細胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程

體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)主編電話：；(辦)1整理課件課程安排及進度2整理課件實驗課時間：從第14周開始實驗課地點：104館三樓東邊注意事項：1.網(wǎng)上沒有名字的同學(xué)請不要填報實驗課名單。2.現(xiàn)在不能確定自己時間的同學(xué)不要填報，可以下次上課時再報。3.一旦填報就不能再更改時間。3整理課件體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程三、體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)四、細胞分離與純化五、細胞系（株）、細胞克隆六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法4整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程植塊（explant）：從動物體內(nèi)取出，用于培養(yǎng)的小塊組織一般稱為外植塊或簡稱植塊。分離（散）細胞［isolated（dissociated）cell］：由組織塊分散后制成的單個細胞一般稱之～。細胞懸液（cellsuspension）：單個細胞分散存在于培養(yǎng)液或者其它平衡鹽溶液、緩沖溶液中，就稱之～

。幾個名詞和概念：5整理課件當培養(yǎng)物的總體積不斷擴大，培養(yǎng)過程持續(xù)到一定的時候，原先的培養(yǎng)器皿已不能滿足培養(yǎng)物的空間要求，這時就需要將培養(yǎng)物分成若干小的部分，繼續(xù)培養(yǎng)。因此，按照培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物是否需要被分割后再培養(yǎng)，而將體外培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)或稱初代培養(yǎng)（primaryculture）和繼代培養(yǎng)（secondaryculture)或稱再培養(yǎng)（subculture）兩大類。二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程幾個名詞和概念：6整理課件（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程7整理課件（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程原代培養(yǎng)，通俗地講，就是第一次培養(yǎng)。它是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。原代培養(yǎng)的概念包含以下幾方面含義：①原代培養(yǎng)的實質(zhì)就是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割，任其生長繁殖而不更換培養(yǎng)物的生長器皿；②原代培養(yǎng)中的“代”并不是指細胞的“代”數(shù)，原代培養(yǎng)物中的細胞在接種之后并不一定沒有分裂增殖。相反，在原代培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物中的細胞也可能經(jīng)歷多次的細胞分裂活動而產(chǎn)生多個子代細胞；8整理課件③原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿，像蓋玻片培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法，即便在換液過程中更換培養(yǎng)器皿，但不更換培養(yǎng)組織細胞所附著的生長基質(zhì)蓋片，仍屬于原代培養(yǎng)；④植塊培養(yǎng)不一定都是原代培養(yǎng)，植塊培養(yǎng)有時候在培養(yǎng)物增長到一定程度后，也需要分割培養(yǎng)物為較小的部分再培養(yǎng)。二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）9整理課件１、取材及培養(yǎng)材料的制備２、分離（散）細胞的方法３、接種與培養(yǎng)過程４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）10整理課件（1）準備工作：（2）制備基本步驟（技術(shù)路線）：主要是取材器具、用品的滅菌以及實驗者、實驗動物的清潔與消毒。１、取材及培養(yǎng)材料的制備：二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）11整理課件大塊組織洗去血污剔除多余成分切成約1mm3大小的植塊植塊培養(yǎng)將所取組織剪碎蛋白酶溶液消化機械方法吹打組織塊不銹鋼網(wǎng)篩過濾過濾液離心用培養(yǎng)液懸浮成細胞懸液計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞密度培養(yǎng)分離的細胞二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2）基本步驟（技術(shù)路線）：（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）12整理課件１、取材及培養(yǎng)材料的制備：二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程關(guān)于取材：（1)取材要準確：取材是體外培養(yǎng)工作的開端。如果在這最初的實驗過程中沒有取到合格、理想的實驗材料，整個體外培養(yǎng)過程就很難達到預(yù)期的目的。(2)關(guān)于取材及制備培養(yǎng)材料的步驟：就動物不同組織的取材而言，取材的步驟大同小異。但在具體操作過程中，還需要根據(jù)具體的實驗情況做一些調(diào)整。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）13整理課件１、取材及培養(yǎng)材料的制備２、分離（散）細胞的方法３、接種與培養(yǎng)過程４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）14整理課件（1）機械解離細胞法：

