醫(yī)學(xué)精品課件：20111160-分子生物學(xué)訂正

2簡(jiǎn)述第二代測(cè)序技術(shù)的原理和應(yīng)用。第二代測(cè)序技術(shù)即焦磷酸測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，操作極為簡(jiǎn)便。其原理為：第1步：1個(gè)特異性的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)；第2步：向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3’末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)；第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比；第4步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。第5步：加入另一種dNTP，使第2－4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。簡(jiǎn)述乳糖操縱元的基本調(diào)控方式。正調(diào)控和負(fù)調(diào)控是原核生物轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的兩種主要方式，大腸桿菌體內(nèi)存在多種操縱子，各種操縱子都是通過正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子進(jìn)行復(fù)合調(diào)控，如大腸桿菌的乳糖操縱子是在阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)控和代謝物基因激活蛋白CAP的正性調(diào)控下進(jìn)行的：阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)控：乳糖操縱子有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因Z、Y、A，分別編碼β-半乳糖苷酶、透酶、β-半乳糖苷乙?；?，結(jié)構(gòu)基因上游有一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)操縱元件。在啟動(dòng)子上游有一個(gè)CAP結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子、操縱元件、CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成了乳糖操縱子的調(diào)控區(qū)。I基因是調(diào)節(jié)基因，編碼阻遏蛋白。阻遏蛋白以四聚體形式與操縱元件結(jié)合，從而抑制RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，最終抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。但偶有阻遏蛋白與操縱元件解聚，使得每個(gè)細(xì)胞中會(huì)有很少的β-半乳糖苷酶和透酶產(chǎn)生，即本底表達(dá)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，乳糖經(jīng)透酶進(jìn)入細(xì)胞，在β-半乳糖苷酶是催化下生成半乳糖，半乳糖作為誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合繼而解除其對(duì)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。2）代謝物基因激活蛋白CAP的正性調(diào)控：由于乳糖操縱子的lac啟動(dòng)子是弱啟動(dòng)子，RNA聚合酶與其結(jié)合的能力較弱，只有CAP結(jié)合到啟動(dòng)子上游的CAP結(jié)合位點(diǎn)后，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，從而有效激活轉(zhuǎn)錄，該過程即為CAP對(duì)乳糖操縱子的正性調(diào)控作用。正、負(fù)調(diào)控的相對(duì)性：由于大腸桿菌存在兩種調(diào)控機(jī)制，乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄起始由阻遏蛋白和CAP共同作用產(chǎn)生，二者因葡萄糖和乳糖的存在與否發(fā)生如下幾個(gè)方面的相對(duì)性調(diào)控：葡萄糖和乳糖都存在：乳糖的存在解除了阻遏蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制作用。葡萄糖的存在使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低，cAMP-CAP復(fù)合物不能形成而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄不能進(jìn)行，基因處于關(guān)閉狀態(tài)。葡萄糖存在、乳糖不存在：無(wú)誘導(dǎo)劑存在，阻遏蛋白與DNA結(jié)合阻遏基因轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，由于葡萄糖的存在，CAP也不能發(fā)揮正調(diào)控作用，基因處于關(guān)閉狀態(tài)。葡萄糖和乳糖都不存在：雖然沒有葡萄糖的存在時(shí)CAP發(fā)揮正調(diào)控作用，但由于無(wú)誘導(dǎo)劑的存在，阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控作用依然是基因處于關(guān)閉狀態(tài)。葡萄糖不存在、乳糖存在：此時(shí)CAP發(fā)揮正調(diào)控作用，同時(shí)由于誘導(dǎo)劑的存在，阻遏蛋白失去負(fù)調(diào)控作用，基因被打開，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。16.簡(jiǎn)述原核生物基因轉(zhuǎn)錄過程并舉例說明抗生素的原理。