基因的克隆與轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)四基因的克隆與重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆胀庠椿蚺c載體連接的原理及方式理解重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的條件了解轉(zhuǎn)化的過程實(shí)驗(yàn)步驟及原理純化載體特定基因與載體連接重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選含重組子的大腸桿菌載體外源DAN片段不能在細(xì)菌中穩(wěn)定遺傳，隨細(xì)菌的繁殖而擴(kuò)增。須有載體攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞專為分子克隆提供的載體特點(diǎn)：多為環(huán)形含多克隆位點(diǎn)，可選擇適當(dāng)內(nèi)切酶切開含抗藥基因，可使宿主在含某種抗菌素的培養(yǎng)基上存活可在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制，也可隨宿主細(xì)胞的繁殖而擴(kuò)增外源基因與載體連接外源DNA片段與載體的連接有多種方式，選擇不同酶切，連接方式也不同。單酶切產(chǎn)生平端切口，與外源DNA片段連接，效率很低。因Taq酶的特殊活性，PCR產(chǎn)物3‘-末端常有突出的A。針對此特點(diǎn)，有3‘-末端突出的T載體。單酶切產(chǎn)生粘末端，連接效率較高，但因載體兩端的粘末端相同，故外源DNA片段的連接沒有方向性，載體本身也容易回連。雙酶切產(chǎn)生粘性末端，連接效率高，且可確定插入片段的方向。單酶切產(chǎn)生平端切口單酶切產(chǎn)生粘末端雙酶切產(chǎn)生粘性末端重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵是制備感受態(tài)細(xì)菌，使受體菌處于易于吸收和容納外源DNA的易感狀態(tài)。常用方法是氯化鈣冰浴法。0oC條件下用低滲CaCl2

溶液處理快速生長的細(xì)菌，使細(xì)胞壁疏松，細(xì)菌膨脹成球形。重組DNA分子易吸附于感受態(tài)細(xì)胞表面，短暫的42oC熱處理促進(jìn)細(xì)胞對質(zhì)粒的吸收。制備感受態(tài)細(xì)菌CaCl20oC重組DNA分子進(jìn)入細(xì)胞篩選含重組子的大腸桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌的培養(yǎng)由于質(zhì)粒攜帶抗藥基因，故獲得質(zhì)粒的細(xì)菌可在抗性培養(yǎng)基上生長，形成單菌落。重組子單菌落的篩選獲得質(zhì)粒的細(xì)菌均可形成單菌落，故需進(jìn)一步鑒定具有外源基因插入的重組子單菌落，常用方法是藍(lán)白篩選（篩選原理下一實(shí)驗(yàn)詳細(xì)介紹）。操作步驟載體及目的基因的酶切酶切產(chǎn)物的純化載體與目的基因的連接感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化載體及目的基因的酶切載體的酶切：目的基因的酶切：質(zhì)粒(Bluescript)4μlPCR純化產(chǎn)物+ddH2O至64μl10×Buffer2μl10×Buffer8μlBamHⅠ1μlBamHⅠ4μlEcoRⅠ1μlEcoRⅠ4μlddH2O12μl總體積20μl80μl分別混勻，置37oC保溫1.5小時酶切產(chǎn)物的純化混合兩組酶切產(chǎn)物，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，方法見實(shí)驗(yàn)三。載體與目的基因的連接純化產(chǎn)物溶于8μl水中，再加入：10×T4DNA連接酶緩沖液1μlT4DNA連接酶1μl總體積10μl16oC保溫4小時或過夜，-20oC冷凍保存感受態(tài)細(xì)胞制備（一）受體菌的活化取凍存XL1-blue菌株，劃線接種于LB(amp-)固體培養(yǎng)基上，37oC培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)單菌落用接種棒挑選單菌落接種于50mlLB(amp-)液體培養(yǎng)基，37oC振蕩培養(yǎng)6-8小時制備感受態(tài)菌的最佳時機(jī)一般以菌液出現(xiàn)輕度混濁為宜。感受態(tài)細(xì)胞制備（二）3000rpm離心5min，棄上清。25ml預(yù)冷的0.1MCaCl2懸浮菌體沉淀，置冰浴中靜置30min。3000rpm離心5min，棄上清。1ml預(yù)冷的0.1MCaCl2懸浮菌體沉淀，置冰浴中過夜。轉(zhuǎn)化（一）取1.5ml離心管3支，按下表操作：實(shí)驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組感受態(tài)菌液100μl100μl100μl連接反應(yīng)液5μlpBluescript1μl42oC準(zhǔn)確水浴90秒，迅速取出，置冰水浴。各管加入amp+LB培養(yǎng)液200μl，混勻，37振蕩復(fù)蘇45min。轉(zhuǎn)化（二）取4皿amp+固體培養(yǎng)基，每皿加入IPTG8μl，X-gal40μl，均勻涂布，置37oC恒溫箱至液體消失。陽性對照與陽性對照各取50μ