1）吸管吹打法--2）過篩法--（2）酶學(xué)解離細胞法：

1）胰蛋白酶離解細胞法--2）膠原酶離解細胞法--（3）螯合劑解離細胞法：

常用螯合劑：乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na）、檸檬酸鈉、枸櫞酸鈉。二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程２、分離（散）細胞的方法：（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）15整理課件１、取材及培養(yǎng)材料的制備２、分離（散）細胞的方法３、接種與培養(yǎng)過程４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）16整理課件３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程接種（seeding）也稱種植(plating)或體外移植(explantation),實際上就是將取材并切割好的組織塊（植塊）或者分離好的細胞懸液加到培養(yǎng)器皿內(nèi)的過程。如果將準備好的植塊（包括器官型植塊）接種并進行培養(yǎng)，就稱為植塊培養(yǎng)。體外移植的稱謂較多用于植塊培養(yǎng)的情況。如果將所制備的細胞懸液用于種植和培養(yǎng)，就稱為分離（散）細胞培養(yǎng)。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）17整理課件３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程分離（散）細胞培養(yǎng)的細胞如果屬于貼壁依賴型細胞，在培養(yǎng)瓶皿中必須黏附于一定的生長基質(zhì)表面才能生長，這樣的細胞一般只能在培養(yǎng)瓶皿表面長滿一層，當培養(yǎng)物長滿培養(yǎng)器皿的表面時即會因為接觸抑制而停止生長，這種培養(yǎng)方式就稱為單層細胞培養(yǎng)（single-layercellculture)。如果所培養(yǎng)的細胞沒有貼壁依賴性，在懸浮狀態(tài)下即可以生長和繁殖，這樣的培養(yǎng)方式就稱為懸?。毎┡囵B(yǎng)（suspensionculture）。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）18整理課件３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1）植塊培養(yǎng)：植塊培養(yǎng)是比較簡單的培養(yǎng)方法，其技術(shù)要點就是將從動物體內(nèi)所取得的組織切割成一定大小的植塊，再將植塊接種到培養(yǎng)瓶皿內(nèi)，加入培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)瓶皿送入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。植塊培養(yǎng)的目的主要有兩個，其一是觀察植塊的組織學(xué)生長行為，其二是通過植塊培養(yǎng)，讓構(gòu)成植塊的細胞從植塊內(nèi)遷移出來并在植塊外分裂增殖，然后將植塊去除，從而得到細胞培養(yǎng)物。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）19整理課件３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2）分離（散）細胞培養(yǎng)：相對于植塊培養(yǎng)法，分離（散）細胞培養(yǎng)的最大優(yōu)點是：解除了植塊內(nèi)細胞之間的“組織關(guān)系”，從而可以反映出單個細胞的生物學(xué)特征。借助分離（散）細胞培養(yǎng)法，還可以分離(isolate)或純化某一類型的細胞，從而實現(xiàn)對單一細胞類型（monotypiccellculture）進行細胞生物學(xué)研究。動物組織的大多數(shù)細胞類型都屬于貼壁（錨定）依賴型細胞（anchorage-dependentcell)。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）20整理課件３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（3）生長基質(zhì)：生長基質(zhì)（growthsubstratum）泛指培養(yǎng)物附著的各種介質(zhì)，狹義特指在塑料或玻璃培養(yǎng)器皿表面上涂布（包被）的一層能夠促進培養(yǎng)物黏附、貼壁與鋪展的生物活性物質(zhì)。一般來說，國際上一些著名廠商生產(chǎn)的塑料或玻璃培養(yǎng)器皿，其使用的材質(zhì)能夠適宜大多數(shù)種類的動物細胞體外生長。只有少數(shù)黏附和貼壁能力較差的細胞，需給予提供包被有特殊生長基質(zhì)物質(zhì)的生長表面。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）21整理課件３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（4）懸浮細胞培養(yǎng)（suspensioncellculture）對于有些細胞來說，其生長不需要黏附在某一固相表面便能分裂增殖。例如，某些白血病細胞、某些腹水瘤細胞等。體外培養(yǎng)這種細胞時，可以通過對培養(yǎng)液以及其中的細胞進行不斷攪拌，或?qū)ε囵B(yǎng)器皿進行振蕩、快速旋轉(zhuǎn)而維持細胞的懸浮狀態(tài)。也有一些細胞無須攪拌或用搖床搖動，只要在培養(yǎng)器皿表面涂布一層不利于細胞粘附的硅脂即可維持懸浮狀態(tài)。這種培養(yǎng)方法就稱為懸浮細胞培養(yǎng)。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）22整理課件１、取材及培養(yǎng)材料的制備２、分離（散）細胞的方法３、接種與培養(yǎng)過程４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）23整理課件４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程隨著培養(yǎng)的進程，營養(yǎng)物被消耗，細胞的代謝產(chǎn)物愈來愈多，尤其是細胞呼吸反應(yīng)，釋放出的CO2及其它酸性代謝產(chǎn)物（如乳酸和丙酮酸）越來越多，培養(yǎng)液的pH值越來越低，培養(yǎng)液的顏色越來越黃。根據(jù)培養(yǎng)液的顏色變化確定換液的間隔時間是很有實際意義的。營養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢還取決于所接種的細胞數(shù)量。隨著培養(yǎng)過程的繼續(xù)，細胞會分裂增生，數(shù)量增加，換液的時間間隔就可能越來越短。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）24整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5、原代細胞培養(yǎng)方法的注意事項（1）關(guān)于培養(yǎng)液：1)培養(yǎng)基的選擇：培養(yǎng)某一種細胞，到底選用哪一種培養(yǎng)基，需要根據(jù)細胞的生長情況摸索確定。2）添加物：選擇好培養(yǎng)基類型以后，還要摸索需要補加的成分及其添加量。3)培養(yǎng)液的酸堿度：普通動物細胞一般適宜的pH范圍為7.2－7.4當pH值低于6.8時，會對細胞的生長產(chǎn)生抑制作用。4)換液：換液時，如果細胞密度很低或者細胞的生長較為緩慢，可以不完全更換培養(yǎng)液，只吸出一半的舊培養(yǎng)液，補加相同體積的新培養(yǎng)液即可。培養(yǎng)液最好經(jīng)事先預(yù)溫至370C。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）25整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5、原代細胞培養(yǎng)方法的注意事項（2）關(guān)于培養(yǎng)空間：培養(yǎng)空間是指培養(yǎng)物生存的空間，包括液相環(huán)境與氣相環(huán)境兩方面。調(diào)整培養(yǎng)空間的主要目的是改變對培養(yǎng)物的供氧量。一般來說，培養(yǎng)液與液面上的空間二者之間的體積比例以1：10為宜。加入的培養(yǎng)液液面高度最好維持在2～5mm的范圍。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）26整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5、原代細胞培養(yǎng)方法的注意事項（3）其它方面：必須根據(jù)不同細胞生命力的不同以及對環(huán)境轉(zhuǎn)變適應(yīng)能力的不同，選擇適宜的取材、分散、種植方法和選用適當?shù)呐囵B(yǎng)條件。除了所培養(yǎng)細胞自身的活力外，原代培養(yǎng)不成功最大的可能性有兩點：其一是在對組織分散并分離細胞的過程中嚴重損傷了細胞，其二是給細胞提供的體外生長環(huán)境，尤其是生長基質(zhì)與培養(yǎng)液條件不合適。