘油、DMSO、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等。

使胞內(nèi)壓接近胞外壓，降低細(xì)胞脫水皺縮的程度和速度；

易進(jìn)出細(xì)胞，復(fù)溫時(shí)緩解滲透性腫脹引起的損傷。

非滲透型保護(hù)劑：

聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、白蛋白等

使溶液呈過冷態(tài)，可在特定溫度下降低溶質(zhì)濃度；

使胞內(nèi)水分提前部分滲出，緩解胞內(nèi)冰晶的形成。第六十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日67國內(nèi)外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)

菌種保藏機(jī)構(gòu)的任務(wù)是在廣泛收集生產(chǎn)和科研菌種、菌株基礎(chǔ)上，把它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不亂和便于交換使用的目的。

中國：中國微生物菌種保藏管理委員會（CCCCM）；

美國：美國典型菌種保藏中心（ATCC）；

英國：國家典型菌種保藏所（NCTC）；

法國：里昂巴斯德研究所（IPL）；

日本：大阪發(fā)酵研究所（IFO）；

德國：科赫研究所（RKI）；

荷蘭：真菌中心收藏所。第六十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日68第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育一、工業(yè)微生物選育的目的：1、選育的目的改善菌種的特性，使產(chǎn)量提高，改進(jìn)質(zhì)量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用等。微生物所發(fā)酵得到的產(chǎn)品，除了初級代謝產(chǎn)品如氨基酸和維生素外還有許多次級代謝產(chǎn)物。我們想要得到產(chǎn)物的兩個(gè)成功要素在于（1）產(chǎn)生菌的選擇；（2）采用什么樣的選育方案（包括檢測性能系統(tǒng)），還有不管尋找哪一類生物活性物質(zhì)，在選擇選育方法時(shí)必須要考慮兩個(gè)要點(diǎn)即---選擇性和靈敏性。菌種選育包括自然選育和誘變選育。第六十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日692、選擇性分離方法大致分為五個(gè)步驟：

（1）含微生物材料的選擇；

（2）材料的預(yù)處理；

（3）所需菌種的分離；

（4）培養(yǎng)；

（5）菌落的選擇和純化。第七十頁，共九十三頁，2022年，8月28日703、篩選時(shí)宜考慮的一些重要指標(biāo)：

（1）菌的營養(yǎng)特征，在發(fā)酵過程中，常會遇到要求采用廉價(jià)的培養(yǎng)基or使用來源豐富的原料；

（2）菌的生長溫度應(yīng)選擇溫度較高的菌種這可以大大降低大規(guī)模發(fā)酵的冷卻成本；

（3）菌是英語所選用的設(shè)備和生產(chǎn)過程；

（4）菌的穩(wěn)定性；

（5）菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液中的濃度；

（6）容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物；

（3）~（6）衡量分離達(dá)到的菌種的生產(chǎn)性能。第七十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日71二、菌種的經(jīng)典選育方法

菌種的選育包括自然選育和誘變選育。

（一）自然選育：

自然選育是利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離、篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株，甚至可用來選育高產(chǎn)量突變株。

因此，它能達(dá)到純化、復(fù)壯菌種，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高平均生產(chǎn)水平的目的。

自然選育一般有三種方法：

（1）從自然界分離菌種；

（2）從生產(chǎn)菌種中選育；

（3）從保藏菌株中選育。

第七十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日72自然選育流程圖P22圖2-1第七十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日73（二）誘變育種：

誘變育種是指人工有意識地將生物體暴露于物理的、化學(xué)的或生物的一種或多種誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進(jìn)而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。

與自然選育比較，由于引進(jìn)了誘變劑處理，因而加速了菌種突變的頻率，擴(kuò)大了變異的幅度，從而提高了獲得優(yōu)良特性的突變株的幾率。

誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，它是研究誘發(fā)機(jī)制的基礎(chǔ)上選擇合理的誘發(fā)因素，處理劑量及處理方法，再行運(yùn)用合理的篩選程序及適當(dāng)?shù)暮Y選方法，把優(yōu)良菌株選育出來。

第七十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日74 改變的環(huán)境條件稱為誘變劑：具體定義：凡能顯著提高生物體變異頻率的因子稱為誘變劑，常用的誘變劑依其性質(zhì)分為物理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩大類。

