基因工程抗體1

基因工程抗體

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體等。Geneticengineeringantibody單克隆抗體用于治療存在的問題1、單克隆抗體的特異性由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對正常組織有交叉反響；2、異種抗體反響鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致異源性超敏反響理想的抗體藥物的性質(zhì)高特異性和高親和力〔Kd=108~1010L/M〕對人沒有免疫原性，不誘導(dǎo)機(jī)體對抗體的排斥反響游離抗體不激活補體一旦結(jié)合到靶抗原上，能誘導(dǎo)效應(yīng)功能細(xì)胞系穩(wěn)定，適合在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)抗體符合生物制品標(biāo)準(zhǔn)

問題異源蛋白導(dǎo)致產(chǎn)生抗抗體，影響靶向性和效果靶部位攝取的量太低效應(yīng)功能弱在體內(nèi)被去除速度快

對策抗體人源化改變抗體分子大小連接毒素、放射性同位素、藥物抗體人源化抗體治療存在的問題及對策抗體藥物改造的方向抗體人源化和人源抗體制備改變抗體分子大小增強(qiáng)抗體親和力增強(qiáng)抗體效應(yīng)功能單克隆抗體人源化的改進(jìn)鼠抗體人源化〔人-鼠嵌合、改型抗體〕小分子抗體〔Fab、單鏈、單域、超變區(qū)多肽〕基因工程抗體〔雙特異、免疫黏連素、催化抗體〕人源抗體〔噬菌體抗體庫、轉(zhuǎn)基因小鼠〕人-人抗體1、抗體人源化鼠單克隆抗體人源化：嵌合抗體、改型抗體小分子抗體：單價(Fab、ScFv、單域抗體、超變區(qū)多肽)、多價〔Di-,Tri-,Minibody〕特殊類型抗體(雙特異性抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、抗原化抗體、免疫脂質(zhì)體)抗體融合蛋白〔免疫粘連素、免疫毒素、催化抗體〕VH和VL是抗原決定簇結(jié)合位點高變區(qū)HVR決定簇互補區(qū)CDR

骨架區(qū)FRCH1和CL：Ig同種異型的遺傳標(biāo)志CH2：補體結(jié)合位點CH3：某些細(xì)胞Fc受體結(jié)合部位

第一代的抗體人源化—嵌合抗體從雜交瘤細(xì)胞別離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)〔決定免疫原性〕基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體。嵌合抗體由于這兩局部在空間結(jié)構(gòu)上相對獨立，其獨特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時仍有較強(qiáng)的免疫排斥反響。特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時保存了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體第二代的抗體人源化——改型抗體在嵌合抗體的根底上進(jìn)一步將鼠MAb可變區(qū)中相對保守的FR(frameworkregion)替換成人的FR，保存與抗原結(jié)合部位決定簇互補區(qū)〔complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)早期的改型抗體：簡單的CDR移植，通過點突變進(jìn)行微調(diào)即更換某個位點上的氨基酸。第二代改型抗體：①應(yīng)用了人抗體基因庫；②引進(jìn)計算機(jī)技術(shù)模擬抗體分子的立體結(jié)構(gòu)(分子模擬法)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是獲得具有高親和力的治療性抗體

CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體鼠單克隆V區(qū)人源化〔CDR移植〕小分子抗體人源化抗體屬完全的抗體分子。通過基因重組技術(shù)，可以在保持原有抗原結(jié)合活性的根底上，把完整的抗體分子改造成較小的分子，稱為小分子抗體。根據(jù)其價數(shù)的不同可分為單價小分子抗體及多價小分子抗體兩種。單價小分子抗體一、Fab抗體

Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。二、單鏈抗體(ScFv)定義：用基因工程方法，將抗體VH和VL〔重鏈和輕鏈可變區(qū)〕通過一個連接肽連接而成的小分子抗體，功能：具有較好的抗原結(jié)合能力，且分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性低等特性?？膳c其他效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體等的理想而根本的元件。Ag

