第二章基因工程制藥

BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥基因工程制藥GeneEngineeringforPharmaceutics

（五）BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥1.簡述大腸桿菌基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。2.基因工程藥物分離純化的一般流程。3.分離純化目的產(chǎn)物的四類色譜分離技術(shù)的原理及選擇原則。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥第七節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制一、原材料的質(zhì)量控制

確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥一、原材料的質(zhì)量控制（1）明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶圖譜和核苷酸序列等予以確證；（2）提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分（如啟動子、復(fù)制子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)志物；BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（3）提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性；（4）闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體內(nèi)及在其中的拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；一、原材料的質(zhì)量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（5）提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟動與控制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。一、原材料的質(zhì)量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（1）生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫；（2）原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計使用期，保存與復(fù)蘇時宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性；二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（3）對生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；（4）提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)；二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（5）培養(yǎng)過程中，應(yīng)測定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；以宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品；二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（6）培養(yǎng)周期結(jié)束時，應(yīng)檢測宿主宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥三、純化工藝中的質(zhì)量控制1、產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱原質(zhì)都控制在規(guī)定限度以下。

2、在精制過程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核算、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測方法。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制

電泳方法：SDS,等電聚焦，免疫電泳免疫學(xué)方法：RIA,RIDELISA,Immunoblotting

受體結(jié)合實驗（ReceptorBinding）各種高效液相分析法（HPLC）肽圖分析法

EdmanN末端序列分析法圓二色譜（CD）

NMR1、產(chǎn)品的鑒別表3重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品常用的鑒別方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（1）肽圖分析法（2）氨基酸成分分析（3）部分氨基酸序列分析：N-端15個氨基酸（4）重組蛋白質(zhì)的濃度測定和相對分子質(zhì)量測定（5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析1、產(chǎn)品的鑒別BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥2、純度分析（1）目的蛋白質(zhì)含量測定（2）雜質(zhì)：分蛋白類雜質(zhì)和非蛋白類雜質(zhì)。3、生物化學(xué)測定4、穩(wěn)定性考察5、產(chǎn)品一致性的保證1、產(chǎn)品的鑒別BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥

雜質(zhì)和污染物檢測方法

內(nèi)毒素鱟試劑、家兔熱源法宿主細(xì)胞蛋白免疫分析、SD、CE

其他蛋白雜質(zhì)（如培養(yǎng)基）SDS、HPLC、CE、免疫分析殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE

甲?；琢虬彼犭淖V、HPLC、IEF、CE表4基因工程產(chǎn)物中常見雜質(zhì)和污染物及其檢測方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥

甲硫氨酸氧化肽譜、氨基酸分析、HPLC、質(zhì)譜、Edman分析產(chǎn)物變性或聚合脫氨基SDS、凝膠排阻色譜、

IEF、HPLC、

Edman分析、CE

親和配基脫落SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽譜、CE、

Edman分析、質(zhì)譜微生物（細(xì)菌、酵母、真菌）微生物學(xué)檢查支原體微生物學(xué)檢查病毒微生物學(xué)檢查表4基因工程產(chǎn)物中常見雜質(zhì)和污染物及其檢測方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥五、產(chǎn)品的保存⒈液態(tài)保存

⑴低溫保存：液態(tài)蛋白質(zhì)樣品在-10~-20℃以下冰凍保存。

⑵在穩(wěn)定pH下保存：蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的pH一般在等電點，且多數(shù)蛋白質(zhì)只有在很窄的pH范圍內(nèi)才穩(wěn)定。因此對保存液態(tài)蛋白質(zhì)樣品時小心調(diào)到其穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)。

⑶高濃度保存：一般蛋白質(zhì)在高濃度時比較穩(wěn)定，因為液態(tài)蛋白質(zhì)容易受水化作用的影響，濃度太低易引起亞基解離和表面變性。

⑷加保護(hù)劑保存：2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、多元醇、有機(jī)溶劑等。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥五、產(chǎn)品的保存⒉固態(tài)保存（干粉或結(jié)晶）長期保存蛋白質(zhì)的最好方法是制成干粉或結(jié)晶。在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將干燥的樣品置于干燥器中在（內(nèi)裝有干燥劑），保存在0~4℃冰箱即可。為了取樣方便和避免取樣時吸潮和被污染，可先將樣品分裝成小瓶，每次用時只取出一小瓶。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥基因工程藥物制造實例Question1：生物藥物按功能用途分哪幾類？本實例為熒光免疫親和試劑。Question2：在微生物學(xué)中，SPA指的是什么？有什么生物學(xué)特性？Question3：用作基因表達(dá)的微生物宿主細(xì)胞有哪些？本實例既是利用基因工程技術(shù)，將SPA與綠色熒光蛋白基因重組，利用E.coli表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)該融合蛋白。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥Vector:BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥TargetgeneQuestion4：怎樣獲得目的基因？PCR方式獲得BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥陽性克隆的篩選BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥目的蛋白的分離純化Question5：你了解哪些關(guān)于基因工程藥物的分離純化方法？BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥思考題1.對由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品進(jìn)行鑒定時，常做哪些項目分析？2.生物技術(shù)產(chǎn)品如何保存?Biote