食品專業(yè)學生作業(yè)通用乳酸鏈球菌素研究PPT教學講座

天然食品防腐劑--乳酸鏈球菌素NaturalFoodPreservative--NisinLactate目錄01乳酸鏈球菌素的研究現(xiàn)狀02乳酸鏈球菌素的生產研究進展03乳酸鏈球菌素的應用04乳酸鏈球菌素前景展望乳酸鏈球菌素的研究現(xiàn)狀乳酸鏈球菌素的分子結構乳酸鏈球菌素（Nisin）亦稱乳酸鏈球菌肽或音譯為尼辛，是目前最常用的生物防腐劑，它是乳酸鏈球菌產生的一種多肽物質，由34個氨基酸殘基組成。分子式為C143H228N42037S7，分子量為3510。Nisin分子結構中包含5種稀有氨基酸，分別為氨基丁酸?(ABA)、脫氫丙氫酸(DHA),R一甲基脫氫丙氨酸(DHB)、羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)和已一甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA)，它們通過硫醚鍵形成五個內環(huán)，其活性體為二聚體或四聚體。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)Nisin?分子的類型有A,B,C,D,E和Z，其中以Nisin?A和Z兩種類型的研究較多。NisinA與NisinZ的差異僅在于第27位氨基酸的種類不同。前者為組氨酸(His)，后者為天冬酸胺(Asn)，其抗菌特性幾乎無差別。4乳酸鏈球菌素的性質Nisin的溶解性、穩(wěn)定性都與溶液的pH值密切相關。Nisin的溶解度隨pH值的下降而提高，pH值2．5時溶解度為12％，pH值為5．0時下降至1J4％，在中性及堿性條件下幾乎不溶解。實驗結果表明，Nisin在酸性條件下極為穩(wěn)定，pH2．0條件下可耐受高溫處理(121℃，15min)，而無活力損失，而在中性或堿性條件下即發(fā)生失活。物理和化學性質生物學特性當d一胰蛋白酶、胰酶制劑和枯草桿菌肽作用Nisin后，會使其失去活性，但羧肽酶A、羧肽酶E、腸肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶對Nisin無作用。Hurst報道，Nisin對凝乳蛋白酶、胰酶消化酶、唾液酶等很敏感，但對粗制凝乳酶、脂酶、淀粉酶不敏感，在酸性條件下，100℃、10min鏈酶蛋白酶不敏感。乳酸鏈球菌素的抑菌譜Nisin抑制大部分革蘭陽性菌及其芽孢的生長和繁殖.如葡萄球菌屬、鏈球菌屬以及梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬的細菌，特別是對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒桿菌作用明顯,在一定條件下，如冷凍、加熱、降低pH值、EDTA處理等，乳酸鏈球菌素亦可抑制一些革蘭陰性菌，如沙門氏菌、大腸桿菌、假單胞菌等的生長。

乳酸鏈球菌素的抑菌機理Nisin的抑菌機理是近年來的研究熱點之一，并不斷取得突破。其抑菌作用主要是殺菌，而非抑菌

或溶菌。Nisin對營養(yǎng)細胞的作用主要是在細胞膜上，它可以抑制細菌細胞壁中肽聚糖等的生物合成，使細胞膜和磷脂化合物的合成受阻，導致細胞內物質外泄，引起細胞裂解。乳酸鏈球菌素的遺傳學研究編碼Nisin的遺傳密碼的確切位置有兩種理論，一種認為它與質粒連鎖，另一種則認為是在染色體上。支持前一種觀點的主要證據有：1947年，Kozak研究產Nisin菌株的突變現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)，若先以原黃素或溴乙啶誘變并進行高溫處理，再以NTG進行誘變，

未檢測到回復突變株。并據此推測Nisin基因可能位

于質粒上。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Nisin的產生與一個

17.5MDa的質粒有關。1991年，Kaletta和Entian從乳酸

鏈球菌素6F3的質粒中成功克隆到了編碼Nisin的結構基因。乳酸鏈球菌素的遺傳學研究但是另一些研究者認為Nisin基岡位于染色體上，并有實驗證明一些產Nisin的菌株并不存在質粒IIII。