ScFv應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系三、單域抗體

抗體與抗原的結(jié)合主要由Ig的V區(qū)決定，因此只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或VL一個功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個Ig分子的1／12，故也稱之為小抗體。四.超變區(qū)多肽(hypervariableregionpolypeptides)抗體抗原結(jié)合是經(jīng)過補體決定區(qū)〔CDR〕來實現(xiàn)。因此，CDR是構(gòu)成抗原抗體結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單位。根據(jù)這一特點，可以設(shè)計出那些在抗原識別及親和力方面有重要意義的CDR多肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的結(jié)果。這種只含有一個CDR多肽的抗體，稱為超變區(qū)多肽，亦稱為最小識別單位(minimalrecognitionunit,MRU)。多價小分子抗體在ScFv的根底上，可以把兩個或兩個以上的ScFv重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體〔簡稱多價微抗〕。其中包括雙鏈抗體(diabody)，微型抗體〔minibody〕，三鏈抗體(triabody)及四鏈抗體(tetrabody)等。AgAg一、雙鏈抗體(diabody)

制備方法化學(xué)交聯(lián)法粘性蛋白結(jié)構(gòu)域融合法接頭長度控制法。二、三鏈抗體(triabody)在制備單鏈抗體時，當(dāng)接頭的長度為2個或2個的以下氨基酸殘基時，或者直接把VH結(jié)構(gòu)域的N末端與VL結(jié)構(gòu)域的C末端相連，通過非共價鍵而形成的三聚體，稱為三鏈抗體。接頭長度在3～12個氨基酸殘基時，那么形成雙鏈抗體。三、微型抗體(minibody)通過基因工程手段采用不同的接頭把單鏈抗體(VL-VH)的VH結(jié)構(gòu)域與IgG的CH3結(jié)構(gòu)域融合，形成VL-VH-CH3的結(jié)構(gòu)，稱之為微型抗體〔minibody〕。此種抗體合成后通過CH3結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定二聚體式，發(fā)揮其雙價微抗作用。四、雙特異性抗體〔BfAb〕天然Ig是由兩個完全相同的VL和VH區(qū)域構(gòu)成，該區(qū)域是特異性識別并結(jié)合抗原的關(guān)鍵部位。而經(jīng)人工設(shè)計構(gòu)建的雙特異性抗體〔BsAb〕那么由兩個不同的抗原結(jié)合位點組成，可同時與兩種不同的抗原決定簇結(jié)合，并可將其偶連的藥物、酶或放射性核素等導(dǎo)向到靶部位，這種具有雙價雙特異性的抗體又稱為雙功能抗體〔bifunctionalantibody,BfAb〕雙特異性抗體的特點將免疫細(xì)胞錨著于腫瘤部位，提高腫瘤部位的效靶比。不受MHC的限制，直接激活免疫細(xì)胞的殺瘤機(jī)制。123提高抗體效應(yīng)功能抗體融合蛋白雙特異性抗體偶連細(xì)胞毒物質(zhì)細(xì)胞內(nèi)抗體提高抗體效應(yīng)功能抗體融合蛋白：抗體的一局部被非抗體序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。根據(jù)構(gòu)建方式的不同，主要分為兩種形式：Fc融合蛋白〔Fcfusionprotein,FcFP〕由抗體的Fc段與某些具有特定功能的蛋白結(jié)構(gòu)域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗體的Fc段與2個CD4分子的Ig同源區(qū)重組而成抗原結(jié)合融合蛋白〔antigen-Bindingfusionprotein,ABFP〕由具有抗原結(jié)合功能的抗體結(jié)構(gòu)與其他功能性蛋白融合構(gòu)成。如免疫毒素，抗體局部主要包括嵌合抗體、單鏈抗體形式。免疫粘附素(immunoadhension)：將人抗體恒定區(qū)(主要是Fc段)N-端連接于人細(xì)胞外表的受體分子或細(xì)胞粘附分子上，在真核細(xì)胞中表達(dá)出正確折疊的融合抗體蛋白分子，這種分子可同時發(fā)揮抗體的效應(yīng)功能及其它相應(yīng)的效應(yīng)功能，這種分子又被稱為新效能抗體。免疫毒素：又稱生物導(dǎo)彈，是由導(dǎo)向性的載體分子與具有毒性的彈頭蛋白交聯(lián)而制成，屬于導(dǎo)向藥物的一種。偶連細(xì)胞毒物質(zhì)連接放射性同位素(131I、99mTc〕連接植物或細(xì)菌毒素〔ricin、PE40〕連接細(xì)胞毒性藥物〔C1027、柔紅霉素〕免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA〔α-FcγRI-RicinA〕RicinA:蓖麻毒素A,對腫瘤細(xì)胞具有毒性作用CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2

