受體研究技術課件

受體研究技術Techniquesinreceptorresearch

本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!相關幫助需要相關抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎fantibody全球抗體搜索引擎是一個供公共檢索的抗體數據庫，其抗體信息數據來源于全球范圍的研究機構與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數據庫與抗體應用評價數據庫兩部分組成，以幫助研究者更高效的尋找并評估該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數據庫之后更為復雜的應用型檢索平臺需要相關的實驗室儀器設備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術服務信息的，可以訪問探生網biomean進行咨詢，期待您的加入本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!第八章組織化學技術在受體定位中的應用第一節(jié)在受體定位中免疫組化的原理和方法免疫組化的原理免疫組織化學(Immunohistochemistry)又稱免疫細胞化學(Immunocytochemistry)﹐其主要原理是用標記的抗體對細胞或組織內的相應抗原(受體)進行免疫化學反應,經過組織化學呈色后用顯微鏡觀察受體在組織細胞中的分布和定位。膜受體或核受體Ag制備相應的特異性抗體標記抗體免疫組織化學測定本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!包括﹕1.抗原(受體)提取和純化抗原可為完整蛋白或一段特異性片段。2.免疫動物或細胞融合(單克隆抗體)。3.抗體效價檢測和提取。4.抗體標記。5.細胞和組織標本的制備。6.免疫組織化學反應和顯色。7.觀察和記錄結果。免疫組織化學的全部過程本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!免疫組織化學標本的制備抗原(受體)的準確顯示和定位與制備的組織和細胞標本質量密切相關細胞和組織標本的取材細胞和組織的固定組織切片*細胞和組織標本的取材細胞標本:細胞涂片組織標本:取新鮮組織,速凍或立即用固定劑固定.本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!保持細胞和組織的原有結構,防止組織自溶.不僅使細胞和組織內蛋白質凝固，終止和抑制外源性和內源性酶活性，更重要的是最大限度地保存細胞和組織的抗原性及防止抗原的擴散。*細胞和組織的固定

1固定劑一般為醛類固定劑和醇類固定劑醛類固定劑醛類為交聯劑，其作用是交聯組織中的氨基，保存抗原于原位。其特點是組織穿透力強，收縮小。常見有:福爾馬林,多聚甲醛等丙酮及醇類固定劑該類固定劑為沉淀劑,其作用是沉淀蛋白質和糖,組織穿透性很強,保存抗原的免疫活性較好.如乙醇,氯仿,冰醋酸等本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!載玻片處理*組織切片冰凍切片切片厚度一般為6μm,神經組織的研究要求切片厚度在20-100μm最突出的優(yōu)點是能夠較好地保存多種抗原的免疫活性,尤其是細胞表面抗原(如膜受體)更應采用冰凍切片.冰凍時注意減少冰晶形成.石蠟切片其優(yōu)點是組織結構保存良好,在病理和回顧性研究中有較大的實用價值,能連續(xù)切片,組織結構清晰,抗原定位準確.振動切片用振動切片機(Vibratome),對新鮮組織切片,組織不用固定和冰凍,也沒有石蠟包埋.本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!免疫組織化學方法免疫熒光組織化學免疫酶組織化學

免疫熒光組織化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗體標記上熒光素，再用這種熒光抗體作為探針檢測細胞內相應的抗原。(一)免疫熒光組織化學由于免疫組織化學的特異性、快速性和在細胞水平定位的敏感性與準確性，免疫熒光組織化學是免疫組織化學中廣泛應用于受體定位的技術之一本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!免疫熒光組織化學分直接法,夾心發(fā),間接法和補體法.其中直接法和間接法最為常用。直接法用已知特異性抗體與熒光素結合，制成熒光特異性抗體，直接與細胞中的抗原相結合，在熒光顯微鏡下可見抗原存在部位呈現特異性熒光.間接法先用Ab1與組織Ag結合,再用標記熒光的Ab2與Ab1結合形成抗原--抗體--熒光抗體復合物染色方法:BSA封閉---PBS沖洗---一抗---PBS沖洗---二抗---PBS沖洗---(防熒光淬滅封固劑或90%甘油PBS)封片本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!雙重免疫熒光染色雙重免疫熒光染色可在同一組織細胞標本上同時顯示兩種受體直接法A抗體用異硫氫酸熒光素(FITC)標記B抗體用得克薩斯紅(TR)或四乙基羅丹名(TRITC)標記按適當比例混合一抗標記組織抗原是目前最廣泛應用的雙重免疫熒光組織化學技術。所用的一抗必需是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔。B抗體為單克隆抗體，來自小鼠)。二抗為兩種不同熒光素標記(如FITC和TR)抗產生一抗的不同種屬動物的IgG(例如：FITC標記的羊抗兔IgG，TR標記的羊抗小鼠IgG)。間接法本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!(二)免疫酶組織化學它是在抗原抗體特異反應存在的前提下，借助酶組織化學的手段，檢測某種物質在組織細胞中的定位：即先將抗體與酶連接，抗體與組織內特異抗原反應，再借酶對底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產物或具一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成份的定位.本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!①酶催化的底物必須是特異的且易被顯示，所形成的產物易于光鏡或電鏡下觀察；②所形成的終產物沉淀必須穩(wěn)定,即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學定位。③酶標記過程中，酶與抗體連接不影響二者的活性。④被檢測組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似物用于標記的酶應具備以下特點本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!該方法的基本原理為PAP復合物中的抗HRP抗體和第一抗體來自相同種屬的動物，特異性一抗與組織細胞中抗原結合，二抗作為橋抗體將過氧化物酶抗過氧化物酶抗體復合物(PAP)連接在與組織細胞內抗原結合的一抗上.

