受體研究技術(shù)課件

受體研究技術(shù)Techniquesinreceptorresearch

本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!相關(guān)幫助需要相關(guān)抗體試劑的可以訪問(wèn)Fantibody全球抗體搜索引擎fantibody全球抗體搜索引擎是一個(gè)供公共檢索的抗體數(shù)據(jù)庫(kù)，其抗體信息數(shù)據(jù)來(lái)源于全球范圍的研究機(jī)構(gòu)與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫(kù)與抗體應(yīng)用評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)兩部分組成，以幫助研究者更高效的尋找并評(píng)估該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)之后更為復(fù)雜的應(yīng)用型檢索平臺(tái)需要相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設(shè)備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術(shù)服務(wù)信息的，可以訪問(wèn)探生網(wǎng)biomean進(jìn)行咨詢，期待您的加入本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!第八章組織化學(xué)技術(shù)在受體定位中的應(yīng)用第一節(jié)在受體定位中免疫組化的原理和方法免疫組化的原理免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry)﹐其主要原理是用標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(受體)進(jìn)行免疫化學(xué)反應(yīng),經(jīng)過(guò)組織化學(xué)呈色后用顯微鏡觀察受體在組織細(xì)胞中的分布和定位。膜受體或核受體Ag制備相應(yīng)的特異性抗體標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)測(cè)定本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!包括﹕1.抗原(受體)提取和純化抗原可為完整蛋白或一段特異性片段。2.免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合(單克隆抗體)。3.抗體效價(jià)檢測(cè)和提取。4.抗體標(biāo)記。5.細(xì)胞和組織標(biāo)本的制備。6.免疫組織化學(xué)反應(yīng)和顯色。7.觀察和記錄結(jié)果。免疫組織化學(xué)的全部過(guò)程本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!免疫組織化學(xué)標(biāo)本的制備抗原(受體)的準(zhǔn)確顯示和定位與制備的組織和細(xì)胞標(biāo)本質(zhì)量密切相關(guān)細(xì)胞和組織標(biāo)本的取材細(xì)胞和組織的固定組織切片*細(xì)胞和組織標(biāo)本的取材細(xì)胞標(biāo)本:細(xì)胞涂片組織標(biāo)本:取新鮮組織,速凍或立即用固定劑固定.本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!保持細(xì)胞和組織的原有結(jié)構(gòu),防止組織自溶.不僅使細(xì)胞和組織內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止和抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，更重要的是最大限度地保存細(xì)胞和組織的抗原性及防止抗原的擴(kuò)散。*細(xì)胞和組織的固定

1固定劑一般為醛類固定劑和醇類固定劑醛類固定劑醛類為交聯(lián)劑，其作用是交聯(lián)組織中的氨基，保存抗原于原位。其特點(diǎn)是組織穿透力強(qiáng)，收縮小。常見(jiàn)有:福爾馬林,多聚甲醛等丙酮及醇類固定劑該類固定劑為沉淀劑,其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖,組織穿透性很強(qiáng),保存抗原的免疫活性較好.如乙醇,氯仿,冰醋酸等本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!載玻片處理*組織切片冰凍切片切片厚度一般為6μm,神經(jīng)組織的研究要求切片厚度在20-100μm最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好地保存多種抗原的免疫活性,尤其是細(xì)胞表面抗原(如膜受體)更應(yīng)采用冰凍切片.冰凍時(shí)注意減少冰晶形成.石蠟切片其優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好,在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值,能連續(xù)切片,組織結(jié)構(gòu)清晰,抗原定位準(zhǔn)確.振動(dòng)切片用振動(dòng)切片機(jī)(Vibratome),對(duì)新鮮組織切片,組織不用固定和冰凍,也沒(méi)有石蠟包埋.本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!免疫組織化學(xué)方法免疫熒光組織化學(xué)免疫酶組織化學(xué)