免疫細(xì)胞因子(Immunocytokine)五、細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞內(nèi)抗體主要是指在細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體，亦稱內(nèi)抗體〔intrabody〕。目前的研究主要集中在單鏈抗體上，在ScFv的C端或N端插入其它靶向信號〔targetingsignals〕，如分泌信號、核定位信號、線粒體定位信號和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號等，從而進(jìn)行檢測、識別、發(fā)揮特定功能。細(xì)胞內(nèi)抗體的應(yīng)用：由于細(xì)胞內(nèi)抗體具有高親和力及選擇結(jié)合特性，因而可通過多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞的生理過程及代謝。作用機(jī)理表現(xiàn)為：阻斷靶蛋白的活性部位阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白－蛋白相互作用干擾細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的轉(zhuǎn)運促使靶蛋白降解六、抗原化抗體〔antigenizedantibody,AbAg〕AbAg是應(yīng)用基因工程技術(shù)，把編碼蛋白質(zhì)抗原表位的核苷酸片段插入重鏈CDR3序列中進(jìn)行表達(dá)，從而產(chǎn)生具有天然抗原表位構(gòu)象和免疫原性的新型抗體。今后抗體藥物開展的方向?qū)ふ倚碌陌锌乖诳乖Ⅲw結(jié)構(gòu)設(shè)計抗體基于抗原-抗體相互作用設(shè)計小分子抗體模擬物最理想的單克隆抗體100%人源人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生25年來的全人抗體的嘗試鼠骨髓瘤不適合與人B細(xì)胞融合穩(wěn)定性差抗體產(chǎn)量低非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(EBV)保存抗體分泌細(xì)胞細(xì)胞株不穩(wěn)定抗體的產(chǎn)量低不能特異性地保存抗體分泌細(xì)胞很難獲得人類骨髓瘤細(xì)胞株成功建立人骨髓瘤細(xì)胞系，人源抗體進(jìn)入新的里程用途：能穩(wěn)定的保持人B細(xì)胞分泌抗體的能力創(chuàng)造人：英國劍橋大學(xué)的DrKarpas教授意義：1在整體水平上研究人類產(chǎn)生抗體2開創(chuàng)人類抗體基因組學(xué)的研究評價：1諾貝爾獎得主DrMilstein推薦發(fā)表在PNAS2世界權(quán)威雜志“科學(xué)〞發(fā)表了新聞評述3劍橋大學(xué)開了新聞發(fā)布會未來單抗開發(fā)的完美方案從治療靶子生產(chǎn)高親和力全人抗體全人抗體挑戰(zhàn)靶分子的篩選開發(fā)未知抗原的治療用抗體42已批準(zhǔn)上市的單抗適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥大腸癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎癥性腸病、類風(fēng)濕CD317-1A血小板受體ⅡbⅢaCD20CD25TNF-аOKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠單抗鼠單抗人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體人－鼠嵌合抗體19861995(德國)1994199719981998、199943適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSVF蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗體人源化抗體人源化抗體人源化抗體－化療藥物交聯(lián)物人源化抗體1997199819982000200144正在進(jìn)行臨床開發(fā)中的基因工程抗體適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段銀屑病IL－8CD11a(IgG1)ICAM-3CD80CD2CD3ABX－IL8Anti-CD11aICM3IDEC-114MEDI-507Smartanti-CD3Human(人源)Humanized(人源化)HumanizedPrimatizedHumanizedHumanized(IgG)ⅡⅠ，Ⅱ臨床前ⅠⅠⅠ/Ⅱ45適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Complement(C5)TNF-аTNF-аTNF-аCD4CD45G1.1D2E7CDP870InfliximabIDEC-151MDX-CD4HumanizedHumanHumanized(Fab)Chimeric(IgG1)(嵌合)Primatized(IgG1)Human(IgG)ⅡⅢⅡFDA批準(zhǔn)（1999）ⅡⅠ46適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段克羅恩病，節(jié)段性回腸炎潰瘍性結(jié)腸炎自身免疫病TNF-аTNF-аа4?7CD4CD3InfliximabCDP571LDP－02OrthoCloneOKT4ASmartanti-CD3Chimeric(IgG1)Humanized(IgG4)HumanizedHumanized(IgG)HumanizedFDA批準(zhǔn)（1998）ⅡⅡⅡⅠ/Ⅱ47適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段系統(tǒng)性紅斑狼瘡多發(fā)性硬化癥C5CD40LCD40LComplement(C5)VLA-4CD40L5G1.1AntovaIDEC-1315G1.1MEDI-507AntegrenIDEC-131HumanizedHumanized(IgG)HumanizedHumanized(IgG)Humanized(IgG)HumanizedⅠⅡ(繼續(xù))ⅡⅠ/ⅡⅡⅡ48適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段自身免疫出血性病癥氣喘/變態(tài)反應(yīng)CD64(FcgR)IL-5IL-5IL-4IgECD23MDX-33SCH55700SB-240563SB-240683rhuMab-E25IDEC-152HumanHumanized(IgG4)HumanizedHumanizedHumanized(IgG1)PrimmatizedⅡⅡⅡⅡⅢⅠ49適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段移植物抗宿主疾病同種異體移植排斥CD147CD2CD2CD3CD3ABX-CBLBTI-322MEDI－507Orthoclone/OKT3SMATanti-CD3Murine(IgM)(小鼠)Rat(IgG)(大鼠)HumanizedMurine(Ig2a)HumanizedⅢⅡⅠ/ⅡFDA批準(zhǔn)（1996）Ⅰ/Ⅱ50適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段同種異體移植排斥CD25CD25?2-integrinCD4CD147ZenapaxSimulectLDP-01OKT4AABX-CBLHumanized(IgG1)Chimeric(IgG1)Humanized(IgG)Humanized(IgG)Murine(IgM)FDA批準(zhǔn)（1997）FDA批準(zhǔn)（1998）Ⅰ/ⅡаⅡⅢ51適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段同種異體移植排斥中風(fēng)青光眼抗凝血劑CD40LCD18?2-integrinTGF－?2FactⅦAntovaAnti-LFA-1LDP-01CAT-152CorsevinMHumanized(IgG)Murine[F(ab’)2]Humanized(IgG)HumanChimeric(Fab)Ⅰ/Ⅱ(繼續(xù))ⅢⅠ/ⅡаⅡⅠ52適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段冠狀血管成形術(shù)并發(fā)癥心肌梗死羅氏肉瘤病毒GlycoproteinⅡbⅢareceptorPDGF?RCD18FproteinReoProAbciximabCDP860Anti-CD18SynagisHumanized(IgG)Humanized[F(ab’)2]Humanized[F(ab’)2]Humanized(IgG1)Ⅰ/ⅡаⅡⅡFDA批準(zhǔn)（1998）53適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段艾滋病乙型肝炎巨細(xì)胞病毒中毒性休克一般癌癥Gp120HepBCMVTNF-аCD14VEGFPRO542OstavirProtovirMAK-195(SEGAND)IC14Anti-VEGFCD4fusionHumanHumanMurine[F(ab’)2]?Humanized(IgG1)ⅡⅡ(批準(zhǔn))ⅢⅢⅠⅢ54適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段卵巢癌結(jié)腸病肺病頭、頸部病變CA12517-1ACellsurfaceantigenAnti-idiotypicGD3epitopeEGFROvaRexPanorexBEC2IMC－C225MurineMurine(IgG2a)Murine(IgG)MerckKGaAChimeric(IgG0Ⅱ/Ⅲ德國批準(zhǔn)（1995）ⅢⅢ55適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段乳腺病慢性淋巴細(xì)胞白血病急性粒細(xì)胞白血病非何杰金淋巴瘤HER2/neuCD52CD33CD20CD22HerceptinCampath1/(LDP03)SmartRituxanLymphoCideHumanized(IgG1)Humanized

