第五章-三帖皂甙類制劑的分析

第三節(jié)三帖皂苷類成分分析本節(jié)要求1.了解皂苷的理化性質(zhì)2.熟悉含皂苷類制劑供試液的提取純化制備方法3.掌握含皂苷類制劑的定量測定原理和方法4.掌握含皂苷類制劑的定性鑒別的原理和方法一、概述

二、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)

三、皂苷類成分的定性鑒別

四、皂苷類成分的定量分析

五、應(yīng)用實(shí)例

內(nèi)容苷類（glycosides）稀酸或酶水解后產(chǎn)生糖和非糖兩部分的化合物。一般為活性成分，如強(qiáng)心苷、皂苷等。無色、無臭晶體。溶于水、乙醇，難溶于親脂性有機(jī)溶劑；苷元則相反。

人參皂苷

皂苷概述*定義：皂苷大多數(shù)是指螺甾烷及其生源相似的甾族化合物的低聚糖苷或三萜類化合物的低聚糖苷。具有發(fā)泡、溶血等特性。組成皂苷元：甾體皂苷元（27個(gè)C，合成激素的原料）三萜皂苷元（30個(gè)C，生理活性成分）糖：多分子糖或糖醛酸皂苷的分類按苷元分為兩大類：甾體皂苷：――27個(gè)Ｃ組成的甾體衍生物。三萜皂苷：――30個(gè)C組成的三萜衍生物，大多數(shù)三萜化合物均可看作有6個(gè)異戊二烯單位連接而成。游離的三萜類化合物通常多不溶于水，與糖結(jié)合后成苷，則可溶于水，振搖后可生成膠體溶液，并有持久性似肥皂溶液的泡沫。五環(huán)三萜皂苷

β-香樹脂醇型（齊墩果烷型）α-香樹脂醇型（熊果烷型）羽扇豆醇型四環(huán)三萜皂苷達(dá)馬烷型羊毛脂甾烷型其他分類單皂苷：中性皂苷、酯皂苷、酸性皂苷

雙皂苷（2）*三萜皂苷（酸性皂苷）含三帖類成分的常用中藥人參西洋參三七黃芪柴胡甘草桔梗遠(yuǎn)志酸棗仁三萜類化合物是中藥中一類主要有效成分，具有多方面的生理活性。如人參皂苷可促進(jìn)RNA蛋白質(zhì)的生物合成調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，增強(qiáng)免疫功能；柴胡皂苷有抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)和明顯的抗炎癥作用，并能減低血漿中膽固醇和甘油三酯的水平；七葉皂苷有明顯的抗?jié)B出、抗炎、抗瘀血的作用；甘草皂苷有促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，并能防治肝硬化、抗動脈粥樣硬化、抗?jié)兊茸饔?；還有一些苷皂類化合物有抗腫瘤活性。二、物理性質(zhì)性狀多數(shù)為無色或乳白色無定形粉末，少數(shù)為晶體；多數(shù)有苦、辛辣味，對粘膜有刺激性；有吸濕性。*溶解性

(掌握）皂苷元：不溶于水，而溶于石油醚、C6H6、Et2O、CHCl3；酸性皂苷元可溶于堿水

皂苷:易溶于水，熱甲醇、乙醇。

在含水丁醇/戊醇中溶解度較大。不溶于Et2O、CHCl3等。皂苷類化合物的溶解性一般規(guī)律含有皂苷類成分的中藥制劑在進(jìn)行成分分析時(shí)，供試液制備常依據(jù)其溶解性特點(diǎn)選擇提取溶劑及方法供試液制備常用方法及溶劑選擇（掌握）皂苷元的提取一般步驟

酸水解-有機(jī)溶劑提取法

物理性質(zhì)*發(fā)泡性皂苷能降低水溶液的表面張力，振搖后產(chǎn)生持久性泡沫。

*

物理性質(zhì)*溶血性皂苷有使紅細(xì)胞破裂的作用，用溶血指數(shù)表示。溶血指數(shù)：對同一動物來源的紅細(xì)胞稀懸浮液，在同一條件下造成完全溶血的最低濃度。如薯蕷皂苷1:400000（毒性大）溶血作用與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系：皂苷元決定有無溶血作用；糖決定溶血作用的強(qiáng)弱。單糖鏈皂苷較顯著；酸性皂苷中等；中性三萜皂苷最弱。皂苷消化道不吸收，口服無毒，膽甾醇能解皂毒。

