生物素-過氧化物酶講課教案

生物素-過氧化物酶第一節(jié)生物素－親和素免疫細胞化學技術一、基本原理（一）生物素（Biotin）與親和素/卵白素/抗生物素（Avidin/anti-Biotin）之間有很強的親和力；（二）生物素和親和素具有與其它示蹤物質如熒光素和過氧化物酶等相結合的能力。二、幾種經典的抗生物素－生物素染色法（一）ABC（AvidinBiotin-peroxidaseComplex

）技術（二）LAB（LabelledAvidin-Biotin）技術（三）LSAB（labeledstreptavidinbiotinmethod）：

S-P（streptavidin－peroxidase）技術

SABC（streptavidin-biotincomplex）技術（四）BRAB（BridgedAvidin-Biotin

）技術（五）CSA（Catalyzedsignalamplification）法

（六）Envision技術（一）親和素-生物素-過氧化物酶（AvidinBiotin-peroxidaseComplex，ABC）技術

1．基本原理2、操作步驟（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，冰凍切片經冷丙酮固定，用PBS洗；（2）用3%H2O2甲醇液室溫作用20min后，充分水洗；（3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗動物種屬正常血清15min；（4）加第一抗體（即用型或濃縮型）4℃過夜或37℃1h；（5）PBS洗，加生物素化第二抗體37℃30min；（6）PBS洗，加ABC復合物（1∶100,使用前30min將等量的親和素和酶標生物素混合，稀釋配制成ABC復合物),37℃20min；（7）PBS洗，經DAB/H2O2顯色；（8）常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。3、ABC法的優(yōu)點（1）敏感性高:結合力強,分子量小;（2）特異性強，背景染色淡；（3）方法簡便，節(jié)約時間；（4）由于生物素與抗生物素具有與多種標記物結合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。（二）標記生物素-抗生物素技術（LabelledAvidin-BiotinTechnique,LAB技術）

1、基本原理以生物素標記抗體作第一抗體，酶標記抗生物素作為第二抗體，同S-P技術

LAB法示意圖2、操作步驟（1）①-④步驟與ABC法相同；（5）PBS洗后加生物素標記第一抗體37℃30min；（6）PBS洗后加酶標親和素（如HRP-Avidin）37℃30min：（7）以下步驟同ABC法。

（三）LSAB（labeledstreptavidinbiotin）技術：S-P（streptavidin－peroxidase）技術

SABC（streptavidin-biotincomplex）技術

1、基本原理2、操作步驟（1）常規(guī)切片脫蠟至水；（2）必要時抗原修復：如高溫高壓修復；（3）3%H2Ｏ2甲醇液阻斷內源性過氧化物酶15min；（4）水洗，PBS洗，10%牛血清白蛋白20min；（5）加一抗4℃過夜或37℃孵育1h；（6）PBS洗，滴加生物素化的二抗37℃30min；（7）PBS洗，滴加HRP標記鏈霉親和素（S-P復合物）或鏈霉親和素－生物素（SABC），37℃孵育20min；（8）DAB/H2Ｏ2顯色，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封固。（四）BRAB（BridgedAvidin-Biotin

）技術1、原理以生物素標記抗體作第一抗體，抗生物素作為第二抗體，橋接酶標生物素。

2、操作步驟（1）①-③步驟與ABC法操作相同；（2）加一抗4℃過夜或37℃1h；（3）PBS洗后加生物素標記的第二抗體37℃30min；（4）PBS洗后加親和素37℃孵育30min；（5）PBS洗后加HRP酶標記生物素37℃30min；（6）PBS洗后用DAB/H2Ｏ2顯色；（7）常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封固。（五）CSA（Catalyzedsignalamplification）法

1、原理根據兩次生物素-Streptavidin-HRP反應，聚合示蹤物質（HRP催化底物生物素化酪胺成不溶性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信號得到幾何級放大，敏感性更高，尤其適合原始信號較弱的信號檢測，但操作較復雜。第一步第二步第三步第四步第五步2、操作步驟（1）常規(guī)脫蠟至水，必要時用抗原修復處理；（2）3%H2Ｏ2甲醇液15min；（3）正常封閉血清，室溫20min，甩干；（4）滴加特異性一抗4℃過夜或37℃孵育1h；（5）PBS洗后，滴加生物素化二抗37℃30min；（6）PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育20min；（7）PBS洗，滴加生物素化酪胺基團分子，37℃孵育20min；（8）PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育20min；（9）PBS洗后，DAB/H2Ｏ2顯色；（10）蘇木素襯染細胞核，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。（六）Envision技術１、原理用高分子的葡聚糖作為載體，將大量的二抗分子和HRP結合成多聚體，具有很強的信號放大功能，對膜和漿表達的抗體特別敏感。敏感，簡便。2、操作步驟（1）組織切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗；（2）用3%H2Ｏ2甲醇液阻斷15min，水洗，PBS洗；（3）抗原修復處理，PBS洗；（4）正常山羊血清封閉15min；（5）滴加第一抗體，37℃孵育1h；（6）PBS洗（一定要充分），滴加HRP-聚合物-抗體復合物37℃，60min；（7）PBS洗（一定要充分），DAB顯色；（8）蘇木素襯染，脫水、透明、封固。附免疫多染技術原理用不同來源的抗體和不同的染色同時檢測同一標本中的多種抗原標記物。第二節(jié)葡萄球菌A蛋白（SPA）的應用葡萄球菌A蛋白（staphylococalproteinA，SPA）一、特性：