(IgG1)M195Chimeric(IgG1)Humanized(IgG)FDA批準(zhǔn)（1998）生物制品許可申請蛋白質(zhì)設(shè)計FDA批準(zhǔn)Ⅰ/Ⅱ56適用病癥靶抗原抗體名稱抗體來源臨床階段非何杰金淋巴瘤黑色素瘤HLAHLADR抗id(GD2)*Smart1D10Oncolym(Lym-1)TriGemHumanizedRadiolabelledmurineMurineⅠⅡ/ⅢⅡ57武漢生物制品研究所研制的注射用鼠源性抗人T淋巴細(xì)胞CD3抗原單克隆抗體是國內(nèi)自行研制最早批準(zhǔn)上市的抗體；北京百泰生物與古巴合作開發(fā)的I類癌癥治療新藥“重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體〞(商品名：泰欣生)是我國批準(zhǔn)的第一個人源化單克隆抗體藥物；58第四軍醫(yī)大學(xué)、成都華神聯(lián)合研制的美妥昔單抗注射液(商品名：利卡汀)是全球第一個用于治療原發(fā)性肝癌的藥物，也是我國第一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗體類藥物。噬菌體展示系統(tǒng)PhageondisplayExponentialgrowthinpublicationsreferringtophagedisplay.ThenumberofMedlinecitationscontainingtheterms‘phage’and‘display’areplottedagainsttheyearofpublication.TIBTECHNOVEMBER1999(VOL17).OfNeedlesandHaystacks噬菌體展示系統(tǒng)Phageondisplay???噬菌體展示原理