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）27整理課件（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程28整理課件（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)，再進行培養(yǎng)，這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。傳代培養(yǎng)的實質(zhì)就是分割后再次培養(yǎng)。只要是將培養(yǎng)物從一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移到另一個器皿之內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)就算傳代。即便是按“一傳一”的比例進行傳代。29整理課件1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標2、傳代的過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）30整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1）植塊培養(yǎng)物與器官培養(yǎng)物：植塊培養(yǎng)物生長一定時間之后，從植塊內(nèi)長出（outgrowing）的細胞會越來越多，遷移出來的細胞也會不斷分裂繁殖，逐漸長滿所附著的生長基質(zhì)表面，細胞之間逐漸發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象。若不將原代培養(yǎng)物分割再進行培養(yǎng)，植塊培養(yǎng)物可能會停止生長。1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）31整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2）分離（散）細胞培養(yǎng)物：對于貼壁依賴型細胞來講，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞分裂增殖，數(shù)量愈來愈大，逐漸會在培養(yǎng)瓶皿的底壁形成一完整的細胞層，細胞之間因接觸性抑制作用而停止生長，此時便需要進行傳代。判斷分離（散）細胞培養(yǎng)物是否需要傳代的主要指標就是觀察培養(yǎng)物是否已基本長滿培養(yǎng)瓶皿的底壁。1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）32整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（3）懸浮培養(yǎng)物：懸浮培養(yǎng)細胞之間雖然不容易發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象，但隨著培養(yǎng)液中細胞數(shù)量的增加，細胞的生存空間會越來越小，營養(yǎng)供應(yīng)愈趨緊張，代謝產(chǎn)物積聚，培養(yǎng)環(huán)境逐漸不適應(yīng)細胞的生長，因而需要傳代。1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）33整理課件1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標2、傳代的過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）34整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程2、傳代的過程（1）分離（散）細胞培養(yǎng)物：（貼壁依賴型細胞）1）棄去原培養(yǎng)液（吸出或傾倒）；2）漂洗：1~2次，3）離解細胞：4）終止消化：5）吹打分離細胞：6）離心：7）重新懸浮、計數(shù)：8）分裝：9）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）35整理課件（2）懸浮培養(yǎng)物：無需分割培養(yǎng)物。1）離心：2）重新懸浮、計數(shù)：3）分裝：4）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程2、傳代的過程（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）36整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程2、傳代的過程（3）植塊培養(yǎng)物：對這種培養(yǎng)物，僅在少數(shù)情況下再培養(yǎng)。由于它們一般是種植在生長基質(zhì)蓋玻片上，再培養(yǎng)時一般不更換生長基質(zhì)蓋玻片，只是將培養(yǎng)物分割并舍棄部分培養(yǎng)物，而將剩余的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）37整理課件1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標2、傳代的過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）38整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項傳代培養(yǎng)首先必須注意的事項：根據(jù)不同細胞的承受能力；選擇合適的時間；采用適當?shù)姆椒?。（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）39整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項（1）傳代的時機與再培養(yǎng)的細胞密度：不要急于傳代是對大多數(shù)生命力較為脆弱的細胞體外培養(yǎng)的上策。除非需要利用傳代實現(xiàn)其它的目的，如通過傳代對培養(yǎng)物中的混合細胞進行分離。由于在體時細胞之間的相互作用有利于細胞的生存和生命活動，因而在進行體外分離細胞培養(yǎng)時盡量給細胞提供相互作用的條件。一個重要的方法就是增大接種的細胞密度，使培養(yǎng)的細胞盡快發(fā)生相互作用。（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）40整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項（2）傳代數(shù)或代數(shù)與培養(yǎng)物的生長：傳代數(shù)或代數(shù)（passagenumber）是指對培養(yǎng)物傳代的次數(shù)。用它可以相對地衡量某一培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡（cultureage）。經(jīng)過一次傳代，細胞的生長環(huán)境就發(fā)生一次大的變化。體外生長的細胞若處于“動蕩”的生活環(huán)境中，其生物學(xué)性狀往往容易發(fā)生改變，尤其是細胞的遺傳特性可能會發(fā)生改變。應(yīng)該認識到，傳代對細胞生長和性狀是有影響的，在必要性不強的情況下，少傳代為上。（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）41整理課件（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程42整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)這里要介紹的是，體外培養(yǎng)這門技術(shù)從創(chuàng)立以來所發(fā)展起來的、若干種被普遍運用的、具有代表性的基本方法和技術(shù)。這些基本的方法和技術(shù)有的還在使用，有的則已不常使用，代之以一些改良的方法和技術(shù)。43整理課件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)1、懸滴培養(yǎng)法2、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法3、蓋玻片培養(yǎng)法4、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法5、灌注小室培養(yǎng)法6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法7、二倍體細胞培養(yǎng)法8、克隆培養(yǎng)法9、中空纖維細胞培養(yǎng)技術(shù)10、微載體細胞培養(yǎng)法11、微囊培養(yǎng)技術(shù)44整理課件2、培養(yǎng)瓶（cultureflask）培養(yǎng)法凡是可以用于培養(yǎng)生物結(jié)構(gòu)成分的瓶子都可以叫做培養(yǎng)瓶。早期的培養(yǎng)瓶主要是玻璃培養(yǎng)瓶，如今國外主要用一次性使用的塑料培養(yǎng)瓶?？ㄊ掀浚╟arlsberg'sflask）

