第十七章高效液相色譜法s

一、HPLC法的特點（與經(jīng)典LC法比較）高效液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的?，F(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率

和實現(xiàn)了自動化

操作。

高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術(shù).§17.1概述

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學高效液相色譜經(jīng)典色譜

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經(jīng)典的液相色譜法，流動相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.5107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。

因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動化等特點。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。

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學二、液相色譜與氣相色譜的比較

液相色譜所用基本概念：保留值、塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致。液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率方程也與氣相色譜基本一致。但由于在液相色譜中以液體代替氣相色譜中的氣體作為流動相，而液體和氣體的性質(zhì)不相同；此外，液相色譜所用的儀器設(shè)備和操作條件也與氣相色譜不同，所以，液相色譜與氣相色譜有一定差別，主要有以下幾方面：

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氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對高沸點化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應(yīng)用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計只有大約20%的有機物能用氣相色譜分析；液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機物的70~80%。

液相色譜與氣相色譜的比較（1）應(yīng)用范圍不同

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因為：①氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動相，增大分離的選擇性。液相色譜與氣相色譜的比較（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作

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學②液相色譜固定相類型多,如離子交換色譜和排阻色譜等，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。液相色譜與氣相色譜的比較

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學（3）由于液體的擴散系數(shù)比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴張可以忽略不計。（4）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復雜，價格昂貴。在實際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補充的。液相色譜與氣相色譜的比較

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綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。該法已成為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要手段之一，目前在化學、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等科學領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。

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學§17.2高效液相色譜儀

高效液相色譜儀一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入待分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。

§

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學貯液器高壓泵檢測器梯度淋洗裝置色譜柱壓力表進樣器組分收集器高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)

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學高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)

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由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是儀器最重要的部件：由儲液罐、高壓輸液泵**、過濾器、壓力脈動阻力器等組成。對高壓輸液泵的要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。一、高壓輸液系統(tǒng)

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學常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重現(xiàn)性差它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵比恒壓泵優(yōu)越，使用較普遍。恒流泵分機械注射泵和機械往復泵**兩種。

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學高壓輸液泵：主要部件之一，壓力：150～450×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。

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學二、進樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5-30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴。

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流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：

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學準備狀態(tài)進樣狀態(tài)流動相入口色譜柱入口樣品出口樣品入口流動相入口色譜柱入口樣品環(huán)

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學三、分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技術(shù)的性能不受影響。

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柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。

對色譜柱的要求：柱效高，選擇性好，分析速度快等。

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學使用色譜柱注意事項：1溶劑要脫氣，溶劑和樣品應(yīng)過濾，防止堵塞。2加前置柱。3更換流動相要漸變。4用后要保護好。

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學四、檢測系統(tǒng)

HPLC與GC一樣，要求檢測器靈敏度高，重現(xiàn)性好，定量準確，對溫度和流速的變化不敏感，應(yīng)用范圍廣，線性范圍寬等優(yōu)點檢測器分為兩大類：一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等?，F(xiàn)將常用的檢測器介紹如下:

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學HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器。它的原理基于待測組分對特定波長的紫外或可見光的選擇性吸收，試樣濃度與吸光度的關(guān)系服從朗伯-比爾定律。高效液相色譜檢測器：1.紫外光度檢測器（UV）優(yōu)點：靈敏度高，選擇性好，對流量和溫度的變化不敏感，適用于梯度淋洗，線性范圍寬，適用于痕量分析。最小檢測量10-9g·mL-1。

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學缺點：只適用于檢測能吸收紫外、可見光的物質(zhì)，流動相選擇受限制。要求流動相在測定波長下無吸收。

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學2.示差折光率檢測器檢測器是一種通用型檢測器。它的作用原理是純流動相與包含樣品的流動相之間的折射率不同，檢測器把這種差值檢測出來，給出信號，信號的大小與樣品含量成正比。純流動相與待測組分的折射率相差越大，檢測器靈敏度越高，靈敏度可達10-7g·cm-3。通用性強，不破壞樣品，線性范圍寬。缺點是靈敏度低，不適宜痕量分析。對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。3.熒光檢測器4.蒸發(fā)光散射檢測器5.電化學檢測器6.質(zhì)譜檢測器

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它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置。HPLC梯度淋洗與GC中的程序升溫一樣。