原核生物基因轉(zhuǎn)錄過程包括：模板識(shí)別，轉(zhuǎn)錄起始，轉(zhuǎn)錄延伸和轉(zhuǎn)錄終止四個(gè)過程。模板識(shí)別階段：RNA聚合酶與啟動(dòng)子相互作用，使啟動(dòng)子附近的DNA雙鏈分開形成轉(zhuǎn)錄泡；轉(zhuǎn)錄起始：轉(zhuǎn)錄泡促使底物dNTP與模板DNA的堿基配對(duì)，合成RNA鏈上的核苷酸；轉(zhuǎn)錄延伸：當(dāng)合成了的RNA鏈上的9個(gè)核苷酸時(shí)，RNA聚合酶離開啟動(dòng)子沿著DNA鏈移動(dòng)并使新生的RNA鏈不斷延伸；轉(zhuǎn)錄終止：當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，RNA聚合酶和RNA鏈都從模板上釋放出來而終止轉(zhuǎn)錄?？股刈饔迷恚阂种萍?xì)胞壁的形成，如青霉素，主要是抑制細(xì)胞壁中肽聚糖的合成。多氧霉素（一種效果很好的殺真菌劑）主要作用是抑制真攻細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的合成；影響細(xì)胞膜的功能，如多粘菌至少與細(xì)胞結(jié)合，作用于脂多糖、脂蛋白，因此對(duì)革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的殺菌作用，制霉菌素與真菌細(xì)胞膜中的類固醇結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)；干擾蛋白質(zhì)的合成，通過抑制蛋白質(zhì)生物合成抑制微生物生長(zhǎng)的抗生素較多，如卡那霉素、鏈霉素等；阻礙核酸的合成，主要通過抑制DNA或RNA的合成，抑制微生物的生長(zhǎng)，例如利福霉素、博萊霉素等。17,簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控。自體調(diào)控與組蛋白密碼不是一個(gè)概念翻譯過程中的自體調(diào)控。1.阻抑蛋白對(duì)翻譯起始的調(diào)控。阻抑蛋白通過與mRNA的特定區(qū)域結(jié)合，抑制核糖體對(duì)翻譯起始區(qū)的識(shí)別。這種調(diào)控最常見的形式是，調(diào)控蛋白與含有起始密碼子AUG的序列直接結(jié)合，從而阻止核糖體的結(jié)合。2.mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯的調(diào)控。翻譯一個(gè)順反子需要二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，而這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變又依賴于前一個(gè)順反子的翻譯。第一個(gè)順反子的翻譯破壞原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使核糖體能夠與下一個(gè)順反子的翻譯起始區(qū)域結(jié)合。3.基因表達(dá)裝置蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控。一種蛋白質(zhì)或RNA調(diào)控其自身的表達(dá)，即為自體調(diào)控。細(xì)菌編碼核糖體蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)合成因子和RNA聚合酶亞基等蛋白質(zhì)的基因混合組成幾個(gè)操縱子。每個(gè)操縱子都含有數(shù)個(gè)基因。這些操縱子的表達(dá)都受操縱子自身的一些基因產(chǎn)物的調(diào)控。操縱子自身編碼的蛋白質(zhì)的富集會(huì)抑制其自身及一些相關(guān)基因產(chǎn)物的進(jìn)一步合成。12簡(jiǎn)述TAP-MS技術(shù)原理及應(yīng)用。（本題不參與考試，感興趣的可以看下）串聯(lián)親和純化技術(shù)(tandemafinitypurification，TAP)是近年來發(fā)展的一種能夠快速研究生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)相互作用、揭示蛋白質(zhì)復(fù)合體相互作用網(wǎng)絡(luò)的新技術(shù)，如今已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)被廣泛采納的工具。此技術(shù)使用特別設(shè)計(jì)的純化標(biāo)簽在非常接近于生理?xiàng)l件的情況下，能捕捉出特定的蛋白質(zhì)及其作用伙伴，借助于質(zhì)譜分析技術(shù)，研究人員即可鑒別出這種蛋白質(zhì)相互作用組。標(biāo)簽共分3部分：蛋白A、鈣調(diào)素結(jié)合多肽(calmodulinbindingpeptide。CBP)和中間連接的煙草病毒(TEV)蛋白酶識(shí)別的酶切位點(diǎn)。

帶有TAP標(biāo)簽的融合蛋白在細(xì)胞中表達(dá)，且與內(nèi)源相互作用蛋白形成復(fù)合物，細(xì)胞裂解后經(jīng)IsG偶聯(lián)的層析柱純化，蛋白A與IgG特異結(jié)合，從而使含有標(biāo)簽的復(fù)合物得到第一次純化。為除去與柱填料非特異結(jié)合的蛋白，用TEv酶切割分離蛋白A標(biāo)簽，使含有靶蛋白的復(fù)合物與層析柱分離，并經(jīng)過鈣調(diào)素偶聯(lián)的親和層析柱進(jìn)行第二次純化，靶蛋白上的CBP標(biāo)簽可與鈣調(diào)素結(jié)合；在加入過量螯合劑后CBP與親和層析柱分離使含有靶蛋白的復(fù)合體得到分離純化，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS．PAGE)，復(fù)合物中的各個(gè)蛋白被分開，切膠、胰酶消化后，即可通過質(zhì)譜鑒定復(fù)合物中各個(gè)蛋白的氨基酸序列。該方法的優(yōu)點(diǎn)：(1)不需要過多的背景知識(shí)就可以得到大量含靶蛋白的復(fù)合體。(2)蛋白表達(dá)及與復(fù)合物的結(jié)合都接近生理水平。是一種檢測(cè)體內(nèi)蛋白相互作用的方法。(3)TAP采用兩步親和純化，提高了純化產(chǎn)物的特異性。Omics是一個(gè)相對(duì)較大的概念，指從整體