物理性質(zhì)熔點(diǎn)皂苷無明顯熔點(diǎn)(dec.)；苷元熔點(diǎn)隨羥基數(shù)目增加而升高(單-OH<208℃,三-OH>240℃)；甾體皂苷鑒定時(shí)不能單靠熔點(diǎn)（混熔點(diǎn)不降）。旋光度甾體皂苷及苷元均為左旋，且與雙鍵有關(guān)。未飽和的苷元或乙?；锞^相應(yīng)的飽和物為負(fù)（左旋）。

化學(xué)性質(zhì)金屬鹽類的反應(yīng)：皂苷水溶液與鉛鹽、鋇鹽、銅鹽等產(chǎn)生沉淀

酸性皂苷：與硫酸銨、硫酸鋁或其他中性鹽類生產(chǎn)沉淀

中性皂苷：與堿式醋酸鉛或氫氧化鋇等堿性鹽類產(chǎn)生沉淀可進(jìn)行含皂苷類成分制劑的提取和粗分離化學(xué)性質(zhì)顯色反應(yīng)：無水條件下（１）醋酐－濃硫酸反應(yīng)：Liebermann-Burchard反應(yīng)

試劑：醋酐－濃硫酸（20：1）

樣品＋醋酐1ml—→沿壁加入濃硫酸（20ml)—→兩液層中間出現(xiàn)色環(huán)。

甾體皂苷：色環(huán)為藍(lán)色或藍(lán)綠色。陽性。三萜皂苷：色環(huán)為紅、粉紅或紫色。陽性。

主要用于化學(xué)鑒別化學(xué)性質(zhì)（2）三氯醋酸反應(yīng)：Rosen-Heimer反應(yīng)

試劑：25％三氯醋酸氯仿溶液樣品液＋濾紙上—→滴三氯醋酸試劑—△—→觀察△→60℃觀察斑點(diǎn)：→紅色…→紫色斑點(diǎn)甾體皂苷陽性△→100℃觀察斑點(diǎn)：→紅色…→紫色斑點(diǎn)三萜皂苷陽性用于化學(xué)及色譜鑒別的顯色劑化學(xué)性質(zhì)（３）五氯化銻反應(yīng)：Kahlenberg反應(yīng)

試劑：20％五氯化銻氯仿溶液樣品氯仿液＋五氯化銻氯仿液—→氯仿液呈紫藍(lán)色。用于化學(xué)及色譜鑒別的顯色劑黃芪甲苷光譜特征光譜特征甘草酸/甘草皂苷/甘草甜素遠(yuǎn)志皂苷三、皂苷類的定性鑒別：皂苷類的定性鑒別較常用的有泡沫反應(yīng)鑒別化學(xué)顯色反應(yīng)鑒別

薄層色譜鑒別：中藥制劑鑒別應(yīng)用準(zhǔn)確率較高中藥材成分鑒別泡沫反應(yīng)鑒別：

中藥粉末１g＋水10ml—△→濾液→強(qiáng)烈振搖

—→泡沫15min以上不退

陽性。

濾液＋0.1mol/LHCl5ml—→強(qiáng)烈振搖—→……＋0.1mol/LNaOH5ml－→強(qiáng)烈振搖—→…若兩管泡沫高度相同，則含三萜皂苷；若堿管較酸管泡沫高數(shù)倍，則含甾體皂苷。

（當(dāng)中藥制劑中皂苷含量較高時(shí)，可參考此法鑒別。但需注意排除干擾、空白對照。）化學(xué)顯色反應(yīng)鑒別：例復(fù)方丹參片處方：丹參浸膏、三七、冰片。

其中三七皂苷的鑒別可用顯色法樣品５片＋水洗滌去糖衣—→研細(xì)＋無水乙醇10ml—→振蕩提取→濾過→濾液５ml蒸干＋五氯化銻氯仿飽和液—→顯紫藍(lán)色注：此類顯色反應(yīng)在中藥制劑分析中，因組分多，干擾大，應(yīng)用較少。薄層色譜鑒別因皂苷類成分大多無明顯的紫外吸收，故經(jīng)薄層分后，用適當(dāng)?shù)娘@色劑顯色，是皂苷各組分定性鑒別最常用的方法。

