微生物培養(yǎng)與應用 上課用

微生物的培養(yǎng)與利用微生物的培養(yǎng)微生物需要的營養(yǎng)要素及功能微生物的培養(yǎng)培養(yǎng)基的類型微生物的培養(yǎng)過程將自然界中存在的用肉眼看不到的、形體微小、結構簡單、通常要借助光學顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物，統(tǒng)稱為微生物。1微生物類群無細胞結構：病毒有細胞結構真核生物細菌放線菌藍藻支原體、衣原體（寄生）等單細胞：酵母菌、多細胞：霉菌、食用真菌原核生物真菌原生生物一、微生物二、微生物的營養(yǎng)要素二、微生物的營養(yǎng)要素1碳源:為其生長提供C元素的營養(yǎng)物質如:CO2,NAHCO3,糖類,脂肪等

常用:葡萄糖2氮源:為其生長提供N元素的營養(yǎng)物質,

氮,銨鹽,硝酸鹽,尿素,牛肉膏,蛋白胨3生長因子:是一類對微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大的有機營養(yǎng)物質。4無機鹽5水碳源、氮源、無機鹽、水生長因子三、培養(yǎng)基的分類

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。用于微生物的分離、計數(shù)

固體培養(yǎng)基：劃線法菌落：由單個或少數(shù)細菌繁殖形成的、肉眼可見具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，其一定程度上可反應個體的特征.稀釋涂布法：分離、計數(shù)不同細菌的菌落具有不同特征，表現(xiàn)在菌落的大小、形狀、光澤度、顏色、硬度透明度等方面。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。不同微生物的菌落液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長用于工業(yè)生產(chǎn)(微生物的擴大培養(yǎng))選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物

鑒別培養(yǎng)基

加入某些指示劑鑒別不同種類

加入伊紅,美藍鑒別飲用水中是否的大腸桿菌

1、消毒（二）無菌技術煮沸消毒法方法：紫外線消毒化學藥劑消毒（酒精、各種消毒液）

2、滅菌

方法：高壓蒸汽滅菌

灼燒滅菌

干熱滅菌

強烈的理化因素，殺死物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢等。二、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離1、配制培養(yǎng)基（1）計算、稱量、溶化、調(diào)pH2.滅菌：高壓蒸汽滅菌法121℃滅菌30min3.倒平板：待三角瓶中的LB固體培養(yǎng)基冷到60℃時，關閉紫外燈，點燃酒精燈，用鑷子從廣口瓶中夾出酒精棉球擦試桌面和手。注意：一定要在擦試手之前點燃酒精燈，以免發(fā)生危險。不要把培養(yǎng)基沾在培養(yǎng)皿壁上，以免污染。平板劃線分離：將搖床上培養(yǎng)12h的三角瓶打開，接種環(huán)部分深入到菌液中。然后，在裝有固體培養(yǎng)基的每個培養(yǎng)皿平板上連續(xù)劃線。劃線后蓋好培養(yǎng)皿。消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一。

4.接種

平板劃線的操作方法實驗結果：

培養(yǎng)皿的LB固體培養(yǎng)基中可看到在劃線的末端位置出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明大腸桿菌已被分離。菌種保存：在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再劃線接種在空白斜面上，37℃培養(yǎng)24h后，4℃冰箱保存。大腸桿菌的培養(yǎng)和分離5.培養(yǎng)（液體培養(yǎng)基）將大腸桿菌接種在LB液體培養(yǎng)基中,然后將三角瓶放在恒溫搖床培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)12h，溫度控制在37℃左右。進行擴大培養(yǎng)，增加大腸桿菌的數(shù)量。為什么要振蕩培養(yǎng)？培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿均需倒置擺放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h，恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，并凝結成水滴留在培養(yǎng)皿的蓋上；水蒸氣形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并且擴散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則菌落中的菌會隨水擴散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達不到分離的目的。5.培養(yǎng)固體培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)的基本程序培養(yǎng)基的配制—稱量→溶化→調(diào)pH→分裝→包扎滅菌（高壓蒸汽滅菌）——保證無菌條件接種固體培養(yǎng)基—平板劃線（接種環(huán)）、稀釋涂布（玻璃刮刀）液體培養(yǎng)基—用接種環(huán)蘸取菌液（擴大培養(yǎng)）培養(yǎng)固體培養(yǎng)基—倒置，37℃恒溫培養(yǎng)箱，24h左右液體培養(yǎng)基—空氣浴或水浴培養(yǎng)箱（搖床），震蕩培養(yǎng)固體培養(yǎng)基—劃線的末端出現(xiàn)單菌落液體培養(yǎng)基—培養(yǎng)液變渾濁觀察

廢棄菌種和培養(yǎng)基滅菌后丟棄

三、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)1、菌種的篩選

以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基分離尿素分解菌。2、微生物的計數(shù)方法（1）稀釋涂布平板法（活菌計數(shù)）選擇菌落數(shù)在30-300的平板進行計數(shù)。兩個或多個菌落往往連在一起，統(tǒng)計的菌落數(shù)一般比活菌的實際數(shù)目低。稀釋涂布平板法血球計數(shù)板（2）顯微鏡直接計數(shù)法

尿素分解菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，pH升高，培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，顏色會變紅。3、菌種的鑒定對照

剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物。當纖維素被分解后，出現(xiàn)透明圈。通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。四、分解纖維素的微生物的分離果酒和果醋的制作1、酵母菌的形態(tài)、結構、繁殖方式、分布一、果酒的制作原理①結構：真核生物思考：真核生物和原核生物的區(qū)別？原核生物有無其它細胞器？②異化作用的類型：兼性厭氧型酵母菌是一種腐生真菌，只能利用環(huán)境中有機物而不能將無機物合成為有機物，故為異養(yǎng)，酵母菌是真核生物，有線粒體，有氧氣存在是進行有氧呼吸，無氧氣時進行無氧呼吸，所以酵母菌為異養(yǎng)需氧型或異養(yǎng)厭氧型③生殖方式：出芽生殖a.有氧條件下

C6H12O6+6O26CO2+6H2O進行有氧呼吸，大量繁殖。b.無氧條件下，酵母菌能進行酒精發(fā)酵。C6H12O62C2H5OH+2CO22、果酒的制作原理3發(fā)酵所需的適宜條件：溫度：18℃~25℃，20℃左右是最適宜溫度（2）傳統(tǒng)發(fā)酵技術所使用的酵母菌的來源：附著在葡萄皮上的野生型酵母菌。簡述果酒、果醋制作的基本過程。①對發(fā)酵瓶、紗布、榨汁器等用具進行清洗并消毒。②取葡萄500g，用清水沖洗葡萄1－2次除去污物。（注意沖洗次數(shù)不宜太多）③去除枝梗和腐爛的葉子。④榨汁后裝入發(fā)酵瓶。⑤將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度（18～25℃）下發(fā)酵。⑦10天后，取樣檢驗。⑥簡易裝置2－4天排氣一次。（擰松瓶蓋）釀酒：酵母菌利用果汁里的糖進行無氧呼吸產(chǎn)生酒精二、果醋的制作原理醋酸菌是一種好氧細菌，只有當氧氣充足時才能進行旺盛的生理活動。最適生長溫度30－35。CC2H5OH+O2CH3COOH+H2O氧氣、糖源充足葡萄汁中的糖分解成醋酸糖源不足將乙醇變?yōu)橐胰?，再將乙醛變?yōu)榇姿?、醋酸菌果酒和果醋的發(fā)酵裝置示意圖出料口充氣口排氣口有氧制醋簡述果酒、果醋制作的基本過程。①對發(fā)酵瓶、紗布、榨汁器等用具進行清洗并消毒。②取葡萄500g，用清水沖洗葡萄1－2次除去污物。（注意沖洗次數(shù)不宜太多）③去除枝梗和腐爛的葉子。④榨汁后裝入發(fā)酵瓶。⑤將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度（18～25℃）下發(fā)酵。⑦10天后，取樣檢驗。⑧加入醋酸菌或醋曲，然后移至30－35℃條件下發(fā)酵，適時充氣。⑥簡易裝置2－4天排氣一次。（擰松瓶蓋）1.制葡萄醋時，為什么要適時通過充氣口充氣？2.為什么空氣要用棉花過濾？甲瓶中的酒水混合物和乙瓶中的鋸末都含有微生物可利用的養(yǎng)分，進入的空氣含有大量微生物，經(jīng)棉花過濾可防止微生物進入。思考：答：醋酸菌是好氧菌，在將酒精變?yōu)榇姿釙r需要氧的參與，因此要適時向發(fā)酵液中充氣。三、果酒和果醋實驗流程示意圖。挑選葡萄沖洗榨汁酒精發(fā)酵醋酸發(fā)酵果酒果醋一腐乳的制作原理：做腐乳時起作用的微生物：毛霉的結構：毛霉的生殖方式：制作腐乳的原理：青霉,酵母,曲霉和毛霉等多種微生物的協(xié)同作用，起主要作用的是毛霉。絲狀真菌，有直立菌絲和匍匐菌絲孢子生殖毛霉等微生物產(chǎn)生的以蛋白酶為主各種酶能將豆腐中的蛋白質分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸，與醇類作用生成酯;淀粉酶可將淀粉水解成糖二制作流程：讓豆腐長毛加鹽腌制加鹵湯裝瓶密封腌制注意：溫度控制25－28℃；豆腐的水分控制在70％左右瓶口的鹽厚一點可以抑制微生物生長避免豆腐腐敗，加鹽還可以析出豆腐中水分，使豆腐塊變硬加12％左右的酒以抑制微生物的生長使腐乳有香味封瓶時瓶口通過酒精燈火焰防治瓶口污染四、泡菜的制作和亞硝酸鹽的測定

1、原理

乳酸菌在無氧條件下進行發(fā)酵。（乳酸菌：原核生物，異養(yǎng)厭氧型）2、流程原料切分成片狀加入調(diào)味料，裝壇泡菜鹽水密閉發(fā)酵成品測亞硝酸鹽含量溫度控制26－30℃3、亞硝酸鹽的測定泡菜中會產(chǎn)生一定量的亞硝酸鹽，在發(fā)酵過程中含量先增后減。亞硝酸鹽可以與特定的顯色劑形成玫瑰紅色（紫紅色）產(chǎn)物。含量多少可用比色法測定。

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