微生物的代謝調(diào)控和代謝工程

第八章微生物的代謝調(diào)控與代謝工程第一節(jié)微生物代謝的自我調(diào)節(jié)第二節(jié)微生物的代謝調(diào)控第三節(jié)提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法第四節(jié)代謝工程第一節(jié)微生物代謝的自我調(diào)節(jié)微生物代謝是受到高度調(diào)節(jié)的，如下事實可以說明1）微生物生長在含單一有機化合物為能源的合成培養(yǎng)基中，所有大分子單體（如氨基酸）的合成速率同大分子（如蛋白質(zhì)）的合成速率協(xié)調(diào)一致，不會浪費能量去合成那些他們用不著的東西。2）任何一種單體的合成，如能從外源獲得并能進入細胞內(nèi)，單體的合成自動停止，參與這些單體生成的酶的合成也會停止；3）微生物只有在有某些有機基質(zhì)（如乳糖）存在時，才會合成異化這些基質(zhì)的酶；4）如存在兩種有機基質(zhì)，微生物會先合成那些能異化更易利用的基質(zhì)的酶，待易利用的基質(zhì)耗竭才開始誘導(dǎo)分解較難利用的基質(zhì)的酶；5）養(yǎng)分影響生長速率，從而相應(yīng)改變細胞大分子的組成（如RNA含量）微生物自我調(diào)節(jié)的部位：1、養(yǎng)分吸收分泌的通道大多數(shù)親水分子難于透過細胞膜，需借助一些負責(zé)運輸?shù)拿赶到y(tǒng)（如透酶）才得以實現(xiàn)；有些是需能的。2、限制基質(zhì)與酶的接近

在真核生物中，各種代謝庫的基質(zhì)分別存在于由胞膜分隔的細胞器內(nèi)，如在鏈孢霉中精氨酸存在于細胞質(zhì)和液泡內(nèi)，這兩處參與精氨酸代謝的酶量有很大的差別。原核生物的控制方式不同，其中有些酶是以多酶復(fù)合物或以細胞膜結(jié)合的方式存在，類似于酶的固定化形式，使它不能自由活動。3、代謝途徑通量的控制微生物控制代謝物流的方法有兩種：

調(diào)節(jié)現(xiàn)有酶的量、改變已有酶分子的活性

微生物自我調(diào)節(jié)的三個部位實際上也就是三個類型，但都涉及到酶促反應(yīng)調(diào)節(jié)。

酶促調(diào)節(jié)的方式包括酶活性調(diào)節(jié)和酶合成調(diào)節(jié)兩大類一、酶活性調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)方式共價修飾變(別)構(gòu)效應(yīng)締合與解離競爭性抑制二、酶合成的調(diào)節(jié)

凡是能促進酶合成的調(diào)節(jié)稱為誘導(dǎo)；而能阻礙酶合成的調(diào)節(jié)稱為阻遏。

酶合成的調(diào)節(jié)是一種通過調(diào)節(jié)酶的合成量進而調(diào)節(jié)代謝速率的調(diào)節(jié)機制，這是一種在基因水平上（在原核生物中主要在轉(zhuǎn)錄水平上）的代謝調(diào)節(jié)。

同調(diào)節(jié)酶的活性的反饋抑制等相比，通過調(diào)節(jié)酶的合成而實現(xiàn)代謝調(diào)節(jié)的方式是一類較間接而緩慢的調(diào)節(jié)方式；其優(yōu)點是通過阻止酶的過量合成，有利于節(jié)約生物合成的原料和能量。

一）酶合成調(diào)節(jié)的類型誘導(dǎo)阻遏末端產(chǎn)物阻遏分解代謝產(chǎn)物阻遏組成酶不依賴于酶底物或類似物的存在而合成

如葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸過程中的各種酶誘導(dǎo)酶依賴于某種底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成