過氧化物酶抗過氧化物酶法(PAP法)ABC復合物是將HRP連接在生物素上,再將生物素--HRP與卵白素結合而成。ABC法的基本原理是特異性一抗與組織細胞中抗原結合，生物素標記的二抗再與一抗結合，ABC復合物中的卵白素分別連接生物素標記的二抗和生物素標記的HRP,最后進行顯色定位。

卵白素-生物素-過氧化物酶復合物法(AvidinBiotin-PeroxidaseComplexMethod,ABC法).本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!A.用免疫酶組織化學ABC法顯示甲狀腺激素受體β2在大鼠中縫核神經無細胞核中的定位。B.用免疫前血清代替抗甲狀腺激素受體β2抗體，所染色結果為陰性。標尺：50um.(YUANETAL.brainResearch2000,868:22)免疫酶組織化學ABC法本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!第二節(jié)在受體定位中原位雜交組織化學的原理和方法原位雜交組織化學

(InSituhybridizationHistochemistry)

是應用帶有標記物的已知堿基序列為探針(Probe)與組織、細胞中待測的核酸按堿基配對的原則進行特異性結合，形成雜交體，然后用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過放射自顯影或免疫組織化學方法在核酸原有的位點進行細胞內定位觀察。原位雜交組織化學是研究受體的mRNA在特定細胞中表達和定位的有力工具。許多受體有不同的亞型，有些受體亞型在藥理學上僅有非常細微的差別。由于不同的亞型由不同的基因編碼，檢測其相應的mRNA可對不同的受體亞型進行鑒別和定位。本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!標記探針*最常用的標記物為放射性同位素3H的分辨力高,能得到良好的細胞定位，但放射自顯影時間長，一般需幾周或更長.32P能量最大,放射自顯影時間較短，僅需幾天，但分辨力低.35S標記的探針做原位雜交，其分辨力不及3H，但明顯優(yōu)于32P，能得到良好的定位，放射自顯影時間約10天，比32P長，但比3H短.35S為目前原位雜交放射性標記物中應用最為廣泛的一種同位素*另一類常見的標記物為地高辛(Digoxingenin)地高辛分子可被特異性抗體檢測,方法簡便,無放射性污染問題,且分辨力比較高。不足之處在于其敏感性較放射自顯影低，且定量較為困難.本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!二原位雜交組織化學反應1放射性標記RNA探針的原位雜交*雜交前處理:雜交前用一系列溶液預處理,目的是通過降低探針與組織切片的靜電結合，以減低非特異性背景著色.*雜交反應:溫度一般在37-420C左右;過夜雜交;RNA探針在加入到雜交液之前，必需加熱至800C變性,反應10分鐘后，速置于冰上.探針的濃度一般為0.5-5.0μg/ml.*雜交后處理:包括RNA酶消化及一系列不同濃度不同溫度的鹽溶液漂洗.

本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!2放射性標記寡核苷酸探針的原位雜交用寡核苷酸探針進行原位雜交，其嚴格度可高于RNA探針。原因是寡核苷酸探針較短及DNA：RNA雜交體的穩(wěn)定性遠低于RNA:RNA雜交體。通常雜交溫度為370C，長于36個堿基的寡核苷酸探針雜交溫度可提高到420C。雜交溫度低，所需的雜交時間要長，通常需過夜。常用探針濃度為0.5μg/ml。原位雜交組織化學反應的檢測方法放射自顯影檢測將雜交后的切片----浸入核乳膠----取出涼干----防入暗盒密封---于40C冰箱內曝光----曝光時間(32P約需4-7天，3H約需2-3月，35S約需2-4周)本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!3

地高辛標記的RNA探針的原位雜交用標準的免疫組織化學檢測,連接堿性磷酸酶的抗地高辛抗體與雜交體中的地高辛結合，用硝基藍四唑(NBT)作為組織化學的底物進行顯色.4原位雜交組織化學與免疫組織化學雙重染色法雙重染色法是先后在同一張切片或相鄰切片用原位雜交組織化學和免疫組織化學進行染色，在同一細胞同時顯示編碼某種受體的mRNA和相應的受體或與其共存的其它蛋白質和多肽。鄰片法可使原位雜交和免疫組化染色都獲得理想的結果，易成功，但易產生空間誤差和樣本誤差。同一張切片上進行雙重染色法可克服這些誤差，但第一次染色總要不同程度地影響第二次染色。本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!由于mRNA易被染色過程中污染有少量RNA酶的液體所降解，因而實踐中往往先進行原位雜交組織化學染色，但對某些較敏感易丟失的蛋白質或生物活性物質，需要先進行免疫組織化學染色，二者須加以平衡考量。在應用雙重染色法中，選用的固定劑除了能保持組織細胞良好的形態(tài)結構，還要同時有利于抗原和靶核酸的保留。常用的固定劑為4%多聚甲醛.本文由探生科技技術人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體