對于某些復雜樣品，組分的k′范圍很寬，用一種強度的溶劑淋洗時不能得到很好的分離，采用梯度淋洗。就是組成流動相的兩種或兩種以上不同的溶劑按一定程序改變配比、極性、pH、離子強度、通過流動相極性的變化來改變待分離樣品的選擇因子和tR，從而提高分離效果和分析速度。5、附屬系統(tǒng)

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學外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。

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和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相——固定相和流動相組成。

液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑。

被分離混合物由流動相液體推動進入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。液相色譜分離原理及分類§17.3高效液相色譜的類型

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液相色譜分離的實質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。

根據(jù)分離機制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化學鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。

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學一、液-固吸附色譜法(LSAC)

液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。1．分離原理當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，與流動相溶劑分子（S）在固定相表面發(fā)生競爭吸附:X+nS吸附=X吸附

+nS

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X+nS吸附=X吸附

+nS達平衡時，有其中K為吸附平衡常數(shù)，K值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。K值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。K值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。

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學2．固定相

吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，因此，以硅膠用得最多。在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。

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學3、流動相

一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。

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學二、液-液分配色譜（LLPC）

在液-液色譜中，流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。1．分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分。

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2、固定相

由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液β，β′一氧二丙腈，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊烷等。為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過化學反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學鍵合固定相上進行的。

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學3．流動相

在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。

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學三、化學鍵合相色譜（CBPC）

采用化學鍵合相的液相色譜稱為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。

由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。

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學1．鍵合固定相類型

用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機分子可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類：（1）疏水基團如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等。（2）極性基團如氨丙基，氰基、醚和醇等。（3）離子交換基團如作為陰離子交換基團的胺基，季胺鹽；作為陽離子交換基團的磺酸基等。

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學2．反相鍵合相色譜法

此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37、硅膠-苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇-水、乙腈-水、水和無機鹽的緩沖溶液等。

它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點。

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學3.正相鍵合相色譜法

此法是以極性的有機基團，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為流動相，分離極性化合物。此時，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。

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學4.離子性鍵合相色譜

當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學鍵合各種離子交換基團，如-SO3H、-CH2NH2、-COOH等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。以上討論了各種類型化學鍵合相色譜法，歸納鍵合相色譜的最大優(yōu)點是：通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色譜法中，約有8O％的分離問題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點是不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。

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學四、離子交換色譜法（IEC）

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。

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學1．離子交換原理

離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽離子交換：

陰離子交換：

一般形式：R－A＋B＝R－B＋A

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2．固定相作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分（見下表）

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學3．流動相

離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）水的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。

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學五、離子色譜（IC）反相色譜中，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分與其中的反離子形成中性離子對，增加k和tR，以改善分離。1）離子對試劑：烷基磺酸鈉→分析堿四丁基季胺鹽→分析酸2）影響k的因素a．與m的極性有關(guān)（同反相色譜）b．與R的鏈長有關(guān)：R↑長，極性↓小，tR↑，k↑3）適用：較強的有機酸、堿1．反相離子對色譜法（IPC或PIC）

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學2．反相離子抑制色譜在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相pH值，抑制組分解離，增加其k和tR，以達到改善分離的目的。1）離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì)、pH一定的緩沖溶液

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學2）k的影響因素：與流動相極性有關(guān)，還與pH值有關(guān)選擇流動相：應(yīng)同時考慮極性及pH值酸性物質(zhì)——加入酸HActR↑，k↑

堿性物質(zhì)——加入堿NH3·H2OtR↑，k↑調(diào)節(jié)pH范圍：3.0~8.0pH>8.0破壞鍵合相與載體的結(jié)合

pH<3.0腐蝕柱子3）適用：極弱酸堿物質(zhì)

pH=3~7弱酸；pH=7~8弱堿；兩性化合物

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學3．對流動相的要求：1）與固定液不反應(yīng)2）對樣品有良好溶解度

k=1~10k=2~5最理想的3）與檢測器匹配：

UV（常用，測定波長應(yīng)大于溶劑的截止波長）熒光，電化學4）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈）使用前過濾、脫氣

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學4．洗脫方式

1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）類似GC的等溫度洗脫2）梯度洗脫：在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例即不斷改變其極性（兩個泵）適于分析極性差別較大的復雜組分類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）

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學六、凝膠色譜法（SEC）

凝膠色譜法又稱尺寸排阻色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。它具有其他液相色譜所沒有的特點：（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器（3）固定相與分子