如大腸桿菌乳糖利用酶1、酶合成的誘導(dǎo)（induction）

誘導(dǎo)劑可以是誘導(dǎo)酶的底物，也可是底物的結(jié)構(gòu)類似物

如：乳糖是大腸桿菌-半乳糖苷酶合成的誘導(dǎo)劑，也是此酶的底物[實際上乳糖不是真正的誘導(dǎo)物，它必須先轉(zhuǎn)化為別乳糖才能起誘導(dǎo)劑的作用]誘導(dǎo)劑也可以不是該酶的作用底物

如異丙基--D-硫代半乳糖苷（IPTG）是-半乳糖苷酶合成的極佳誘導(dǎo)劑，但不是作用底物；酶的作用底物不一定有誘導(dǎo)作用

如對硝基苯--L-阿拉伯糖苷是-半乳糖苷酶的底物，但不能誘導(dǎo)該酶的合成。2、酶合成的阻遏(repression)末端產(chǎn)物阻遏(end-productrepression)分解代謝物阻遏(cataboliterepression)指由某代謝途徑末端產(chǎn)物過量積累而引起的阻遏。末端產(chǎn)物阻遏(end-productrepression)末端產(chǎn)物阻遏在代謝調(diào)節(jié)中有重要作用，保證細胞內(nèi)各種物質(zhì)維持適當(dāng)?shù)臐舛?；普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成途徑中。分解代謝物阻遏(cataboliterepression)——是指兩種碳源（或氮源）分解底物同時存在時，細胞利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)分解酶合成的現(xiàn)象。or——當(dāng)培養(yǎng)基中同時存在有多種可供利用的底物時，某些酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，這就是分解代謝阻遏。最典型的例子是細胞通過最易利用的碳源（如葡萄糖）的分解產(chǎn)物來抑制一些酶的合成。這個現(xiàn)象最早在青霉素的生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，可快速利用的葡萄糖致使青霉素產(chǎn)量特別低，而緩慢利用的乳糖卻能較好地生產(chǎn)青霉素。進一步的研究表明，乳糖并不是青霉素合成的特殊前體，它的價值僅在于緩慢利用。被快速利用的葡萄糖的分解產(chǎn)物阻遏了青霉素合成酶的合成。把大腸桿菌培養(yǎng)在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，可明顯看到大腸桿菌經(jīng)歷了兩個對數(shù)期。葡萄糖在第一個周期中被利用。在葡萄糖代謝初期，-半乳糖苷酶和半乳糖苷透性酶的合成受阻遏，使乳糖不被利用。葡萄糖被消耗完后，乳糖代謝所需的酶開始合成，于是出現(xiàn)了利用乳糖的第二個生長周期。阻遏作用并非快速利用的碳源（或氮源）本身作用的結(jié)果；而是其分解代謝過程中所產(chǎn)生的中間代謝物引起；這種抑制青霉素合成及乳糖利用的現(xiàn)象，起初認為只有葡萄糖才會產(chǎn)生，故稱為葡萄糖效應(yīng)。所有可以迅速利用或代謝的能源，都能阻遏異化另一種被緩慢利用能源所需酶的合成分解代謝阻遏涉及到的是一些誘導(dǎo)酶第二節(jié)微生物的代謝調(diào)控但是，在工業(yè)生產(chǎn)中卻往往需要單一地積累某種產(chǎn)品，這些產(chǎn)品的量又經(jīng)常是大大地超出了細胞正常生長和代謝所需的范圍。

因此，要達到過量積累某種產(chǎn)品的目的，提高生產(chǎn)效率，就必須使原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)失去控制，在保證微生物適當(dāng)生存的條件下，建立起新的代謝方式，使微生物的代謝產(chǎn)物按照人們的意志積累。代謝反應(yīng)的協(xié)調(diào)是通過細胞自身的代謝調(diào)控系統(tǒng)對細胞機能實行精細控制來達到的。對于生命過程來說，代謝反應(yīng)的協(xié)調(diào)是必要的；一、克服反饋抑制和反饋阻遏的調(diào)控反饋調(diào)節(jié)反饋抑制反饋阻遏克服反饋調(diào)節(jié)，可從以下兩方面著手：