免疫熒光組織化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗體標(biāo)記上熒光素，再用這種熒光抗體作為探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原。(一)免疫熒光組織化學(xué)由于免疫組織化學(xué)的特異性、快速性和在細(xì)胞水平定位的敏感性與準(zhǔn)確性，免疫熒光組織化學(xué)是免疫組織化學(xué)中廣泛應(yīng)用于受體定位的技術(shù)之一本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!免疫熒光組織化學(xué)分直接法,夾心發(fā),間接法和補(bǔ)體法.其中直接法和間接法最為常用。直接法用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞中的抗原相結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光.間接法先用Ab1與組織Ag結(jié)合,再用標(biāo)記熒光的Ab2與Ab1結(jié)合形成抗原--抗體--熒光抗體復(fù)合物染色方法:BSA封閉---PBS沖洗---一抗---PBS沖洗---二抗---PBS沖洗---(防熒光淬滅封固劑或90%甘油PBS)封片本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!雙重免疫熒光染色雙重免疫熒光染色可在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上同時(shí)顯示兩種受體直接法A抗體用異硫氫酸熒光素(FITC)標(biāo)記B抗體用得克薩斯紅(TR)或四乙基羅丹名(TRITC)標(biāo)記按適當(dāng)比例混合一抗標(biāo)記組織抗原是目前最廣泛應(yīng)用的雙重免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)。所用的一抗必需是來(lái)自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來(lái)自家兔。B抗體為單克隆抗體，來(lái)自小鼠)。二抗為兩種不同熒光素標(biāo)記(如FITC和TR)抗產(chǎn)生一抗的不同種屬動(dòng)物的IgG(例如：FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，TR標(biāo)記的羊抗小鼠IgG)。間接法本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!(二)免疫酶組織化學(xué)它是在抗原抗體特異反應(yīng)存在的前提下，借助酶組織化學(xué)的手段，檢測(cè)某種物質(zhì)在組織細(xì)胞中的定位：即先將抗體與酶連接，抗體與組織內(nèi)特異抗原反應(yīng)，再借酶對(duì)底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成份的定位.本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!①酶催化的底物必須是特異的且易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于光鏡或電鏡下觀察；②所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定,即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位。③酶標(biāo)記過(guò)程中，酶與抗體連接不影響二者的活性。④被檢測(cè)組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下特點(diǎn)本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!該方法的基本原理為PAP復(fù)合物中的抗HRP抗體和第一抗體來(lái)自相同種屬的動(dòng)物，特異性一抗與組織細(xì)胞中抗原結(jié)合，二抗作為橋抗體將過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶抗體復(fù)合物(PAP)連接在與組織細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合的一抗上.

過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法(PAP法)ABC復(fù)合物是將HRP連接在生物素上,再將生物素--HRP與卵白素結(jié)合而成。ABC法的基本原理是特異性一抗與組織細(xì)胞中抗原結(jié)合，生物素標(biāo)記的二抗再與一抗結(jié)合，ABC復(fù)合物中的卵白素分別連接生物素標(biāo)記的二抗和生物素標(biāo)記的HRP,最后進(jìn)行顯色定位。

卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法(AvidinBiotin-PeroxidaseComplexMethod,ABC法).本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!A.用免疫酶組織化學(xué)ABC法顯示甲狀腺激素受體β2在大鼠中縫核神經(jīng)無(wú)細(xì)胞核中的定位。B.用免疫前血清代替抗甲狀腺激素受體β2抗體，所染色結(jié)果為陰性。標(biāo)尺：50um.(YUANETAL.brainResearch2000,868:22)免疫酶組織化學(xué)ABC法本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!第二節(jié)在受體定位中原位雜交組織化學(xué)的原理和方法原位雜交組織化學(xué)

(InSituhybridizationHistochemistry)