陽性對照：可用被檢測的皂苷類成分對照品或?qū)φ账幉?。薄層板：常用硅膠或氧化鋁

展開劑：其配比可根據(jù)需要加以調(diào)整。薄層色譜鑒別皂苷：極性較大，一般用分配層析效果好展開劑極性要較大---親水性強(qiáng)適合的展開劑：CHCl3-CH3OH-H2O(10℃以下放置，13:7:2下層),水飽和C4H9OH，CHCl3-CH3OH(7:3),C4H9OH-EtOAC-H2O(4:1:5),EtOAC-吡啶-H2O(3:1:3),CHCl3-C2H5OH(7:3)等。

薄層色譜鑒別皂苷元：極性較小，親脂性強(qiáng)，吸附、分配薄層均可。用硅膠為吸附劑，則要求展開劑的親脂性強(qiáng)。適合于皂苷元常用展開劑有：環(huán)已烷-EtOAC(1:1),C6H6-EtOAC(1:1),CHCl3-EtOAC(1:1),CHCl3-EtOEt(1:1),C6H6-EtOH(17:3)。常用的顯色劑①25％磷鉬酸乙醇液：噴后140℃,△5～10min,皂苷元紫藍(lán)色。5％磷鉬酸乙醇液：噴后105℃,△5～10min，皂苷元紫藍(lán)色②、三氯化銻的濃鹽酸或氯仿液:噴后90℃,△10min，各皂苷元呈不同顏色。③、硫酸-甲醇液(1:1):噴后△，顯紅褐、紫、黃或黑色。與加熱溫度有關(guān)。缺點(diǎn)是腐蝕性強(qiáng),其他物質(zhì)也顯色。④、氯磺酸-乙酸(1:２)溶液:噴后130℃,△５min，各皂苷元呈不同顏色。如天藍(lán)、粉紅等,且在紫外光下也呈不同螢光，較靈敏（可檢出１０－１～１０－３ug）,可用于鑒別和定量。⑤、碘蒸汽:靈敏度約為１～２ug，優(yōu)點(diǎn)碘易揮發(fā)，顯色后揮去碘，斑點(diǎn)可作定量分析。常用于確定斑點(diǎn)的位置。缺點(diǎn)專屬性不強(qiáng).。常用的顯色劑10％硫酸乙醇溶液：最常用的顯色劑配制方法：取10ml硫酸,用乙醇稀釋至100ml特點(diǎn)：與加熱溫度有關(guān)；腐蝕性強(qiáng)；其他成分也可顯色薄層色譜1.

薄層板的制備：吸附劑的選擇

2.供試液制備（掌握）:溶解性/對照物溶液的制備3.

展開劑的選擇：與被測物結(jié)構(gòu)的極性大小、溶解度以及吸附劑的活度密切相關(guān)4.點(diǎn)樣5.展開6.晾干、顯色7.斑點(diǎn)的檢視、薄層鑒別的判斷、或定量8.薄層板的記錄四、皂苷類的定量分析