降低末端產(chǎn)物濃度應(yīng)用抗反饋突變株1、降低末端產(chǎn)物濃度1）營養(yǎng)缺陷型的利用

營養(yǎng)缺陷型是指原菌株因基因突變致使合成途徑中斷，喪失了合成某種必須物質(zhì)的能力，而必須在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)物質(zhì)才能正常生長的突變菌株。

營養(yǎng)缺陷型突變株的代謝流受阻，末端產(chǎn)物減少，解除了末端產(chǎn)物參與的反饋調(diào)節(jié)，可使代謝途徑中的某一中間產(chǎn)物積累。利用營養(yǎng)缺陷型積累直鏈代謝途徑中間代謝產(chǎn)物ABC]DEEaEbEcEd若要積累C，首先要獲得缺失酶c的營養(yǎng)缺陷型。

酶c缺失后，物質(zhì)C便不再轉(zhuǎn)變成物質(zhì)D，不再合成物質(zhì)E。由于這種突變體已不能合成末端產(chǎn)物E，所以就解除了E對酶a和酶b的反饋調(diào)節(jié)。反饋抑制反饋阻遏Ec缺陷C

但是，完全不能合成產(chǎn)物E的突變體，因為不能利用E去進一步合成必須的細胞物質(zhì)，所以無法正常生長。為了保證突變體的正常生長，培養(yǎng)時須提供低濃度的、不足以引起反饋調(diào)節(jié)的物質(zhì)E。這樣高濃度的中間產(chǎn)物C就能積累起來了。例如：利用枯草桿菌的精氨酸缺陷型生產(chǎn)瓜氨酸，利用大腸桿菌的賴氨酸缺陷型生產(chǎn)蘇氨酸，都是這個道理。利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的中間產(chǎn)物ABCDEFGHIJMNKL末端產(chǎn)物L(fēng)和N共同對酶a施以反饋;此外，L抑制酶J1，N抑制酶J2J1J2選用缺失酶J1的突變株，則L的合成受阻。L和N共同對酶a的反饋被解除。又由于酶J2還受到N的調(diào)節(jié)，只有少量的J能轉(zhuǎn)變成N，于是中間產(chǎn)物J大量積累。J1缺陷J

谷氨酸棒桿菌的IMP合成途徑和代謝調(diào)節(jié)工業(yè)上用谷氨酸棒桿菌的腺苷酸缺陷型生產(chǎn)肌苷酸（IMP）即是此例的應(yīng)用。在分支途徑中，如果減少某一末端產(chǎn)物的濃度，常常可以積累另一末端產(chǎn)物。利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑末端產(chǎn)物工業(yè)上應(yīng)用的重要例子是賴氨酸發(fā)酵C.glutamicum

的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn)◆

天冬氨酸半醛生成高絲氨酸的途徑受阻之后，蘇氨酸的生成減少?！籼K氨酸與賴氨酸合作進行的反饋抑制便被打破，于是賴氨酸能夠大量積累。

降低末端產(chǎn)物濃度(continued)2）滲漏缺陷型的利用滲漏缺陷型——是一種特殊的營養(yǎng)缺陷型，是遺傳性代謝障礙不完全的突變型。其特點是酶活力下降而不完全喪失，并能在基本培養(yǎng)基上少量生長。

不會產(chǎn)生過量的末端產(chǎn)物，因而可以避開反饋調(diào)節(jié)，但它又能合成微量的末端產(chǎn)物，用來進行生物合成；在培養(yǎng)這種突變體時，可不必在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的物質(zhì)，就能積累所需的產(chǎn)物。滲漏缺陷型的獲得方法：把大量營養(yǎng)缺陷型菌株接種在基本培養(yǎng)基平板上，挑選生長特別慢而菌落小的即可。應(yīng)用實例:利用滲漏型育成天門冬氨轉(zhuǎn)甲酰酶活力提高500倍的菌株該菌株為尿嘧啶滲漏缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中少量的尿嘧啶消耗后，為尿嘧啶所反饋抑制的天門冬氨轉(zhuǎn)甲酰酶活力增加500倍3）提高細胞滲透性細胞內(nèi)合成的發(fā)酵產(chǎn)物若要分泌到培養(yǎng)基中，必須經(jīng)過細胞膜和細胞壁。如果產(chǎn)物不易分泌出細胞，而積累在細胞內(nèi)，則會引起反饋調(diào)節(jié)。改變細胞膜和細胞壁的通透性，使其有利于產(chǎn)物的分泌，也是降低末端產(chǎn)物濃度的一種途徑。