是應(yīng)用帶有標(biāo)記物的已知堿基序列為探針(Probe)與組織、細(xì)胞中待測(cè)的核酸按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，然后用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)放射自顯影或免疫組織化學(xué)方法在核酸原有的位點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位觀察。原位雜交組織化學(xué)是研究受體的mRNA在特定細(xì)胞中表達(dá)和定位的有力工具。許多受體有不同的亞型，有些受體亞型在藥理學(xué)上僅有非常細(xì)微的差別。由于不同的亞型由不同的基因編碼，檢測(cè)其相應(yīng)的mRNA可對(duì)不同的受體亞型進(jìn)行鑒別和定位。本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!標(biāo)記探針*最常用的標(biāo)記物為放射性同位素3H的分辨力高,能得到良好的細(xì)胞定位，但放射自顯影時(shí)間長(zhǎng)，一般需幾周或更長(zhǎng).32P能量最大,放射自顯影時(shí)間較短，僅需幾天，但分辨力低.35S標(biāo)記的探針做原位雜交，其分辨力不及3H，但明顯優(yōu)于32P，能得到良好的定位，放射自顯影時(shí)間約10天，比32P長(zhǎng)，但比3H短.35S為目前原位雜交放射性標(biāo)記物中應(yīng)用最為廣泛的一種同位素*另一類常見(jiàn)的標(biāo)記物為地高辛(Digoxingenin)地高辛分子可被特異性抗體檢測(cè),方法簡(jiǎn)便,無(wú)放射性污染問(wèn)題,且分辨力比較高。不足之處在于其敏感性較放射自顯影低，且定量較為困難.本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!二原位雜交組織化學(xué)反應(yīng)1放射性標(biāo)記RNA探針的原位雜交*雜交前處理:雜交前用一系列溶液預(yù)處理,目的是通過(guò)降低探針與組織切片的靜電結(jié)合，以減低非特異性背景著色.*雜交反應(yīng):溫度一般在37-420C左右;過(guò)夜雜交;RNA探針在加入到雜交液之前，必需加熱至800C變性,反應(yīng)10分鐘后，速置于冰上.探針的濃度一般為0.5-5.0μg/ml.*雜交后處理:包括RNA酶消化及一系列不同濃度不同溫度的鹽溶液漂洗.

本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!2放射性標(biāo)記寡核苷酸探針的原位雜交用寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交，其嚴(yán)格度可高于RNA探針。原因是寡核苷酸探針較短及DNA：RNA雜交體的穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于RNA:RNA雜交體。通常雜交溫度為370C，長(zhǎng)于36個(gè)堿基的寡核苷酸探針雜交溫度可提高到420C。雜交溫度低，所需的雜交時(shí)間要長(zhǎng)，通常需過(guò)夜。常用探針濃度為0.5μg/ml。原位雜交組織化學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)方法放射自顯影檢測(cè)將雜交后的切片----浸入核乳膠----取出涼干----防入暗盒密封---于40C冰箱內(nèi)曝光----曝光時(shí)間(32P約需4-7天，3H約需2-3月，35S約需2-4周)本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!3

地高辛標(biāo)記的RNA探針的原位雜交用標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)檢測(cè),連接堿性磷酸酶的抗地高辛抗體與雜交體中的地高辛結(jié)合，用硝基藍(lán)四唑(NBT)作為組織化學(xué)的底物進(jìn)行顯色.4原位雜交組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)雙重染色法雙重染色法是先后在同一張切片或相鄰切片用原位雜交組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)進(jìn)行染色，在同一細(xì)胞同時(shí)顯示編碼某種受體的mRNA和相應(yīng)的受體或與其共存的其它蛋白質(zhì)和多肽。鄰片法可使原位雜交和免疫組化染色都獲得理想的結(jié)果，易成功，但易產(chǎn)生空間誤差和樣本誤差。同一張切片上進(jìn)行雙重染色法可克服這些誤差，但第一次染色總要不同程度地影響第二次染色。本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家!由于mRNA易被染色過(guò)程中污染有少量RNA酶的液體所降解，因而實(shí)踐中往往先進(jìn)行原位雜交組織化學(xué)染色，但對(duì)某些較敏感易丟失的蛋白質(zhì)或生物活性物質(zhì)，需要先進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，二者須加以平衡考量。在應(yīng)用雙重染色法中，選用的固定劑除了能保持組織細(xì)胞良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還要同時(shí)有利于抗原和靶核酸的保留。常用的固定劑為4%多聚甲醛.本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體