–噬菌體展示定義、分類

–簡介噬菌體及淘選過程噬菌體展示應(yīng)用商業(yè)化噬菌體展示系統(tǒng)表型——基因型展示肽——編碼基因什么是噬菌體展示是一項篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的外表，而編碼該融合子的DNA那么位于病毒粒子內(nèi)。使大量多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子〔抗體、酶、細(xì)胞外表受體等〕的多肽配體通過淘選得以快速鑒定。Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。

SmithGP.Science1985;228:1315-7噬菌體展示技術(shù)PhageDisplayTechnologyWhatcanbedisplayed?Proteinsfrom6-300aaShortpeptidesAntibodyfragmentscDNAlibraryenzymes1Panlibrarywithimmobilizedtargets2Washoffunboundphage3Eluteboundphage4Amplifyovernight5Panelutedphage6Isolateindividualcolony3-4?2004MontaropYamabhaiCellFree展示系統(tǒng)DisplaySystem

PhageDisplay CellBased CellSurfaceDisplayRibosomeDisplaymRNADisplay根據(jù)噬菌體不同根據(jù)載體不同根據(jù)文庫不同PhageLibrary噬菌體展示系統(tǒng)的分類Classificationofphagedisplaysystems根據(jù)載體不同VectorTruePhagePhagemid根據(jù)噬菌體不同PhageM13,f1,fdT7,T4,lamda根據(jù)文庫不同Library隨機(jī)肽庫cDNA文庫

抗體文庫 蛋白質(zhì)文庫SchematicrepresentationofM13Phage SchematicrepresentationofT7Phage種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。 與展示密切相關(guān)的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。

DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒。

M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)

StructureofM13filamentousphage絲狀噬菌體：M13、f1和fd。單鏈DNA病毒,6407bp?；蚪M編碼11種蛋白質(zhì)，其中5SchematicrepresentationofM13PhageLifeCycleofM13pIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖毛; 細(xì)菌的Tol蛋白復(fù)合體解聚噬菌體的衣殼蛋白，轉(zhuǎn)運至胞漿〔再用〕;病毒ssDNA進(jìn)入細(xì)菌的胞漿合成dsDNA；

以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中〔37oC〕。感染后1小時內(nèi)平均每個細(xì)胞分泌1000個噬菌體。次要衣殼蛋白pIIIBRIEFINGSINFUNCTIONALGENOMICSANDPROTEOMICS.VOL1.NO2.189–203.JULY2002406aa組成，5個拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個功能區(qū)組成：N1穿膜區(qū)：作用于細(xì)胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2受體結(jié)合區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合F菌毛。CT疏水區(qū)：組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過程中，增加各個功能域之間的靈活性。InfectionofE.colibyFfbaceriophage主要衣殼蛋白pVIII每個病毒子含約2700個拷貝，約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達(dá)的多肽是低價的，而以pVIII融合子方式表達(dá)的多肽那么是高價的〔每個病毒子~200個拷貝〕。這種高價pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價pIII展示那么將篩選限制在具有較高親和力的配體上。所有Ph.D.文庫都是pIII融合方式〔每個病毒子展示5個拷貝的外源多肽〕。Smithetal.(1997)Chem.Rev.97,391-410phagemidvectors