降低末端產(chǎn)物濃度(continued)谷氨酸生產(chǎn)菌的細胞膜磷脂含量高時，細胞的通透性較差，磷脂含量低時，通透性較好。通常在培養(yǎng)基中添加一些控制因素，以達到影響細胞膜磷脂含量的目的。如可使用青霉素來使細胞壁的完整合成受阻。細胞壁和細胞膜的通透性增大后，產(chǎn)物易于泄出，于是就降低了谷氨酸在細胞內(nèi)的積累。2、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的利用

在以積累末端產(chǎn)物為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，如果代謝途徑單一無分枝，往往不能選用營養(yǎng)缺陷型突變株。要提高產(chǎn)量，最好采用抗反饋調(diào)節(jié)突變株。

抗反饋調(diào)節(jié)突變株是一種解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機制的突變型菌株。其特點是所需產(chǎn)物不斷積累，不會因其濃度超量而終止生產(chǎn)?？狗答佌{(diào)節(jié)突變株的獲得：抗反饋突變株通?？梢杂锰砑幽┒水a(chǎn)物類似物的方法來篩選獲得。可否直接用產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)的末端產(chǎn)物來進行篩選？

在工業(yè)上，生產(chǎn)氨基酸、嘌呤、嘧啶和維生素的生產(chǎn)菌種大都是抗反饋突變株。二、克服分解代謝阻遏的調(diào)控生產(chǎn)中要克服分解代謝阻遏可采取下列措施1、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源克服分解代謝阻遏的調(diào)控(continued)

可采用相對來說不引起分解代謝阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有機酸和黃豆餅粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培養(yǎng)熒光假單胞菌，由于克服了半乳糖的分解代謝阻遏，結(jié)果在細胞中所產(chǎn)生的纖維素酶提高了1500倍。2、流加碳源或氮源

在考慮經(jīng)濟效益而必須使用有阻遏作用的碳源或氮源時，緩慢流加碳、氮源可使分解代謝產(chǎn)物維持在較低的水平上，而不至于產(chǎn)生阻遏?？朔纸獯x阻遏的調(diào)控(continued)

如調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白失活，不能與末端分解代謝產(chǎn)物結(jié)合；或操縱基因發(fā)生突變使阻遏蛋白不能與其結(jié)合，都能獲得抗分解代謝阻遏的突變株。3、利用抗分解代謝阻遏的突變體克服分解代謝阻遏的調(diào)控(continued)篩選方法：

在以酶受阻遏的底物為唯一氮源的培養(yǎng)基上，選擇能正常生長的菌落。例如：

把鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)在葡萄糖-脯氨酸瓊脂上，因為脯氨酸氧化酶被葡萄糖阻遏，所以采用脯氨酸為唯一氮源。未突變菌株的脯氨酸氧化酶被阻遏，而無法利用脯氨酸作為氮源，菌株不能生長；抗分解代謝阻遏突變株則能夠利用脯氨酸而正常生長?？朔纸獯x阻遏的調(diào)控(continued)三、對誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的控制

在生產(chǎn)上為了提高誘導(dǎo)酶的產(chǎn)量，對誘導(dǎo)調(diào)節(jié)控制的常用手段有：1、添加誘導(dǎo)物類似物

在誘導(dǎo)物就是酶的底物的情況下，添加底物類似物來加強誘導(dǎo)作用是最好的。因為底物類似物不易被所形成的酶分解，而在細胞中始終保持較高的濃度，能夠持續(xù)地誘導(dǎo)酶的合成，獲得較高濃度的酶。例如:

