TILLING(定向誘導(dǎo)基因組局部突變)技術(shù)原理及其路線(xiàn)

TILLING(定向誘導(dǎo)基因組局部突變)技術(shù)原理及其路線(xiàn)

TILLING是后基因組時(shí)代出現(xiàn)的，一種將烷基化試劑EMS或輻射誘導(dǎo)的位點(diǎn)突變技術(shù)，與特定基因的PCR擴(kuò)增技術(shù)和突變單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)或下一代基因俘獲高效測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的反相遺傳學(xué)方法。提供了一種幾乎對(duì)所有物種都適應(yīng)的、低成本、高通量和自動(dòng)化的誘發(fā)突變篩選技術(shù)。該技術(shù)也可用于天然群體自發(fā)突變的篩選，稱(chēng)之為Eco-TILLING。圖.基因誘變組學(xué)的正向和反向遺傳學(xué)操作的路標(biāo)。

技術(shù)特點(diǎn)點(diǎn)突變是隨機(jī)分布的飽和突變，可獲得大量的等位基因系列，對(duì)長(zhǎng)度很小的基因，復(fù)等位基因等具有獨(dú)特的反向遺傳學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì)。誘變頻率高，為篩選特定目的基因所需的突變?nèi)后w小。不依賴(lài)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標(biāo)簽系統(tǒng)，無(wú)需耗時(shí)的基因操作和繁瑣的組織培養(yǎng)。但需要預(yù)先知道所研究基因的序列。操作流程操作流程1）用甲基磺酸乙酯處理種子誘導(dǎo)位點(diǎn)突變；

2）播種誘變處理種子，按單株種植得到誘變M1代植株；

3）播種M1代種子得到誘變M2代植株，自交獲得M2代種子并保存建庫(kù)；

4）按單株提取M2代組織DNA，存放于96孔微孔板建庫(kù)；

5）5-8倍混合單株DNA庫(kù)，構(gòu)建DNA樣品池以增加掃描通量；

6）針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性引物，采用700nm和800nm熒光染料標(biāo)記引物，對(duì)DNA目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

7）PCR的擴(kuò)增片段經(jīng)變性、退火，得到野生型和突變型堿基錯(cuò)配的異源雙鏈核酸分子；

8）用特異性識(shí)別并切割錯(cuò)配堿基的核酸內(nèi)切酶celⅠ切割異源雙鏈核酸分子，在錯(cuò)配位點(diǎn)單鏈的3端切開(kāi)；

9）變性酶切產(chǎn)物得到完整單鏈(無(wú)突變堿基)和單鏈片段（突變點(diǎn)被切開(kāi)所致）；

10）酶切產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；

11）用Photoshop對(duì)凝膠進(jìn)行圖像分析，如某一泳道有突變帶，則在700nm和800nm的圖像中，均會(huì)在野生型條帶下方看到一個(gè)新的條帶，這2個(gè)條帶片段大小之和等于野生型條帶長(zhǎng)度，由新增2個(gè)條帶的移動(dòng)距離可以大體上估計(jì)突變距目標(biāo)區(qū)域5或3的距離；

12）回溯發(fā)現(xiàn)帶有突變的DNA池對(duì)應(yīng)的保存樣品，重復(fù)5-11過(guò)程鎖定突變單株。TILLING分析過(guò)程。a.1）使用熒光染料標(biāo)記基因特異性引物，對(duì)DNA池進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2）擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熱變性，然后退火隨機(jī)復(fù)性；3）形成的錯(cuò)配雙鏈DNA分子用S1內(nèi)切酶切割，然后變性；b.切割產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定，以確定基因發(fā)生突變的DNA池。利用LI-COR凝膠系統(tǒng)的IRD700和IRD800兩個(gè)通道測(cè)定5和3標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物大小可以確定突變點(diǎn)在擴(kuò)增片段上的位置，在本例中大概離5端0.2kb，3端0.8kb的距離。

圖.跑膠通道IRD800（左）和IRD700（右）的影像，誘變帶被框出，IRD700中的截圖標(biāo)在最右邊，注意一個(gè)通道的泳道浮現(xiàn)在背景上只有一個(gè)帶，另一通道是相應(yīng)的帶，二者大小相加等于擴(kuò)增產(chǎn)物的全長(zhǎng)（最上端的帶），膠下端泳道的若干的條帶是隨機(jī)錯(cuò)誤引導(dǎo)所產(chǎn)生的小片段。