Typesofphagedisplay systempVIII展示的多肽比較小，如果太大會影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示300aa的多肽。噬菌質(zhì)粒能展示的蛋白已經(jīng)達(dá)到86kDa。噬菌體質(zhì)粒－方便克隆、增強(qiáng)遺傳穩(wěn)定性Phagedisplaywithphagemidvectors噬菌體質(zhì)粒特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因，沒有其他噬菌體基因。有質(zhì)粒復(fù)制起點(322ori)和噬菌體復(fù)制起點(f1ori－用于合成ssDNA)。有包裝序列信號〔packingsignal〕。有供篩選的抗生素標(biāo)記基因。Helperphage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶〔f1oridefect)。包裝后的噬菌體包含有兩種不同來源的成份：噬菌體質(zhì)粒和Helperphage。多價展示？單價展示？Polyvalentormonovalentdisplay?展示價位〔Displayvalency)：噬菌體外表展示的多肽的拷貝數(shù)。展示價位不同所篩選的分子親和力就會不同。用噬菌體質(zhì)粒時，以pIII展示為例：<10%病毒展示為單價，非常少量的展示為兩個拷貝，絕大多數(shù)只展示野生型pIII。Themajordisplayingspeciesismonovalent,butmostparticlesdonotdisplayatall.TruephagePhagemid多價展示單價展示篩選到的分子親和力相對低親和力高極少或無未展示的噬菌體

*大部分是未展示的噬菌體高拷貝數(shù)增加了抗原性可能會影響噬菌體的組裝和增殖易克隆，遺傳穩(wěn)定性好改進(jìn)helperphage?????pJuFo噬菌質(zhì)粒中參加了JunandFosLeuZipper基因兩個基因都以PelB作為signalsequence，以lac作為promoter/operator。NH2-pelB+JunLeuzipper+C-terminaldomainpIII-COOHNH2-pelB+FosLeuzipper+cDNA-product–COOHJun和Fos通過二硫鍵形成異源二聚體theleaderinenzymetechnology展示cDNA文庫SelectionfromcDNAlibraries

Carmerietal.Gene1993theleaderinenzymetechnology淘選Findingtheneedleinthehaystack:Screening

phagedisplaylibraries建立噬菌體展示庫淘選噬菌體展示庫分析克隆theleaderinenzymetechnology

淘選的方法－親和淘選??直接包被法淘選法： ?優(yōu)點：簡單直接。 ?缺點：偶爾會導(dǎo)致配體結(jié)合位點難以進(jìn)入 ?可能是由于分子的立體封阻 ?或者是靶分子外表的局部變性而引起液相法：先將噬菌體庫在液相中與靶分子進(jìn)行預(yù)結(jié)合，然后將噬菌體-靶分子復(fù)合物親和捕獲于親和介質(zhì)上，如：鏈霉親和素包被的外表。theleaderinenzymetechnology噬菌體肽庫與靶分子相互作用洗滌去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的噬菌體將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來三輪淘選后，克隆測序噬菌體肽庫淘選示意圖：親和篩選theleaderinenzymetechnology測定抗FLAGM2單克隆抗體的抗原決定簇對每輪淘選所得到的克隆測序，結(jié)果清晰地顯示核心抗原決定簇是DYKXXD,其中X可以是任意氨基酸。為了確定FLAG抗原決定簇序列DYKDDDDK中哪一個氨基酸是抗體結(jié)合所必需的，將單克隆抗體包被于96孔板，對Ph.D.-7展示文庫進(jìn)行三輪淘選。theleaderinenzymetechnology噬菌體展示系統(tǒng)Phageondisplay???噬菌體展示原理噬菌體展示應(yīng)用商業(yè)化噬菌體展示系統(tǒng)theleaderinenzymetechnology噬菌體展示的應(yīng)用????抗原表位分析制備特異性抗體制備疫苗、多價疫苗構(gòu)建新型的生物催化劑如Renetal(1997)將T4DNA連接酶展示于T4噬菌體，所表達(dá)的融合蛋白能夠高效連接黏性或者平末端。有可能把催化某一代謝途徑的多種酶展示到噬菌體上，制造人工的多酶復(fù)合體?；蛘甙殉砂偕锨€酶分子的活性位點展示到同一個噬菌體顆粒上，制造superenzyme。theleaderinenzymetechnology噬菌體展示的應(yīng)用篩選酶抑制劑是尋找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis從肽庫中篩選到非競爭性地抑制FVIIa活性的肽段。CoagulationCascade.AcurrentsimplifiedviewofthecoagulationcascadeinitiatedbytheTF?FVIIacomplexisshown.theleaderinenzymetechnology

噬菌體展示的應(yīng)用蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用噬菌體cDNA文庫與芯片相結(jié)合(a)合成噬菌體cDNA文庫。(b)生物淘選。(c)鋪板，挑克隆入微孔板，為制備芯片做準(zhǔn)備。GeneralselectionschemeforcDNAexpression-productsdisplayedonphagesurface.Konthuretal2003TARGETSVol.2,No.6261-270.theleaderinenzymetechnology

噬菌體展示的應(yīng)用噬菌體cDNA文庫與芯片結(jié)合(a)淘選后的文庫，制作DNA芯片。(b)確認(rèn)插入片段的種類。(c)生物化學(xué)方法進(jìn)一步確認(rèn)。SchemefortheelucidationofthecomplexityofenrichedcDNAexpression-productphagedisplaylibraries.