對Nisin基因定位的研究最近取得的一些突破性進展，一些研究者根據對染色體的缺失與雜交實驗提出Nisin結構基兇與染色體上的一個可接合轉移的轉座子有關。Horn等人則提出Nisin基因存在于一個70kb大小的轉座子Tn5301巾，同時另一些研究者的工作也證實了這個轉座子的存在，且發(fā)現(xiàn)Nisin基座是不穩(wěn)定的。這些發(fā)現(xiàn)可能提示我Nisin基因位于一個可轉座于質粒和染色體上的轉座子巾，在不同的菌株中Nisin基因的位置不一定相同。1988年，Nisin基因首次被克隆出來。不同于大部分的多肽類抗生素。Nisin前體蛋白是由核糖體合

成，經過一系列包括脫水、硫環(huán)形成等復雜的翻譯后加工過程，最終形成有活性的成熟Nisin分子110I。對Nisin遺傳學研究的深入，將使我們有可能定向改變Nisin的溶解度、穩(wěn)定性、抑菌范圍等，對于Nisin的應用前景有著重大而深遠的意義。乳酸鏈球菌素的生產研究進展乳酸鏈球菌產生菌的篩選目前主要是利用產生菌中乳酸鏈球菌素前體基因和其抗性基因以及蔗糖發(fā)酵基因內緊密連鎖的原理，在添加有乳酸鏈球菌素、蔗糖及澳甲酚紫的選擇培養(yǎng)基上,從牛乳中篩選產生菌。另外,也報道了通過一培養(yǎng)基中溶鈣圈直徑大小篩選產生菌株的方法。乳酸鏈球的發(fā)酵生產以乳酸乳球菌乳酸亞種作為生產菌株發(fā)酵生產。通過改變培養(yǎng)條件參數進一步提高產量,如碳源、氮源、溫度、接種量等。以對培養(yǎng)基改良的研究居多。對營養(yǎng)要求與產量關系的研究有助于了解生物合成的途徑和調控方式。發(fā)酵產物的提取工藝有機溶劑法分離提純乳酸鏈球菌素是最簡便的一種方法。Marttik向乳酸乳球菌發(fā)酵液中加入氯仿,攪拌后靜置,吸取乳濁液層,加入乙醇,產生含有Nisin的沉淀物,0.05mol/LHCI溶解沉淀,再用乙醇沉淀,最后干燥沉淀。這種方法得到的Nisin活力為2.0×106IU/g,純度為5%。該方法步驟繁瑣,產物純度低。利用菌體對乳酸鏈球菌在高pH吸附，低pH解吸附的特性，構建一種固定化細胞柱，將含乳酸鏈球菌的粗品通過固定化細胞，乳酸鏈球菌就被吸附從而達到分離濃縮的目的。有機溶劑法柱層析法吸附法該法是用aD10雜交瘤細酸胞制備乳酸鏈球菌的單克隆抗體，并將其通過N-羥基琥珀亞胺葡萄糖柱，在一定條件下抗體與葡萄糖偶聯(lián)，然后將乳酸鏈球菌發(fā)酵液除菌后進行柱層析。乳酸鏈球菌素的活性測定瓊脂擴散法該法很早就被應用于抑菌活性的測定?；钚晕镔|以擴散點為中心向培養(yǎng)基周圍均勻擴散,凡抑菌濃度所能達到之處指示菌不能生長,因而形成明顯的透明圈,透明圈的直徑大小反映活性物質的抑菌能力。這種方法一般是一種定性方法,但如果嚴格控制各種操作條件,通過抑菌圈直徑的大小也可以定量反映抑菌活性的大小。稀釋梯度法該法很早就被應用于抑菌活性的測定。活性物質以擴散點為中心向培養(yǎng)基周圍均勻擴散,凡抑菌濃度所能達到之處指示菌不能生長,因而形成明顯的透明圈,透明圈的直徑大小反映活性物質的抑菌能力。