用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)-半乳糖苷酶的合成2、添加輔酶或輔助因子在有些情況下，必須在培養(yǎng)基中添加輔酶才會產(chǎn)生誘導(dǎo)作用例如：丙酮酸脫羧酶的合成需有硫胺存在3、利用組成型突變株突變可以除去酶合成時對誘導(dǎo)物的依賴組成酶突變株在沒有誘導(dǎo)物存在時，能照常合成誘導(dǎo)酶在生產(chǎn)中使用組成酶突變株時，可不必在發(fā)酵液中添加誘導(dǎo)物，且產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶活性也比原菌株強。例如

把大腸桿菌半乳糖苷酶的誘導(dǎo)型菌株經(jīng)誘變處理后，先在含乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，由于組成型突變株半乳糖苷酶的合成不需誘導(dǎo)即能產(chǎn)生，因此可較誘導(dǎo)型的出發(fā)菌株較早開始生長，在一定時間內(nèi)菌數(shù)的增加便較快。

如持續(xù)進行培養(yǎng)，由于誘導(dǎo)酶形成后，原菌株生長速率亦逐漸增加，這種選擇性造成的差別就會減少。

可用交替在乳糖、葡萄糖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法。兩者利用葡萄糖時的生長速率是相同的，乳糖為碳源造成的組成型菌株的優(yōu)勢生長會持續(xù)下去。在平板上識別組成型突變株的方法，主要是利用在無誘導(dǎo)物存在時進行培養(yǎng)，它能產(chǎn)生酶，加入適當(dāng)?shù)牡孜镞M行反應(yīng)顯示酶活以識別。如甘油培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)大腸桿菌時，誘導(dǎo)型菌株不產(chǎn)酶，組成型菌株可產(chǎn)生半乳糖苷酶。菌落長出后噴布鄰硝基苯半乳糖苷，組成型菌株的菌落由于能水解它而呈現(xiàn)硝基苯的黃色，誘導(dǎo)型則無顏色變化。通常使用酶解后可以有顏色變化的底物，便于迅速檢出組成型菌落。

第三節(jié)提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法一、提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法菌種方面1.除去誘導(dǎo)物——選育組成型產(chǎn)生菌2.解除分解代謝阻遏——篩選抗分解代謝阻遏突變株3.解除反饋抑制——篩選抗反饋抑制突變株4.防止回復(fù)突變的產(chǎn)生和篩選負變菌株的回復(fù)突變株5.篩選抗生素抗性突變株6.選育條件抗性突變株選育條件抗性突變株其中溫度敏感突變株常被用于提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量如：乳糖發(fā)酵短桿菌的溫度敏感突變株，在30℃生長良好，在37℃生長微弱；但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸，而野生型菌株卻受生物素的反饋抑制在富含生物素的天然培養(yǎng)基中進行發(fā)酵時，可先在正常溫度下進行培養(yǎng)以得到大量菌體，適當(dāng)時間后提高溫度，可獲得谷氨酸的過量生產(chǎn)。提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）工藝方面1、使用誘導(dǎo)物與糖類和蛋白質(zhì)降解有關(guān)的水解酶類大都屬誘導(dǎo)酶類，因此向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物就會增加胞外酶的產(chǎn)量。如:加入槐糖（1，2--D-葡二糖）誘導(dǎo)木霉菌的纖維素酶的合成；木糖誘導(dǎo)半纖維素酶和葡萄糖異構(gòu)酶的生成但誘導(dǎo)物的價格往往比較貴，經(jīng)濟上未必合算加入廉價的含誘導(dǎo)物的原料是一種常用的方法。提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）

如：槐豆莢等某些種子皮中含有槐糖；玉米芯富含木聚糖，培養(yǎng)過程中可陸續(xù)被水解產(chǎn)生槐糖、木糖2、降低分解代謝產(chǎn)物濃度，減少阻遏的發(fā)生