Konthuretal2003TARGETSVol.2,No.6261-270.theleaderinenzymetechnology用病人IgE血清對6種不同的cDNA文庫淘選，5輪后，挑出38,000個克隆，鑒別了233種蛋白，其中47種為，186種是新的過敏源。煙曲霉(Aspergillusfumigatus)已成為臨床上僅次于白色念珠菌的一種重要的條件致病真菌。草本枝孢(小麥黑霉病菌)Cladosporiumherbarum雞腿蘑〔Coprinuscomatus〕皮屑牙胞菌(Malasseziafurfur)花生和人肺組織Crameri,R.etal.(2001)Tappingallergenrepertoiresbyadvanced

cloningtechnologies.Int.Arch.AllergyImmunol.124,43–47噬菌體展示的應(yīng)用應(yīng)用舉例theleaderinenzymetechnology噬菌體展示系統(tǒng)Phageondisplay???噬菌體展示原理噬菌體展示應(yīng)用商業(yè)化噬菌體展示系統(tǒng)theleaderinenzymetechnologyCommercialsuppliersofphagedisplayvectorsandlibrariestheleaderinenzymetechnologyPhDTMPhageDisplaySystem用于PhD中的噬菌體是M13KE由M13mp19衍生的溶源性噬菌體。隨機(jī)７肽與次要衣殼蛋白N-端融合，經(jīng)細(xì)胞膜分泌，噬菌斑模糊不透明，用有α-互補的宿主菌在含Xgal/IPTG的平板上可呈藍(lán)斑。融合蛋白表達(dá)時N端有一段信號肽前導(dǎo)序列，蛋白分泌后前導(dǎo)序列被切除，使隨機(jī)七肽直接展示于成熟蛋白的N端。theleaderinenzymetechnology噬菌體展示肽庫E.coliER2738宿主菌-28gIII測序引物〔用于人工測序〕-96gIII測序引物〔用于自動測序〕鏈霉親和素Streptavidin生物素試劑盒組成theleaderinenzymetechnology

文庫克隆載體可以買到嗎？????用來構(gòu)建所有這三種Ph.D.文庫的載體，M13KE〔#E8101S〕，是可以購買到的。M13KE是M13mp19的衍生株，其pIII基因的5’端構(gòu)建了限制性酶切位點，用戶可以將設(shè)計好的人工基因盒〔syntheticcassette〕插入此處構(gòu)建自己的肽庫。因為M13KE是噬菌體，而不是噬菌粒載體，所以在已加工的病毒子上所有5個拷貝的pIII蛋白均攜帶有展示肽序列。另外，大于20-30個氨基酸的展示多肽會影響噬菌體的感染力，所以此載體僅適合展示短的多肽。theleaderinenzymetechnologyM13K07HelperPhage????由M13衍生而來。在M13復(fù)制起始點處，插入有卡那霉素抗性基因。能在無噬菌質(zhì)粒的情況下復(fù)制。當(dāng)有噬菌質(zhì)粒時，由于噬菌質(zhì)粒含有野生型M13或者f1復(fù)制起始點，因此，單鏈?zhǔn)删|(zhì)粒的DNA會被優(yōu)先包裝并分泌。不能用M13KO7作為克隆載體，如果要克隆噬菌體展示庫，建議使用M13KE噬菌體克隆載體。theleaderinenzymetechnology