北京瓶塑料培養(yǎng)瓶所謂培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法，就是將擬培養(yǎng)對象直接接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)的方法。這種培養(yǎng)法只是強調(diào)所用的培養(yǎng)器皿是培養(yǎng)瓶而已。45整理課件卡氏瓶北京瓶經(jīng)典的培養(yǎng)瓶46整理課件6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法過去曾被稱為微量培養(yǎng)法（microculture）：是現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)中最為普遍應(yīng)用的常規(guī)培養(yǎng)方法之一。它是將所培養(yǎng)的細胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法。培養(yǎng)板的應(yīng)用使得細胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范化、標準化，使得細胞培養(yǎng)可以微量培養(yǎng)的方式進行，使得科研工作者能夠?qū)ε囵B(yǎng)物進行規(guī)范的、定量的組間比較。培養(yǎng)板一般都是一次性使用的培養(yǎng)器皿，有極為規(guī)范的商品供應(yīng)。47整理課件8、克隆培養(yǎng)法（cloningculturetechnique）克隆（clone）一詞既有名詞意義又有動詞含義。作名詞講時，意指由同一個祖細胞分裂增生而來的一個子細胞群，體外培養(yǎng)技術(shù)中常用的細胞克?。╟ellclone或colony）即為此意。作動詞解時，克隆一詞主要指從同一個祖細胞經(jīng)分裂增殖而產(chǎn)生一個子細胞群的過程，體外培養(yǎng)技術(shù)中的細胞克?。╟ellcloning）就是這個意思?？寺∨囵B(yǎng)法也可以稱作單細胞分離培養(yǎng)法（singlecellculture），就是將從細胞懸液中獲得的單個細胞用于培養(yǎng)，使之分裂增殖而產(chǎn)生一個細胞群的培養(yǎng)方法。48整理課件克隆培養(yǎng)法最基本的要求是擬用于培養(yǎng)并分裂增殖的祖細胞必須是一個細胞，如此才能獲得具有同一祖先的子細胞群。

