多聚酶鏈?zhǔn)椒错憯U(kuò)增DNA片段經(jīng)典版

多聚酶鏈?zhǔn)椒错憯U(kuò)增DNA片段經(jīng)典版DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過(guò)案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的血液、頭發(fā)等樣品中提取的DNA，與犯罪嫌疑人的DNA進(jìn)行比較，就由可能為案件的偵破提供證據(jù)。討論：1.犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場(chǎng)的樣品一般都是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足夠量的DNA呢？2.你還能說(shuō)出DNA鑒定技術(shù)在其他方面的應(yīng)用嗎？★分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一★其本質(zhì)是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過(guò)程美國(guó)科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng)

（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一、基礎(chǔ)知識(shí)脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的“－OH”和另一個(gè)核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過(guò)3’，5’-磷酸二酯鍵彼此連接起來(lái)形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5’端3.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端

識(shí)別：-OH端為3′;磷酸基團(tuán)的末端為5′。4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)⑴.DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。⑵.

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。⑶.兩條鏈上的堿基通過(guò)

連結(jié)起來(lái)，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對(duì)，

一定同胞嘧啶配對(duì)。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤（1）DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。4.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（2）

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。（3）兩條鏈上的堿基通過(guò)

連結(jié)起來(lái)，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤（A）一定與

配對(duì)，鳥嘌呤（G）一定同

配對(duì)。兩條反向平行雙螺旋脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）（二）DNA的復(fù)制：1.概念：由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過(guò)程。2.時(shí)期：有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場(chǎng)所：細(xì)胞核（主要）、線粒體、葉綠體4.基本條件：酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈5.復(fù)制特點(diǎn)：a.邊解旋邊復(fù)制b.半保留復(fù)制6.遵循原則：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則7.精確復(fù)制的原因a.規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板b.堿基互補(bǔ)配對(duì)保證了復(fù)制準(zhǔn)確無(wú)誤的進(jìn)行8.復(fù)制的意義:DNA分子通過(guò)復(fù)制將遺傳信息從親代傳給了后代，保持了遺傳信息的連續(xù)性。參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結(jié)：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開(kāi)DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開(kāi)DNA雙鏈模板合成子鏈的原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸

思考：體外擴(kuò)增DNA時(shí)，如何提供與體內(nèi)DNA復(fù)制相似條件？

變性（80～100℃

）TaqDNA聚合酶（耐高溫）20～30個(gè)核苷酸構(gòu)成DNA或RNA二、PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）（一）PCR原理DNA雙鏈變性（加熱80-100℃

）復(fù)性（緩慢冷卻）DNA單鏈變性的目的：解開(kāi)雙鏈復(fù)性的目的：有利于引物1和引物2與兩條單鏈的結(jié)合PCR擴(kuò)增儀PCR擴(kuò)增儀實(shí)際上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，它可以根據(jù)DNA的熱變性原理，通過(guò)自動(dòng)改變溫度，達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)1～3步30輪DNA復(fù)制的方向：DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸變性→復(fù)性（退火）

→

延伸（二）PCR的反應(yīng)過(guò)程：二、PCR的反應(yīng)過(guò)程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制555555模板DNA5555555525～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)（220）倍以上。三、PCR實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL3、微量移液器

用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實(shí)質(zhì)上是能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器4、離心機(jī)一種通過(guò)高速轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開(kāi)的設(shè)備。（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步驟：四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA含量的測(cè)定：稀釋→對(duì)照調(diào)零→測(cè)定→計(jì)算50倍蒸餾水做對(duì)照波長(zhǎng)260nm處讀數(shù)（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評(píng)價(jià)1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1、原理

可以通過(guò)測(cè)量DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)光吸收波長(zhǎng)／nm2602402202800.10.22、過(guò)程①稀釋2μL

PCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋②對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值③測(cè)定并計(jì)算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA

的含量為50g/mL紫外分光光度計(jì)比色杯體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開(kāi)加熱到94oC,雙鏈全部解開(kāi)，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開(kāi)始復(fù)制。復(fù)制的方向子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過(guò)程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴(kuò)增測(cè)定含量稀釋調(diào)零測(cè)定并讀數(shù)計(jì)算練習(xí)鞏固：1.做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是

A.反復(fù)洗滌B.不怕外源DNA污染

C.高壓滅