高分子的多糖類、蛋白質(zhì)等的分解代謝產(chǎn)物（如能被迅速利用的單糖、氨基酸及脂肪酸等）都會阻遏分解其聚合物的水解酶的生成。采用限量流加這類物質(zhì)或改用難以被水解的底物的方法，可減少阻遏作用的發(fā)生，而獲得較高的酶產(chǎn)量。提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）3、改變細胞膜的通透性提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）4、調(diào)節(jié)生長速率

在酶的誘導(dǎo)合成研究中發(fā)現(xiàn)，一些物質(zhì)具有誘導(dǎo)效應(yīng)及難被利用，與其只能維持較低的生長速率有關(guān)；而起阻遏作用的物質(zhì)則都是易被利用和能維持高生長速率。估計這是誘導(dǎo)、阻遏的發(fā)生都與產(chǎn)能代謝有關(guān)而造成的。因此，改變培養(yǎng)條件如溫度、供氧量等以控制生長速率，也能獲得一定效果。提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）5、加入酶的競爭性抑制劑

烏頭酸酶葡萄糖→丙酮酸→乙酰輔酶A→檸檬酸——→異檸檬酸單氟乙酸在微生物細胞內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏鷻幟仕?，對烏頭酸酶有競爭抑制作用。

因此，向培養(yǎng)基中加入單氟乙酸可導(dǎo)致檸檬酸的積累，減少異檸檬酸的生成。提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）1、補加前體類似物如青霉素G的生產(chǎn)中，苯乙酰-CoA是限速因子補加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的產(chǎn)量。次級代謝產(chǎn)物形成中并不是所有前體類似物都是限速因子。加入前體提高產(chǎn)量的效果更取決于總體代謝的調(diào)節(jié)水平二、提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法工藝方面2、加入誘導(dǎo)物

把一些對次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生有誘導(dǎo)作用的物質(zhì)加入發(fā)酵培養(yǎng)基中可增加產(chǎn)量如加蛋氨酸或硫脲可使頂頭孢霉增產(chǎn)頭孢霉素C提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）3、防止碳分解代謝阻遏或抑制的發(fā)生

青霉素發(fā)酵中限量流加葡萄糖或糖蜜以減少碳分解阻遏的發(fā)生

使用寡糖、多糖等緩慢利用的碳源

加入影響糖代謝的硫氰酸芐酯可使金霉菌對葡萄糖的利用速度減慢，增加金霉素的產(chǎn)量提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）4、防止氮代謝阻遏的發(fā)生

避免使用高濃度的銨鹽作氮源以防止氮代謝阻遏的發(fā)生，是抗生素工業(yè)成熟的經(jīng)驗提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）1、篩選耐前體或前體類似物的突變株

加入前體有提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的效果，但過量對菌體又會有毒害篩選對前體有抗性的突變株，可獲得高產(chǎn)提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）菌種方面2、選育抗抗生素突變株

鏈霉素、氯霉素、金霉素等多種抗生素都具有抑制產(chǎn)生自身菌體蛋白的能力。一株高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌，必然應(yīng)具備對自身所分泌的抗生素的抗性。篩選抗抗生素產(chǎn)生菌也就成了菌種選育中常用的方法。提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）3、篩選營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株

次級代謝產(chǎn)物都來自初級代謝產(chǎn)物，因此其營養(yǎng)缺陷型的產(chǎn)量一般都很低。但其回復(fù)突變型中卻有不少獲得高產(chǎn)的例子，其機制尚不清楚，估計是次生產(chǎn)物或其前體合成的反饋抑制被解除提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法（continued）第四節(jié)代謝工程一、代謝工程概述1、代謝工程的基本定義代謝工程(MetabolicEngineering)——利用生物學(xué)原理，系統(tǒng)分析細胞代謝網(wǎng)絡(luò)，并通過DNA重組技術(shù)合理設(shè)計細胞代謝途徑及遺傳修飾，進而完成細胞特性改造的應(yīng)用性學(xué)科。