理論上講，各種生物體細胞都可以進行克隆培養(yǎng)，但由于細胞在體外培養(yǎng)時生長繁殖的環(huán)境、生命力等方面均不如在體時的情況。所以，能夠進行克隆培養(yǎng)的細胞一般只是一些細胞活力強、增殖能力強、對體外生長環(huán)境適應(yīng)性強的細胞，如腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化（無限）細胞系、（胚胎）干細胞以及微生物細胞等。這些細胞種類即便是單個細胞被置于體外培養(yǎng)環(huán)境，也可以逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并行分裂增殖，從而形成一群子細胞。8、克隆培養(yǎng)法（cloningculturetechnique）49整理課件實驗課時間：從第14周開始實驗課地點：104館三樓東邊注意事項：1.網(wǎng)上沒有名字的同學(xué)請不要填報實驗課名單。2.現(xiàn)在不能確定自己時間的同學(xué)不要填報，可以下次上課時再報。3.一旦填報就不能再更改時間。50整理課件（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程51整理課件（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程在體外培養(yǎng)工作中，為了保種和長期保存培養(yǎng)物的活性，常須將培養(yǎng)物進行冷凍保存，并在需要的時候重新復(fù)蘇和培養(yǎng)。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存（cryopreservation）：就是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。復(fù)蘇（thawing）：就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程。52整理課件細胞內(nèi)的冰晶損傷（intracellularice-damage）：是指因細胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細胞損傷。