關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)

1）誘變過(guò)程

誘發(fā)突變既可采用金典的化學(xué)誘變?nèi)鏓MS，也可以采用物理誘變?nèi)巛椛湔T變，或者利用自然突變?nèi)后w。誘變過(guò)程應(yīng)進(jìn)行小規(guī)模的預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)誘變效率和致使效應(yīng)的折衷，選擇適合的誘變劑量。

ＥＭＳ是一種單功能烷化劑，在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成缺電子的活潑中間產(chǎn)物，容易與堿基上的Ｎ原子和磷酸基團(tuán)發(fā)生親核取代反應(yīng)，通過(guò)2條途徑使基因突變。一是堿基的烷基化效應(yīng)，鳥(niǎo)嘌呤（Ｇ）的Ｎ７位易被烷基化，形成帶正電的季銨基團(tuán)，產(chǎn)生２種可遺傳的效應(yīng)：１）促進(jìn)Ｎ１上的Ｈ解離，使Ｇ與Ｔ配對(duì)，導(dǎo)致Ｇ：Ｃ轉(zhuǎn)換成Ａ：Ｔ；２）削弱了Ｎ９位的糖苷鍵，發(fā)生脫嘌呤作用，如果脫嘌呤位點(diǎn)在ＤＮＡ復(fù)制之前未被修復(fù)，則該位點(diǎn)在復(fù)制時(shí)將隨機(jī)插入任何一個(gè)堿基，經(jīng)過(guò)一輪復(fù)制后，可能發(fā)生Ｇ：Ｃ到Ａ：Ｔ的轉(zhuǎn)換，也可能發(fā)生Ｇ：Ｃ到Ｃ：Ｇ或Ｔ：Ａ的顛換；二是磷酸基團(tuán)的烷基化效應(yīng)，磷酸基上的Ｏ原子被烷基化后，形成不穩(wěn)定的磷酸酯，容易發(fā)生水解，使核苷酸從磷酸與五碳糖間切斷，導(dǎo)致ＤＮＡ斷裂，產(chǎn)生染色體缺失。位點(diǎn)突變引起基因功能的改變主要包括：錯(cuò)義突變，無(wú)義突變和剪接突變。

2）突變?nèi)后w為了使突變能夠產(chǎn)生分離表型變異，突變?nèi)后w一般不選嵌合的M1代，而是選擇突變M2代，但是若是花粉誘變則可以選擇其M1代，如玉米品種。在知道誘變頻率的情況，產(chǎn)生目標(biāo)基因突變所需要的群體大小可以估算。3）DNA池

為了提高分析通量，一般構(gòu)建8倍的DNA樣品池，如果品種的突變頻率較高，突變?nèi)后w較小時(shí)，樣品池也可以較小。構(gòu)建基因池時(shí),要確保各個(gè)單株的DNA等量混合，為此一般分析平臺(tái)已采用機(jī)械手加樣。圖.8倍池的構(gòu)建策略。

4）SNP檢測(cè)，酶切產(chǎn)物的凝膠電泳多采用的美國(guó)IE-Col公司的雙色紅外熒光檢測(cè)的專(zhuān)利技術(shù)分析，因?yàn)榧t外光檢測(cè)的背景低，700nm和800nm通道間間沒(méi)有重疊，能有效的排除假陽(yáng)性，可靠的發(fā)現(xiàn)和確定突變。5）改進(jìn)措施圖.（A）傳統(tǒng)TILLING途徑；（B）適應(yīng)于TbyS的途徑

圖.新一代高速測(cè)序流程圖。

應(yīng)用舉例水稻玉米

3）斑馬魚(yú)參考文獻(xiàn)1.High-ThroughputScreeningforInducedPointMutations.PlantPhysiol.2001,126：4802.TILLINGbySequencing(TbyS)fortargetedgenomemutagenesisincrops.MolBreeding.2017,37:143.TILLINGwithoutaplough:anewmethodwithapplicationsforreversegenetics.CurrentOpinioninPlantBiology2005,8:211–2154.DiscoveryofchemicallyinducedmutationsinricebyTILLING.

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