1974年，Chakrabarty在假單胞菌屬的兩個菌種中分別引入幾個穩(wěn)定的重組質(zhì)粒，從而提高了對樟腦和萘等復(fù)雜有機物的降解活性。這是代謝工程技術(shù)應(yīng)用的第一實例。1991年JamesE.Bailey(CaliforniaInstituteofTechnology)

首次使用該術(shù)語又稱

途徑工程(Pathwayengineering)代謝工程的實質(zhì)在于對代謝流量及代謝控制進行定量分析，在此基礎(chǔ)上進行代謝改造，最大限度地提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。2、代謝工程的基本過程1）靶點設(shè)計最后，根據(jù)代謝流分布和控制的分析結(jié)果確定途徑操作的合理靶點。通常包括擬修飾基因的靶點、擬導(dǎo)入途徑的靶點或擬阻斷途徑的靶點等。至少包括三個基本過程代謝工程的一個顯著特點是工作的定向性，它在修飾靶點選擇、實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析等方面占據(jù)絕對優(yōu)勢；相當(dāng)數(shù)量的代謝途徑已進行了鑒定，并繪制出較完整的代謝網(wǎng)絡(luò)圖，這為代謝工程的實施奠定了基礎(chǔ)；

正確的靶點設(shè)計還必須對現(xiàn)有的代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)信息進行更深入的分析。首先，根據(jù)化學(xué)動力學(xué)和計量學(xué)原理定量測定網(wǎng)絡(luò)中的代謝流分布（即代謝流分析;Metabolicfluxanalysis,MFA），其中最重要的是細胞內(nèi)碳和氮元素的流向比例關(guān)系。其次，在代謝流分析的基礎(chǔ)上調(diào)查其控制狀態(tài)、機制和影響因素（即代謝流控制分析；Metabolicfluxcontrolanalysis,MCA）。

靶點設(shè)計對代謝工程的成敗起著關(guān)鍵作用，任何精細的靶點選擇都必須經(jīng)得起細胞生理特性以及代謝網(wǎng)絡(luò)熱力學(xué)平衡的檢驗。代謝工程的基本過程(continued)2)基因操作

利用代謝工程戰(zhàn)略修飾改造細胞代謝網(wǎng)絡(luò)的核心是在分子水平上對靶基因或基因簇進行遺傳操作。其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表達、修飾、敲除、調(diào)控以及重組基因在目標(biāo)細胞染色體DNA上的穩(wěn)定整合。代謝工程的基本過程(continued)3）效果分析一次性的代謝工程設(shè)計和操作往往不能達到實際生產(chǎn)所要求的產(chǎn)量、速率和濃度，因為大部分實驗涉及的只是單一代謝途徑有關(guān)的基因、操縱子或基因簇的改變。

通過對新代謝進行全面的效果分析，這種由初步途徑操作構(gòu)建出來的細胞所表現(xiàn)出的限制與缺陷，可以作為新一輪實驗的改造目標(biāo)。代謝工程的基本過程(continued)二、代謝工程的研究對象簡單地說，代謝工程的研究對象就是代謝網(wǎng)絡(luò)

細胞分解代謝途徑、合成代謝途徑和膜傳輸系統(tǒng)的有序組合構(gòu)成代謝網(wǎng)絡(luò)。廣義的代謝網(wǎng)絡(luò)包括物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)和能量代謝網(wǎng)絡(luò)。代謝網(wǎng)絡(luò)分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點（Node）。其中對終產(chǎn)物合成起決定作用的少數(shù)節(jié)點稱為主節(jié)點。

主節(jié)點不是固定不變的。三、代謝工程的應(yīng)用

代謝工程的目的在于構(gòu)建具有新的代謝途徑，能生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物或具有過量生產(chǎn)能力的工程菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

根據(jù)微生物的不同代謝特性，代謝工程的應(yīng)用主要表現(xiàn)在以下三個方面：改變