純水（細胞懸浮其中）

低于零度

結(jié)冰

細胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰

冰晶造成細胞膜和細胞器的破壞并引起細胞死亡

１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理53整理課件溶質(zhì)損傷（solutedamage）或稱溶液損傷（solutiondamage）是指因保存細胞的溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細胞損傷。溶液（細胞懸浮其中）溫度下降細胞外的水分先結(jié)冰在復(fù)溫時，大量水分就會滲入細胞內(nèi)，造成細胞死亡未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高細胞在高溶質(zhì)的溶液中時間過長，細胞膜上脂質(zhì)會受到損壞，細胞便會發(fā)生滲漏。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理54整理課件在溶液中加入冷凍保護劑(cryoprotectant)時，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度，降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)的損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，1～2min內(nèi)恢復(fù)到常溫，細胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度溶質(zhì)的溶液中過長時間，從而不會產(chǎn)生冰晶損傷和溶質(zhì)損傷，凍存的細胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理55整理課件（１）冷凍速率細胞在冷凍過程中會發(fā)生如下生理變化：*當細胞被冷至-5℃左右時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低了溶液的冰點，細胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；*當細胞被冷至-5℃～-15℃之間時，細胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能，其結(jié)果是：細胞內(nèi)水分為了和細胞外水分保持化學(xué)能的平衡，會向細胞外流動。是指降溫的速度。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理56整理課件冷凍速度不同，細胞內(nèi)水分向細胞外流動的情況就會不同：（1）冷凍速度慢，細胞內(nèi)水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰；（2）冷凍速度快，細胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細胞內(nèi)結(jié)冰；（3）冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯?，則細胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃化冷凍）。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（１）冷凍速率57整理課件超快速玻璃化冷凍：是細胞存活最理想的冷凍方法。因為細胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜和細胞器不造成破壞；細胞也不會在高濃度溶質(zhì)的溶液中暴露時間過長而受損。不同細胞的最適冷凍速率不同。所以，在對一種細胞進行冷凍保存之前，首先要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高冷凍存活率。