M13噬菌體與其他噬菌體比 較有什么優(yōu)點？???M13噬菌體為非裂解性噬菌體〔溶源性〕，周質(zhì)內(nèi)組裝，經(jīng)細(xì)胞膜分泌，噬菌斑的形成不是由于菌體裂解而是由于細(xì)胞生長力減弱所致，因此噬菌斑是渾濁的而不是清亮的，用有α-互補的宿主菌在含Xgal/IPTG的平板上可呈藍(lán)斑。由于M13噬菌體在增殖期間不裂解宿主菌。簡化了噬菌體純化步驟，只用簡單的PEG沉淀方法就足以將噬菌體與其他所有污染的細(xì)胞蛋白分開。而其他用于噬菌體展示的噬菌體如：T7,T4和Lambda噬菌體均為裂解性噬菌體，每輪淘選之間都需要花時間進(jìn)行純化，以防止淘選擴(kuò)增的噬菌體污染有細(xì)胞蛋白〔如：有些蛋白酶類物質(zhì)會在淘選時將靶分子降解掉〕。theleaderinenzymetechnologyNEB的噬菌體文庫能展示cDNA文庫嗎？??不適合于cDNA文庫展示，因為這種表達(dá)需要使目的蛋白序列在前導(dǎo)序列〔蛋白分泌所需要的〕和噬菌體包膜蛋白pIII或pVIII的N端序列之間保持讀碼框架一致，這樣產(chǎn)生的M13cDNA文庫中，能有效表達(dá)的克隆會非常少。Novagen的T7Select噬菌體展示系統(tǒng)可以將cDNA插入片段融合在包膜蛋白的C末端，但是該系統(tǒng)利用的是裂解性噬菌體T7而不是溶源性噬菌體M13，淘選擴(kuò)增的噬菌體可能會污染有細(xì)胞蛋白，故需要化更多的時間進(jìn)行噬菌體的純化。貨號產(chǎn)品名稱規(guī)格價格E8100SPh.D.-7噬菌體表面展示試劑盒10次淘選E8110SPh.D.-12噬菌體表面展示試劑盒10次淘選E8120SPh.D.-C7C噬菌體表面展示試劑盒10次淘選E8101SPh.D.多肽展示克隆系統(tǒng)20μgtheleaderinenzymetechnologyNEB提供的三種隨機(jī)肽庫theleaderinenzymetechnologyRecombinantPhageAntibodysystem用于克隆、表達(dá)和檢測小鼠抗體基因噬菌質(zhì)粒-Helperphage系統(tǒng)抗體片段克隆于噬菌質(zhì)粒與pIII蛋白融合展示在M13噬菌體外表Helperphage-M13KO7theleaderinenzymetechnologyT7SelectPhageDisplaySystemfromNovagenNovagen提供：DisplayVectorPre-MadeLibrariestheleaderinenzymetechnologyT7噬菌體結(jié)構(gòu)StructureoftheT7phageparticle(Source:Novagen) 裂解型噬菌體，含有雙鏈DNA(40kb,55gene,3classes)。 Lifecycle30minat30°C 頭部：20面體〔icosahedral)，衣殼蛋白有415拷貝〔capsidprotein,gene10)，分別由60個6聚體和11個5聚體組成。 尾部：連接頭尾的頸圈〔connector)、1個短小的圓錐型尾部和6個尾絲。theleaderinenzymetechnologyGeneticmapofT7衣殼蛋白表達(dá)受以下因素的調(diào)控：

T7RNA聚合酶啟動子φ10(promoter)終止子Tφ〔terminator)翻譯起始因子s10〔translationinitiationsignals)衣殼蛋白有兩種形式：10A(344aa)和10B〔397aa〕T7Select載體：10BtheleaderinenzymetechnologyT7SelectvectorfeaturesT7Select?415-1b:衣殼蛋白基因含有野生型的調(diào)控信號：φ10promoter,Tφterminator,ands10translationinitiationsignals。T7Select10-3b：Thes10translationinitiationsignal(ribosomebindingsite)wasmodifiedtoproducethemid-copyvector。T7Select1-2:φ10ands10wereremovedtofurtherreducecapsidgeneexpression。theleaderinenzymetechnology噬菌體展示系統(tǒng)Phageondisplay???噬菌體展示原理噬菌體展示應(yīng)用商業(yè)化噬菌體展示系統(tǒng)theleaderinenzymetechnology

測序模板的快速純化1.噬菌斑擴(kuò)增，在第一步離心后， 將500μl含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新 鮮離心管。2.加200μlPEG/NaCl，顛倒混勻， 室溫放置10min。3.離心10min，棄上清液。4.短暫離心，小心吸去剩余上清。5.沉淀物徹底重懸于100μl碘化 物緩沖液中，