這種方法一般是一種定性方法,但如果嚴格控制各種操作條件,通過抑菌圈直徑的大小也可以定量反映抑菌活性的大小。比濁法微孔比濁法被廣泛應用于抑菌活性的測定。其原理與稀釋法相同。該法與稀釋法區(qū)別有兩點：（1）比濁法的稀釋間隔的密度較近,準確度高一些；（2）比濁法不以細菌有無生長的區(qū)別為終點,而是將標準品濃度和細菌生長所引起的混濁度求得一定的比例,再由細菌生長混濁度推算出效價。乳酸鏈球菌素的應用在啤酒釀造中的應用腐敗乳酸菌對Nisin敏感，但酵母幾乎不受其影啊，因此Nisin可與酵母一起在生產啤酒、果酒、烈性乙醇等酒精飲料時加入。啤酒釀造中添加Nisin的作用有以下幾點：對于生啤酒，在清酒缸中添加Nisin可延長1倍~2倍未經巴氏滅菌的桶裝或瓶裝啤酒的貨架期。對于熟啤酒，在清酒缸中添加Nisin可以降低滅菌的溫度和時間，改善啤酒的口味，并可節(jié)省能源，因為啤酒酵母的殺滅溫度為52℃、巴氏滅菌溫度為63℃~65℃，添加Nisin后可以在52℃~65℃中選擇溫度進行殺菌，減少啤酒因殺菌帶來的“熟味”和降低蒸汽消耗量。在擴培啤酒酵母所用的冷麥汁中添加Nisin，可保證酒母不受革蘭氏陽性細菌的污染。將Nisin直接加入發(fā)酵醪中，可以控制發(fā)酵過程中乳桿菌、片球菌等雜菌的生長。代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸洗法清除酵母菌中污染的乳酸菌。傳統(tǒng)的酸洗法對酵母的生命力、發(fā)酵力和凝聚性有著不良的影響，用Nisin代替酸洗酵母則無此后果。在肉制品中的應用肉制品如低溫肉制品、高溫肉制品等營養(yǎng)特別豐富、極易腐敗變質，添加一定量的Nisin可阻止芽孢的生長及其毒素的產生，同時還可降低食鹽及磷酸鹽的用量，使保存期可延長一倍以上。在低溫肉制品中的應用Nisin用于低溫肉制品中的保鮮是非常有效的。在世界許多國家，肉制品的生產和消費要經過長時間運輸與貯藏，在產品中加入Nisin，以延長低溫肉制品的保質期。有研究表明，在低溫肉制品如鹽水方腿、維也納香腸等中加入1~1.5g/kg的Nisin，再復合一定量的雙乙酸鈉可以有效的抑制產品中細菌和霉菌的生長與繁殖，顯著提高了保鮮效果，有效的延長了產品貨架期。在高溫肉制品中的應用肉制品屬高水分食品，各種微生物都能生長。特別是經過高溫處理的肉制品，其中的大部分微生物均被殺滅，但仍會殘存有少量的對熱有極強抗性的芽孢菌，此外由于高溫肉制品均經過高溫滅菌后在常溫中進行流通與儲存銷售，如果不加入部分能夠抑制芽孢類細菌的Nisin，芽孢類細菌萌發(fā)繁殖，極易導致產品敗壞，影響食品安全.在高溫肉制品中添加少量的Nisin，可有效的保障高溫肉制品的安全水平。在乳制品中的應用牛乳富含各種營養(yǎng)成分，深受人們喜愛。但牛乳及其制品在生產、加工、貯運、消費的過程中，極易受各種微生物的污染。由于乳制品特性不同，污染的微生物種類和數量差異也很大，乳制品保藏的問題始終是乳制品加工者首要解決的問題。巴氏殺菌乳中的應用巴氏殺菌乳采用巴氏殺菌工藝生產，只能殺死致病微生物，但仍含有能影響產品風味、引起產品變質的其它微生物，所以其保質期一般都較短，且需要冷藏。