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文檔簡介

病原生物學試驗課件NK活性測定NK細胞NK細胞屬于固有免疫細胞。NK殺傷靶細胞時既不需要特異性抗體參與，也不需要抗原預先致敏的淋巴細胞。在抗腫瘤和抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。MTT法檢測NK細胞活性原理：將NK細胞和靶細胞共同培養(yǎng)，NK細胞可殺傷靶細胞，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶使外源性黃色的MTT還原成藍紫色的Formazan結(jié)晶，并沉積在細胞里。而死細胞無此功能，通過比色檢測可以檢測培養(yǎng)物中活細胞的數(shù)量，從而計算NK細胞殺傷靶細胞的能力。NK活性檢測效應(yīng)細胞：NK細胞（小鼠脾臟細胞）靶細胞：Yac-1細胞（實驗員準備）2、靶細胞的制備（實驗員準備）：取對數(shù)生長期YAC-1細胞，Hanks液洗滌2次，計數(shù)，調(diào)整至2×105/ml。實驗組靶細胞對照組效應(yīng)細胞對照組靶細胞100μl100μl－效應(yīng)細胞100μl－100μl1640培養(yǎng)基－100μl100μl3、細胞毒試驗（96培養(yǎng)板）：每組做3個復孔NK細胞制備：小鼠脾細胞分離脫臼法處死小鼠，酒精棉球消毒皮膚，取脾，放入濾網(wǎng)，置于平皿中，在濾網(wǎng)脾臟處加入3mlHanks液;用試管底部碾磨脾臟，制成脾細胞懸液，200目濾網(wǎng)制成單細胞懸液;離心（1500轉(zhuǎn)/分5min），棄去上清;加入Hanks液約3ml，重懸細胞，1500轉(zhuǎn)/分5min，去上清，加入約1ml1640培養(yǎng)液，混勻細胞；細胞計數(shù)：取細胞懸液10微升，加到含有390微升白細胞稀釋液的Eppendorf管中，混勻，取適量細胞懸液（約15ul），加入計數(shù)板中。在顯微鏡下計數(shù)，計算細胞數(shù)量。根據(jù)細胞數(shù)量，用1640完全培養(yǎng)基配成2×106/ml濃度的細胞懸液。

4、孵育

二氧化碳培養(yǎng)箱孵育2小時；加10μl

MTT，繼續(xù)孵育2小時。5、測OD值

吸取上清約150ul，加150μl

二甲亞砜，振蕩10min，測OD值。（1-實驗組OD值-效應(yīng)細胞對照組OD值靶細胞對照組OD值）×100%NK細胞活性（%）=6、結(jié)果分析DBCA

A

BCD細胞計數(shù)計算公式一大格細胞數(shù)10440（稀釋倍數(shù)）舉例：10010440=4107稀釋：取0.1ml細胞原液，加入1.9ml培養(yǎng)液，即為2106/ml

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