1、多肽單鏈蛋白，對熱和變性劑十分穩(wěn)定；2、能與某些哺乳動物IgG的Fc段特異性結合；3、可以被各種標記物所結合，形成SPA標記物。二、應用

SPA主要在免疫組織化學中替代連接抗體（橋抗體），可不受動物種屬限制。三、常見問題及處理

主要是無信號、信號弱、雜信號等三種。當免疫組化染色沒有出現預期結果時，應系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。一定設對照，主要是陰性對照和陽性對照。（一）無信號染色結果陽性對照/標本均無染色，出現無信號染色現象有兩種原因：

1、真陰性結果：組織或細胞不表達抗原，無法檢測到相關信號；或表達抗原太低，所使用檢測系統(tǒng)不足以達到檢測所需要的靈敏度。

2、假陰性結果：原因有兩種：

（1）染色前錯誤：切片時選錯蠟塊和選錯切片，這種情況可用H&E染色驗證。

（2）染色中錯誤：

①確認是否忽略了應該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等；

②確認所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間；

③對照抗體的標簽確認是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點是非常重要的；④檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，要求在4~8℃條件下保存，應避免反復凍融，一定要避免與揮發(fā)性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價；⑤檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液是否合適；⑥確定標本的處理及儲存條件；⑦檢查色原/底物溶液，底物在制成工作液后應在一定時間內用完，否則會失效；

⑧檢查沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉；⑨檢查復染劑、脫水、透明和封片劑是否和所使用的色原匹配如：HRP用中性樹膠，熒光素用水溶性封片劑，AEC等不能用二甲苯有機溶劑透明。

（二）信號弱如果陰性對照沒有染色而陽性對照標本弱陽性，除了上述因素外，還有：

1.標本的固定方式，不當的固定方式或固定時溫度過高；2.抗原修復方式不當；3.抗原位于細胞內，未使用穿孔劑如0.05%TritonX-100或EDTA，有助于抗體滲透入細胞內，也可降解內源性Fc受體；4.抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確；5.切片上遺留了過多的沖洗液，；6.孵育時切片是否放置水平，否則會導致抗體流失。三、雜信號由于切片、內源性IgG、Fc受體、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素的存在等原因，同時組織在處理過程中如高溫修復也會使更多的內源性生物素暴露，造成染色組織上會出現非抗原部位的非特異性染色、邊緣效應等雜信號。原因分析如下：（一）全片著色

1.是否有效地去除了內源性酶和生物素；2.封閉液的使用：是否選擇使用了正確的封閉血清；3.所選擇的抗體是否符合試驗要求，主要是抗體純度；4.一抗的使用濃度是否過高；5.清洗是否充分，DBA的使用是否正確，邊緣效應；6.檢查二抗與標本的內源性組織蛋白是否有交叉反應；7.組織抗原彌散等。（二）部分著色1.灶片裝著色：切片撈片時應一步到位，避免產生氣泡，組織局部鼓起。

2.陰陽著色：測試片未放平，滴加試劑偏向一側。

（三）著色部位改變

1.間質著色：原因很多：抗體與組織中的蛋白質因疏水基團相互作用形成非特異性的連接造成，血清封閉可避免此中影響因素；靶抗原外溢到組織間隙；抗體不純或被污染；2.細胞漿著色：內源性物質殘留如酶、生物素或產生非特異性吸附的蛋白；3.細胞核著色：不適當的組織處理可以出現細胞核著色，如組織在二甲苯、緩沖液中浸泡時間過長、組織變干、修復液pH值和修復時間不當、組織沒有浸沒在修復液中等。四、石蠟切片免疫組化染色步驟

1、載玻片的處理：

抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用防脫片試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：

1.1APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。1.2HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。1.3Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。2、常用酶消化：2.1胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鐘，主要用于細胞內抗原的顯示。2.2胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鐘，主要用于細胞間質抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），CollagenIV（IV型膠原）等。2.3皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10mg/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。

3、抗原熱修復：

可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。其pH值在6.00.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整，常用方法如下：3.1石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：

切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。3.2石蠟切片高壓抗原修復操作方法：

切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鐘后），計時1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

3.3石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：

切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。五、冰凍切片免疫組化染色步驟冰凍切片4~8m，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2。下接免疫組化染色操作步驟。六、細胞貼片免疫組化染色步驟

PBS洗去貼片殘余物，入1:1的4℃丙酮:無水乙醇混合固定液固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過氧化