１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（１）冷凍速率58整理課件（２）冷凍保存溫度是指能長久保存細胞的超低溫度。在超低溫度下，細胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，經(jīng)過長期保存在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。液氮溫度（-196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。在-196℃時，細胞生命活動幾乎停止，但復(fù)蘇后細胞結(jié)構(gòu)和功能保持完好。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在-196℃均可保存十年以上。應(yīng)用-70℃～-80℃條件冷凍保存細胞，短期內(nèi)對細胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯下降。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理59整理課件（３）復(fù)溫速率是指在細胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當也會降低凍存細胞存活率。一般來說復(fù)溫速度越快越好。復(fù)溫速度過慢，細胞內(nèi)會重新形成較大冰晶而造成細胞損傷。最佳的復(fù)溫速率與最佳的冷凍速率對保證獲得最佳的凍存效果同等重要。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理60整理課件（４）冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類：滲透性冷凍保護劑：可以滲透到細胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)。主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酞胺、甲醇等。非滲透性冷凍保護劑：不能滲透到細胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羥乙基淀粉等。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理61整理課件滲透性冷凍保護劑保護細胞的機制是：（1）在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；（2）細胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能防止細胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等充分滲到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外達到平衡以起到充分的保護作用。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（４）冷凍保護劑62整理課件非滲透性冷凍保護劑的保護機制：(假設(shè)有多種)其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子相結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（４）冷凍保護劑63整理課件不同的冷凍保護劑有不同的優(yōu)、缺點。目前，有一種趨勢，就是聯(lián)合使用二種以上冷凍保護劑組成保護液。由于許多冷凍保護劑（如nMSO）在低溫條件下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復(fù)溫融解后要及時洗除冷凍保護劑。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（４）冷凍保護劑64整理課件２、冷凍保存的方法按照冷凍保護液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化凍存和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存：利角各種溫級的冰箱分階段降溫至-70～-80℃，然后直接投入液氮進行保存；或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-100℃以下，再直接投入液氮進行保存的方法。以此種方法凍結(jié)的細胞懸液或多或少有冰晶形成。玻璃化冷凍：則是指利用多種高濃度冷凍保護劑組合成的玻璃化冷凍保護液懸浮細胞，直接投入液氮進行保存的方法。以此種方法凍結(jié)的細胞懸液無冰晶形成。65整理課件３、凍存細胞的復(fù)蘇（略）（１）非玻璃化凍存細胞的復(fù)蘇方法（２）玻璃化凍存細胞的復(fù)蘇方法（略）66整理課件（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程67整理課件（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程與培養(yǎng)無關(guān)的雜質(zhì)混入培養(yǎng)系統(tǒng)稱為污染（contamination）。廣義的污染包括各類微生物的污染、各種培養(yǎng)物間的交叉污染和化學(xué)物質(zhì)的污染。后兩種污染比較容易預(yù)防，而微生物污染的預(yù)防及處理就比較困難，它能直接影響后續(xù)研究工作。通常論及的培養(yǎng)物污染多指各類微生物（包括細菌、真菌、支原體、病毒等）對培養(yǎng)細胞的污染。68整理課件（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程判斷所培養(yǎng)細胞是否被微生物污染，可以通過以下方法進行確定：目測顯微鏡觀察電鏡檢查特殊染色鑒定微生物培養(yǎng)試驗免疫學(xué)分子生物學(xué)等其中，免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法因其快速、敏感和特異性強等優(yōu)點已得到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。１、微生物污染的判斷：69整理課件（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（１）細菌（bacterial）的污染及其判斷在細菌污染培養(yǎng)細胞的初期，由于受培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的抗生素的作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細胞生長不受明顯影響，這種情況用倒置相差顯微鏡觀察也不易判斷。*將10ml左右的細胞懸液以1000r/min離心5min，再用無菌的PBS洗滌2次，加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml后，將細胞置于370C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如果培養(yǎng)物真的受到細菌的污染，就可以在24h內(nèi)因細菌的大量繁殖而獲得陽性結(jié)果。70整理課件71整理課件（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：*當污染的菌量比較大或者細菌增殖到一定基數(shù)時，大約每20min一代的細菌增殖速度，會使培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)很快產(chǎn)生大量細菌，后者不僅會消耗培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)大量的養(yǎng)分，也能釋放出大量的代謝產(chǎn)物。幾小時之后，增殖的細菌即可導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀混濁。酸性代謝產(chǎn)物的累積可使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黃綠色。（１）細菌（bacterial）的污染及其判斷72整理課件（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（２）真菌（eumycete）的污染及其判斷單細胞真菌稱為酵母菌（yeastfungus）；多細胞真菌能長出菌絲及孢子并交織成團，稱絲狀菌（hyphomycete），又稱霉菌（mycetes）。污染了酵母菌的培養(yǎng)物，類似細菌污染。在倒置相差顯微鏡下可以觀察到圓形或卵圓形的酵母菌，開啟培養(yǎng)器皿，可聞到像酒或酸的發(fā)酵樣異味。隨著培養(yǎng)液酸度下降，培養(yǎng)液外觀呈現(xiàn)黃綠色。73整理課件（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（２）真菌的污染及其判斷污染了霉菌的培養(yǎng)物，在倒置相差顯微鏡下能觀察到呈絲狀或樹枝狀生長的菌絲。這些菌絲在培養(yǎng)液中可以長成白色的絲狀團塊，如棉絮狀漂浮在培養(yǎng)液中，有的附著在培養(yǎng)器皿或培養(yǎng)物的表面。74整理課件75整理課件76整理課件（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（３）支原體（mycoplasma）的污染及其判斷受支原體污染的培養(yǎng)細胞在顯微鏡下無特殊的外觀表現(xiàn)，培養(yǎng)液也不渾濁。由于對支原體污染難以觀察到特殊的外觀變化，要在污染的早期發(fā)現(xiàn)和處理是相當困難的。77整理課件(細胞碎片)（支原體）78整理課件（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：在細胞培養(yǎng)過程中，如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細胞較多，培養(yǎng)細胞需要頻繁改善營養(yǎng)環(huán)境才能支持長期傳代培養(yǎng)時，應(yīng)懷疑培養(yǎng)物可能受支原體污染。必要時應(yīng)借助有關(guān)檢測技術(shù)對培養(yǎng)物進行特殊檢測，如DNA熒光染色法、聚合酶鏈反應(yīng)方法、免疫學(xué)方法以及支原體培養(yǎng)法。（３）支原體（mycoplasma）的污染及其判斷79整理課件（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（４）病毒（virus）的污染及其判斷細胞培養(yǎng)中的病毒污染來源可以是原宿主體細胞的潛伏性感染，也可以是細胞膜受體或其它理化方法誘導(dǎo)后進入的。判斷培養(yǎng)的細胞是否被病毒污染，其困難之處在于病毒種類的復(fù)雜性和相應(yīng)的宿主細胞的特異性。80整理課件感染了病毒的宿主細胞形態(tài)學(xué)上不一定有顯著的特異性的改變，因此僅依據(jù)用目測或顯微鏡觀察到的細胞形態(tài)學(xué)變化來判斷是否受病毒的污染是不充分的。應(yīng)根據(jù)不同的病毒選用不同的方法，才足以判斷培養(yǎng)的細胞是否存在某種病毒的污染。（五）培養(yǎng)物的污染二、