總皂苷測定：醇提水飽和正丁醇萃取或大孔樹脂吸附洗脫測定-常用重量法、比色法

皂苷元測定：總皂苷酸解苷元測定——比色法、薄層色譜法、高效液相色譜法

單體皂苷測定：薄層色譜法、高效液相色譜法但在中藥制劑中如無特殊原因，應(yīng)盡量避免將藥品水解后測定水解產(chǎn)物，因?yàn)槿绱藴y定已不能客觀反應(yīng)藥品自身的質(zhì)量，更無法進(jìn)行穩(wěn)定性考察總皂苷測定重量法：根據(jù)皂苷類成分的溶解性進(jìn)行提取、分離及純化后得到總皂苷，恒重、稱量，并計(jì)算樣品中總皂苷含量。一般少用，主要用于含皂苷的原料藥質(zhì)量控制。如甘草浸膏中甘草酸含量測定比色法一般指供試品連續(xù)兩次干燥或熾灼后的重量差異在0.3mg以下的重量總皂苷測定比色法：利用皂苷能與某些試劑反應(yīng)后產(chǎn)生顏色，然后于可見光區(qū)進(jìn)行比色測定。顯色后能在紫外光區(qū)產(chǎn)生吸收，用UV測定專屬性差，但反應(yīng)靈敏、方法簡便、易行常用的顯色試劑測定總皂苷、總皂苷元的含量時(shí)，可用單體皂苷或皂苷元作對照常用的皂苷顯色劑①濃硫酸測定甾體皂苷的通用試劑。甾體皂苷常顯黃色(80～90℃反應(yīng)30～60min）。②高氯酸測定具△5的苷元,因△5不飽和結(jié)構(gòu)與高氯酸在室溫下即可生成黃色。如：薯蕷皂苷元，10’、410nm、30’內(nèi)穩(wěn)定,25～200ug符合比爾定律.③濃硫酸－醋酐、硫酸－醋酐－冰醋酸、硫酸－冰醋酸試劑：主用于檢測甾體皂苷。如：人參總皂苷,60℃、25min,520nm測定.甘草次酸在529nm測定.④芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸主用干檢測三萜皂苷，甾體皂苷也可用。需注意控制反應(yīng)條件.⑤其他試劑：如亞甲藍(lán)與甘草酸結(jié)合物，640nm比色。2,6-二丁基對甲酚與甘草酸呈色,575nm比色。復(fù)方丹參片中三七皂苷的含量測定——大孔樹脂分離－比色法復(fù)方丹參片05版藥典：HPLC法測定丹參酮IIA，丹參酚酸B大孔樹脂：大孔樹脂規(guī)格的選擇：1.大孔樹脂性質(zhì)與吸附物質(zhì)的性質(zhì)遵循相似性相吸的原則。極性較大的化合物一般適合在中等極性以上性質(zhì)的大孔樹脂上分離，極性小的化合物適合在非極性的大孔樹脂上分離。比如用大孔樹脂分離銀杏黃酮S-8極性：吸附量126.7mg/gAD-8弱極性：吸附量102.8mg/gH-107非極性：吸附量47.7mg/g銀杏黃酮具有多酚結(jié)構(gòu)和糖苷鏈，具有一定吸附和親水性，有利于弱極性和極性大孔樹脂吸附大孔樹脂規(guī)格的選擇：2.被吸附物質(zhì)分子的大小和樹脂孔徑的關(guān)系。大孔樹脂的吸附量大小受樹脂極性和骨架結(jié)構(gòu)影響外，還受到樹脂空間結(jié)構(gòu)的影響。樹脂吸附過程中，樹脂內(nèi)部孔徑是被吸附物質(zhì)擴(kuò)散的路徑，在比表面積一定的情況下，適當(dāng)增加樹脂孔徑，亦會增大被吸附物質(zhì)的擴(kuò)散速度，有利于達(dá)到吸附和解析平衡比如不同規(guī)格的大孔樹脂對大豆皂苷的分離聚苯乙烯型大孔吸附樹脂ZTC-1（孔徑13-30nm）和X-5（孔徑29-30nm）吸附量大，ZTC-1：吸附量大、解析容易、吸附速度快X-5：解析率較高，但吸附容量偏低影響大孔樹脂分離純化效果的因素1.被吸附物質(zhì)溶液的ph值：由于PH值影響有效成分的解離度，從而影響到有效成分被大孔樹脂吸附的難易程度。一般情況下，酸性物質(zhì)易在適當(dāng)酸性溶液中被吸附，堿性物質(zhì)在適當(dāng)堿性溶液中易被吸附，中性物質(zhì)可在接近中性條件下被吸附。2.被吸附物的上樣濃度：一般被吸附物濃度增加吸附量也隨之增加，但被吸附物濃度增加有一定的限度，不能超過大孔樹脂的吸附容量。影響大孔樹脂分離純化效果的因素3.上柱溫度和無機(jī)鹽濃度：由于吸附過程是一個(gè)放熱的過程，溫度過高會影響吸附效果，室溫對吸附性能影響不大，柱溫超過50℃時(shí)，吸附量明顯下降4.樹脂柱的徑高比：樹脂柱內(nèi)徑與柱高的比例也是影響樹脂吸附效果的因素之一，合理的徑高比可為分離提供較高的柱效，更有利于大孔吸附樹脂對中草藥有效成分的吸附與分離。影響大孔樹脂分離純化效果的因素5.吸附流速：吸附流