在巴氏殺菌乳中添加乳酸菌素可以對革蘭氏陽性菌起到抑制作用，從而延長產品的保質期并使其在常溫下保存。經試驗證實，加入30～50IU/mL的乳酸菌素可以使鮮奶貨架期延長一倍。Nisin應用于酸奶中，主要目的不是為了防腐，而是為了抑制后酸。酸奶因其低pH值的特點，污染菌主要是霉菌和酵母菌，Nisin對其無抑制作用，所以不能防止酸奶長毛和鼓蓋現(xiàn)象。后酸是影響酸奶保質期的一個主要因素，尤其是在現(xiàn)有的冷鏈條件下，我國酸奶的運輸、貯藏和銷售還沒有完全實現(xiàn)全程冷鏈，所以后酸問題尤為突出。在酸奶中添加Nisin，可以有效地抑制酸奶中的保加利亞乳桿菌。當Nisin添加量為60IU/mL時，可抑制酸奶的后酸化，對酸奶的黏度、酸菌活菌數無明顯影響。在酸奶中的應用乳酸鏈球菌素前景展望Nisin作為一種高效、無毒的天然食品防腐劑符合未來食品防腐劑的發(fā)展要求。它可廣泛地應用于食品，特別是需經熱處理的食品中，不但有較好的防腐抑菌作用，而且能減弱熱處理強度，從而降低加工成本,改善風味、外觀。Nisin用于食品防腐時，會受到-.些因素的影響，導致其抑菌能力下降。例如在未經熱加工或經簡單熱加工的食品中，來源于微生物、植物或動物有機體的蛋白酶在食品貨架期內可使Nisin降解。傳統(tǒng)化學防腐劑如苯甲酸及其鹽、山梨酸及其鹽、對羥基苯甲酸酯類等對于人體的危害正在引起世界各國的重視,其使用范圍與劑量也正在受到越來越嚴格的控制。而以乳酸鏈球菌素為代表的生物防腐劑因其高效、安全、無毒無殘留等特點正在受到全球市場的青睞,大有逐漸替代化學防腐劑的趨勢。乳酸鏈球菌素是一種多肽，人體食人后可被胃蛋白酶迅速分解為氨基酸，被人體吸收，不會改變人體腸道內正常菌群的存活，亦不會象抗生素-樣產生交叉抗性。乳酸鏈球菌素作為防腐劑添加于食品中，不會對食品的色、香、味、口感產生副作用。乳酸鏈球菌素的使用可降低食品的殺菌溫度、減少熱處理時間，從而保持食品的良好風味和營養(yǎng)價值，并節(jié)省能源，提高工作效率。乳酸鏈球菌素的酸熱穩(wěn)定性和低溫貯藏穩(wěn)定性，有利于持久發(fā)揮其防腐效果，延長食品的保質期和貨架期。乳酸鏈球菌素與熱處理殺菌相結合，可大大提高腐敗菌對熱的敏感性，尤其是芽抱。然而，作為食品防腐、保鮮劑的乳酸鏈球菌素存在著抗菌譜窄、只對G+菌有作用，對G-致病菌、酵母、霉菌及病毒無效等缺點。我國作為一個幅員遼闊、資源豐富的發(fā)展中國家,用于發(fā)展生物防腐劑產業(yè)的原料資源豐富且價格低廉,而且人力資源與成本也較發(fā)達國家具有明顯的優(yōu)勢。再加上近年來國家對于食品添加劑行業(yè)以及生物制造產業(yè)的政策上的大力支持,為發(fā)展乳酸鏈球菌素產業(yè)發(fā)展提供了諸多有利因素。隨著Nisin應用范圍與應用程度的不斷拓展,國內生產企業(yè)在發(fā)酵工藝提取工藝、質量管理、應用研究等方面不斷提高技術水平，以及行業(yè)監(jiān)督、管理制度的不斷完善,該產業(yè)仍將具有巨大的發(fā)展空間與市場前景。使Nisin發(fā)揮最佳作