（1）物理誘變劑

使用較多的紫外線（紫的波長136~390nm，對誘變有效果的范圍200~300nm以260nm左右效用最大

）、X-射線（是高能電磁波，兩者性質(zhì)相似，X-射線波長0.06~136nm，r-射線是0.006~1.4nm）

r-射線、α、β-射線，超聲波少用

（2）化學(xué)誘變劑

種類多：常有的：甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍（NTG）、氮芥（NM）、亞硝基甲基脲（NMU）等等，其中NTG和NMU因有突出的誘變效應(yīng)人稱“超誘變劑”第七十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日751、誘變育種的一般步驟（如下圖）

主要包括出發(fā)菌株的選擇（選擇純種的、代謝特征符合要求的、對誘變劑敏感的菌株）、誘變處理（誘變劑的種類及處理劑量、影響因素的分析）和篩選突變株三個(gè)部分，第七十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日76第七十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日772、誘變育種工作中應(yīng)注意幾個(gè)問題

（1）選擇好出發(fā)菌株

選擇好出發(fā)菌株對誘變效果有著積極的重要作用，有些微生物比較穩(wěn)定，其遺傳物質(zhì)耐誘變劑的作用強(qiáng)。用這種菌株于生產(chǎn)是很有益的而用作出發(fā)菌株則不適宜,用作誘變的出發(fā)菌株必經(jīng)對它的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面了解。挑選出發(fā)菌株的標(biāo)準(zhǔn)是產(chǎn)量高，對誘變劑的敏感性大、變異幅度廣，再確定誘變劑的使用及篩選條件。

（2）復(fù)合誘變因素的使用

在誘變育種中，可用多種物理、化學(xué)誘變因素，來處理菌種。對野生型菌株單一誘變因素有時(shí)也能取得好的效果，但對老菌種單一誘變因素重復(fù)使用突變的效果不高。這時(shí)可用復(fù)合誘變因素來擴(kuò)大誘變幅度，提高誘變效果。如在青霉菌的選育中，先以氮芥處理很短時(shí)間，使之不足以引起突變，再用紫外線處理，可使誘變頻率大為提高。

第七十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日78（3）劑量選擇

各有各的劑量單位：如紫外線、焦耳、X-射線：庫(侖)每千克,化學(xué)誘變因素（濃度）；不同的微生物使用的劑量不同,致死率取決于誘變劑量,而致死率和變異率之間有一定關(guān)系.因此可用致死率做為選擇適宜劑量的依據(jù),一般要經(jīng)過多次的摸索.誘變效應(yīng)隨劑量的增大而提高,但達(dá)到一定劑量后,再增加劑量反而會使誘變率下降.所以要在實(shí)踐中積累經(jīng)驗(yàn).

（4）變異菌株的篩選

一般應(yīng)從菌落形態(tài)變異類型著手，去發(fā)現(xiàn)那些與產(chǎn)量有關(guān)的特性，并根據(jù)這些特性，分門別類地挑選一定數(shù)量的典型菌株進(jìn)行發(fā)酵和鑒定，以決定各種類型與產(chǎn)量之間的關(guān)系。這樣，可大大提高篩選的工作效率。

（5）高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合

要想獲得高產(chǎn)菌株必須有合適的篩選條件配合，否則，就不可能挑選出好菌株，如在土霉素產(chǎn)生菌選育過程的初篩培養(yǎng)基中適當(dāng)增加淀粉和硫酸銨，可篩選到能利用的較高濃度的糖和氮及效價(jià)亦比原菌株略高的突變株。第七十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日793、篩選方法：

突變株的篩選：

（1）隨機(jī)篩選：

菌種經(jīng)誘變后，進(jìn)行平板分離，隨機(jī)挑選單菌落，從中篩選高產(chǎn)菌株。

根據(jù)平皿直接反應(yīng)（指每個(gè)菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物作用后的變色圈或透明圈等）的結(jié)果來顯示菌株生產(chǎn)活力的高低，來篩選高產(chǎn)菌株。此種方法初篩。除此外，為增加效率，還采用搖瓶篩選法、瓊脂塊篩選法、自動(dòng)化篩選等方法。

第八十頁，共九十三頁，2022年，8月28日80（2）理性篩選：

定義：是指運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)